Summary
Rispetto alla cromatografia di affinità tradizionale che utilizza colonne piene di perline di agarosio A, gli adsorbenti a membrana A proteici possono accelerare significativamente l'isolamento su scala di laboratorio degli anticorpi e di altre proteine che esprimono frammenti Fc. Metodi di analisi e quantificazione appropriati possono accelerare ulteriormente l'elaborazione delle proteine, consentendo di completare l'isolamento / caratterizzazione in un giorno lavorativo, anziché oltre 20 ore lavorative.
Abstract
La purificazione su scala industriale su scala industriale delle biomolecole dai supernanti di coltura cellulare e dalle soluzioni cellulari liscivie può essere effettuata utilizzando la cromatografia di affinità. Mentre la cromatografia di affinità che utilizza proteine porose A agarose perline imballate in colonne è probabilmente il metodo più comune di isolamento in scala di laboratorio di anticorpi e proteine ricombinanti che esprimono frammenti fc di IgG, può essere un processo dispendioso in termini di tempo e costoso. I vincoli di tempo e finanziari sono particolarmente scoraggianti nei piccoli laboratori scientifici di base che devono recuperare centinaia di microgrammi a quantità di proteine milligrammi da soluzioni diluite, ma non hanno accesso a sistemi di erogazione di liquidi ad alta pressione e / o personale con esperienza in bioseparazioni. Inoltre, la quantificazione e la caratterizzazione dei prodotti possono anche allungare eccessivamente il tempo di lavorazione per diversi giorni lavorativi e gonfiare le spese (materiali di consumo, salari, ecc.). Pertanto, è necessario un protocollo veloce, economico ma efficace per l'isolamento su scala di laboratorio e la caratterizzazione di anticorpi e altre proteine in possesso di un frammento Fc. A tal fine, abbiamo ideato un protocollo che può essere completato da personale tecnico a esperienza limitata in meno di 9 ore (circa un giorno lavorativo) e fino a 4 ore, rispetto ai metodi tradizionali che richiedono oltre 20 ore lavorative. La maggior parte delle attrezzature richieste è prontamente disponibile nei laboratori standard di scienze biomediche, biochimiche e (bio)ingegneria chimica, e tutti i reagenti sono disponibili in commercio. Per dimostrare questo protocollo, vengono presentati risultati rappresentativi in cui la galettanina murina chimerica-1 fusa all'Fc umano (Gal-1hFc) dal supernatante di coltura cellulare è stata isolata usando una proteina A adsorbente di membrana. Il Gal-1hFc purificato è stato quantificato utilizzando una procedura accelerata di analisi western blotting e caratterizzato utilizzando citometria a flusso. Il flusso di lavoro semplificato può essere modificato per altre proteine che esprimono Fc, come gli anticorpi, e /o alterato per incorporare metodi alternativi di quantificazione e caratterizzazione.
Introduction
L'isolamento di anticorpi e proteine ricombinanti che esprimono frammenti di immunoglobulina G (IgG) Fc dai supernatanti di coltura cellulare e dalle soluzioni cellulari diluite può essere realizzato utilizzando la cromatografia di affinità proteinA A. Nei laboratori e nell'industria scientifica e ingegneristica di base, le colonne piene di proteina porosa A agarosio, vetro o perline polimeriche sono più comunemente utilizzate per la cromatografia di affinità, nonostante gli elevati costi finanziari e i lunghi tempi dilavorazione 1-3. È molto apprezzato che la cromatografia di affinità rappresenti il più grande collo di bottiglia di spesa e lavorazione sia in laboratorio che in ambienteindustriale 2,4. Di conseguenza, sono stati sviluppati numerosi miglioramenti per ridurre i costi e i tempi di elaborazione senza sacrificare il recupero complessivo delprodotto dal treno di processo 1,2,5-7. Particolarmente promettente per l'isolamento di anticorpi e altre proteine che esprimono Fc è la cromatografia di affinità utilizzando una proteina A membrane adsorber2,5,7-10. Mentre la cattura fc nella cromatografia a colonna è limitata dalladiffusione (cioè la proteina che esprime fc deve diffondersi nei pori interni e attraverso di esso per raggiungere la maggior parte della proteina A) con caduta di alta pressione attraverso la colonna, il trasporto di massa negli adsorbenti a membrana è guidato dalla convezione alla rinfusa, con conseguente evitare limitazioni didiffusione 8,9,11,12. Inoltre, la caduta di pressione attraverso l'adsorbente a membrana è bassa, consentendo così portate di perfusione più elevate rispetto alle colonne imballate perline8,9,11,12. Pertanto, per l'isolamento su scala di laboratorio, si prevede che la cromatografia a membrana riduca i tempi di isolamento di diverse ore e aumenti la cattura del prodotto rispetto alla cromatografia a colonna. Inoltre, sono stati proposti modelli matematici per l'adsorbimento IgG negli adsorbenti a membrana8,9,11,12, consentendo così agli utenti finali di prevedere le prestazioni in laboratorio.
Un altro collo di bottiglia nei laboratori di scienze e ingegneria di base è la caratterizzazione della proteina che esprime fc. Tuttavia, la selezione di metodi appropriati per completare i test di caratterizzazione, come le macchie occidentali, può ridurre notevolmente il tempo dedicato ai test dei prodotti. Ad esempio, il trasferimento semidry in un sistema tampone discontinuo può realizzare il trasferimento elettroforetico di proteine da un gel SDS-PAGE a una membrana di polivinile difluoridina (PVDF) in pochi minuti, rispetto a 1-2 ore di trasferimento di serbatoio (bagnato) in un sistema tampone continuo13.
Un protocollo rapido, economico ed efficace per isolare e caratterizzare una proteina di fusione chimerica che esprime un frammento Fc di IgG umano è descritto nel presente documento. La maggior parte delle apparecchiature è prontamente disponibile nei laboratori standard di scienze biomediche di base, biologia, chimica e (bio)ingegneria chimica, e tutti i reagenti sono disponibili in commercio. Sebbene siano stati generati risultati rappresentativi dall'isolamento e dalla caratterizzazione di una proteina di fusione chimerica Fc murina-1/umana (Gal-1hFc), il protocollo semplificato può essere applicato all'isolamento di altre molecole che possiedono un frammento Fc, come anticorpi, frammenti Fc stessi o altre proteine di fusione Fc. I nostri miglioramenti hanno ridotto drasticamente i tempi di elaborazione (fino a 4 ore ma più in genere ~ 9 ore, rispetto a oltre 20 ore lavorative) ottenendo al contempo un recupero del prodotto simile o migliorato rispetto ai metodi standard.
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Protocol
1. Verificare l'affinità per le proteine A
- Verificare che la proteina che esprime fc (proteina di fusione ricombinante o anticorpo IgG, finora denominata "proteina") abbia un'affinità accettabile per la proteina A14-17 prima di utilizzare l'adsorbente della membrana A della proteina E e verificare la presenza della proteina nella soluzione stock(ad esempio, supernatante di coltura cellulare chiarificato dalla centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti a cellule sospese a pellet). Utilizzare citometria a flusso, western blotting, ELISA, ecc. per rilevare la funzione proteica e/o la presenza di Fc, in base alle preferenze di laboratorio. Idealmente, quantificare la proteina nel supernatante di coltura cellulare (fase 6) per evitare di superare la capacità di adsorbente della membrana A della proteina. Procedere se viene rilevata una proteina.
2. Preparare proteine A membrana adsorbente e coltura cellulare supernatante
- Seguire le istruzioni del produttore per preparare l'adsorbente a membrana. Non lasciare mai che l'aria entri nell'adsorbente della membrana. Tutte le soluzioni perfuse attraverso l'adsorbente a membrana devono essere a temperatura ambiente e prefiltrate utilizzando un filtro da 0,22 μm. Riempire una siringa da 10 ml con la salina tamponata al fosfato (DPBS) filtrata da Dulbecco filtrata da 0,22 μm o tampone di scelta e scarico delle bolle d'aria. Perfondere DPBS per rimuovere la soluzione di archiviazione e equilibrare l'adsorbente a membrana immediatamente prima dell'uso.
- Filtrare il supernatante di coltura cellulare immediatamente prima della perfusione attraverso l'adsorbente a membrana, utilizzando un'unità di filtrazione sterile aspirata da 0,22 μm.
3. Caricare la proteina A Membrane Adsorber
- Aspirare il supernatante di coltura cellulare in una siringa Luer Lock (30 ml o più) e scaricare eventuali bolle d'aria.
- Assemblate materiali e attrezzature, come illustrato nella figura 1. Collegare la siringa all'ingresso dell'adsorbente della membrana. Collegare tubi flessibili all'uscita dell'adsorbente a membrana. Se lo si desidera, posizionare un filtro siringa da 0,22 μm tra la siringa e l'adsorbente a membrana. Utilizzare un pallone o una bottiglia per catturare il flusso attraverso (noto anche come filtrato), dall'adsorbente.
- Impostare la pompa della siringa sulla portata volumetrica desiderata, ma non superare la portata raccomandata dalproduttore (ad esempio 10 ml/min). Perfondere il supernatante della coltura cellulare attraverso l'adsorbente a membrana, raccogliendo il flusso attraverso un becher o un altro contenitore. Ricaricare la siringa con i supernatanti necessari.
- Se lo si desidera, testare il flusso attraverso per la presenza di proteine utilizzando citometria di flusso, western blotting, ELISA, ecc. in base alle preferenze di laboratorio. In genere non è necessario riperperperare il flusso attraverso.
4. Proteina Elute dall'adsorbente di membrana
- Lavare l'adsorbente a membrana con 10 ml di DPBS per rimuovere eventuali proteine non abbollate.
- Elute proteina dall'adsorbente di membrana alla portata desiderata(ad esempio 1 ml/min) utilizzando 10-15 ml di tampone di eluizione(ad esempio tampone di eluizione a base di ammina (pH 2,8)). Catturare l'eluato in un tubo contenentetampone neutralizzante (ad esempio 1 M Tris (pH 9,4)) al 10% del volume di eluizione (1,0-1,5 ml).
- In alternativa, la proteina eluta in un ml si trasforma in tubi contenenti 100 μl di tampone di neutralizzazione, utilizzando un volume totale di tampone di eluizione da 10-15 ml. Utilizzare il metodo di caratterizzazione preferito per testare ogni frazione per la presenza di proteine.
- Rigenerare l'adsorbente a membrana secondo le istruzioni del produttore. Perfondere 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm o tampone di scelta, quindi 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm in 50 mM naoh in 1 N NaCl e infine 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm. Riempire l'adsorbente a membrana con il 20% di etanolo in DPBS per la conservazione a lungo termine a 4 ºC.
5. Concentrare e dializzare la proteina
- Depositare tutti gli eluati (o frazioni di eluizione contenenti proteine come determinato nella fase 4.3) in un'unità filtrante centrifuga cut-off a peso molecolare da 10 kDa. Seguire le istruzioni del produttore per la centrifugazione.
- Dializzare il ritensionato in un'unità di dialisi a piccolo volume (taglio del peso molecolare di 10 kDa) contro il tampone preferito, seguendo le istruzioni del produttore. Potrebbe essere necessario aggiungere un tampone al materiale dializzato se la precipitazione proteica è un problema. Se lo si desidera, il materiale dializzato può essere refrigerato fino a quando non è possibile eseguire il passaggio 6, ma non è consigliabile conservare a lungo termine senza conservanti.
6. Quantificare e caratterizzare il prodotto purificato in una procedura di blotting occidentale accelerata
- Risolvere gli standard di proteina purificata e Fc sul gel di scelta da parte di SDS-PAGE, in condizioni di riduzione o non riduzione comedesiderato 18-20. Utilizzare un mini gel anziché un gel midi per ridurre al minimo i tempi di esecuzione.
- Se non è già noto, determinare l'intervallo di standard Fc su quale segnale a banda varia linearmente rispetto alla quantità di carico(ad esempio 0,1-1 mg). Usa lo stesso gel, le condizioni di esecuzione, le condizioni di trasferimento e i reagenti che verranno utilizzati per quantificare e caratterizzare le proteine purificate.
- Caricare più quantità di campioni di proteine purificate, inclusi campioni diluiti con DPBS, per garantire che i segnali di banda proteica purificata si trovano all'interno dell'intervallo di segnale lineare degli standard Fc nell'analisi delle immagini.
- Trasferire le proteine dal gel a una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) in un sistema tampone discontinuo utilizzando un blotter semidry13, seguendo le istruzioni del produttore di blotter. Il tempo di trasferimento è in genere di 5-10 minuti. Se lo si desidera, Coomassie macchia il gel dopo il trasferimento per verificare l'efficienza deltrasferimento 21.
- Eseguire l'immunoblotting con anti-Fc o anti-IgG coniugato alla fosfatasi alcalina (AP) o alla perossidasi del ravanello del cavallo (HRP), in base alle preferenze di laboratorio, utilizzando un sistema di rilevamento delle proteine assistito dal vuoto. Il tempo di immunoblotting è in genere inferiore a 1 ora.
- Sviluppare immunoblot utilizzando il substrato e il metodo di scelta(ad esempio substrato AP e chemiluminescenza migliorata).
- Quantificare le proteine purificate mediante analisi delle immagini. Eseguire una regressione lineare sui segnali di banda dagli standard Fc. Se R2>0,90, utilizzare l'equazione per la linea per calcolare la quantità proteica dai suoi segnali di banda. Tenere conto della diluizione del campione, se necessario. Poiché la quantificazione della proteina viene eseguita sulla base di Fc, regolare il valore delle differenze di peso molecolare tra la proteina e Fc. Se R2<0,90, ripetere il passaggio 6 nella sua interezza.
- Convalidare proteine utilizzando saggi o metodi funzionali per rilevare Fc tramite citometria a flusso, western blotting, ELISA, ecc. in base alle preferenze di laboratorio.
- Diluire le proteine alla concentrazione desiderata e/o aggiungere eventuali conservanti o stabilizzanti desiderati alla soluzione proteica purificata prima di aliquota per la conservazione a lungo termine, congelata o meno.
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Representative Results
Il protocollo semplificato per l'isolamento e la caratterizzazione delle proteine che esprimono fc viene regolarmente utilizzato per elaborare la galettanina murina chimerica-1 fusa all'Fc umano (Gal-1hFc) dai supernanti di coltura cellulare diluita. Il diagramma di flusso nella figura 2 illustra il flusso di lavoro e l'ora di ogni passaggio del protocollo. Per un lotto tipico di 300 ml di supernatante, il tempo totale di lavorazione è di circa 9 ore quando viene eseguita la prova citometrica del flusso opzionale delle frazioni di eluizione. Se tutte le analisi della citometria del flusso vengono omesse, a causa della mancanza di un citometro di flusso o di una singola preferenza di laboratorio, il tempo totale di elaborazione può essere breve fino a 4 ore. In generale, il tempo di elaborazione dipende dall'esperienza dell'operatore, dalla quantità di supernatante elaborato e dai metodi di quantificazione e caratterizzazione eseguiti.
La citometria a flusso è stata utilizzata per testare la presenza di Gal-1hFcfunzionale (cioè Gal-1 in grado di rilevare i suoi ligandi sulle cellule tumorali del seno) nel supernatante di coltura cellulare iniziale; il mezzo di coltura cellulare fresco fungeva da controllonegativo 18,22 . Una volta verificato il Gal-1hFc nel supernatante di coltura cellulare(figura 3A),il caricamento dell'adsorbente a membrana A della proteina È stato effettuato per perfusione supernatante a 10 ml/min (con conseguente velocità superficiale o flusso volumetrico di 0,5 cm/min in un adsorbente a membrana da 2 ml) utilizzando una pompa per siringhe(figura 1). L'adsorbente a membrana ha catturato e mantenuto efficacemente Gal-1hFc, lasciando il flusso essenzialmente esaurito di Gal-1hFc (mancanza di sfondamento, Figura 3A). Gal-1hFc è stato eluito dall'adsorbente a membrana con incrementi di un millilitro a 1 ml/min (flusso volumetrico = 0,05 cm/min) utilizzando un tampone acido a base di ammina (pH 2,8) e le frazioni di eluizione neutralizzate sono state successivamente testate per la presenza di Gal-1hFc funzionale utilizzando citometria a flusso(figura 3B). Il segnale Gal-1hFc è aumentato in sequenza dall'eluizione 1 (approssimativamente uguale al controllo negativo) ad un massimo all'eluizione 3, quindi è sceso a un livello quasi costante alle eluizioni 9 e 10(figure 3B e 3C). L'eluizione finale 10 non ha raggiunto l'equivalenza al segnale di controllo negativo a causa di una certa ritenzione di adsorbente di Gal-1hFc (Figure 3B e 3C). Tuttavia, questa perdita è stata ritenuta accettabile. Come metodo alternativo per testare la presenza, ma non la funzione, di Gal-1hFc in varie soluzioni, è possibile utilizzare l'analisi citometrica del flusso della capacità di Gal-1hFc di legarsi alle perline di polistirolo proteina A (attraverso il riconoscimento della regione hFc)(Figura 3D).
A seguito di test delle frazioni di eluizione, le eluizioni positive da Gal-1hFc da 2 a 10 sono state concentrate e quindi dializzate contro DPBS per ottenere Gal-1hFc purificato nel buffer desiderato. La quantificazione e la caratterizzazione del Gal-1hFc purificato è stata eseguita in una procedura di soffiatura occidentale accelerata dal trasferimento semidry e dall'immunoblotting sottovuoto. Confrontando il segnale Gal-1hFc con gli standard di quantificazione hFc, sono state determinate sia la quantità che la qualità del materiale purificato(figure 4A-C). Le intensità del segnale delle bande standard hFc (una banda a ~25 kDa ciascuna nella figura 4A, corsie 1-5) erano linearmente correlate alla quantità di hFc presente(Figura 4C). Gal-1hFc (una banda a ~40 kDa nella Figura 4A, corsia 6) e gal-1hFc degradato (una banda a ~ 40 kDa e una banda a ~ 25 kDa nella Figura 4A, corsia 7) segnali erano all'interno dell'intervallo di standard(Figura 4A,corsie 1-5). La concentrazione di Gal-1hFc purificato(figura 4A, corsia 6) sulla base dell'hFc è stata determinata in 450 μg/ml mediante elaborazione delle immagini(figura 4C). Regolando il peso molecolare del Gal-1hFc, la concentrazione del materiale purificato era di 720 g/ml. Al contrario, troppo Gal-1hFc purificato è stato caricato nelle corsie 6 e 7 del Western nella figura 4B, che ha generato segnali che hanno saturo o superato l'intervallo di standard hFc, impedendo così la quantificazione. Alternativa all'assorbimento occidentale, la colorazione del gel Coomassie21 può servire come metodo di controllo rapido del controllo di qualità e/o quantificazione (Figura 4D). Si noti che una banda ~10 kDa, oltre alle bande ~25 kDa e ~40 kDa, era presente nel campione Gal-1hFc degradato(Figura 4D, corsia 2). Questa banda è degradata Gal-1hFc che non era reattiva con l'anticorpo di rilevamento utilizzato nelle macchie occidentali (figure 4A e 4B).
Dopo la quantificazione e la caratterizzazione finale del Gal-1hFc purificato, è stata aggiunta la BSA sterile per ottenere una concentrazione finale di BSA dello 0,5%. Il materiale purificato è stato quindi aliquoto e conservato a -20 ºC. Oltre a Gal-1hFc, abbiamo utilizzato questo protocollo semplificato per isolare il doppio mutante Gal-1hFc e Gal-7hFc. Può anche essere esteso praticamente a qualsiasi molecola che possieda un frammento fc (anticorpi, frammenti Fc stessi, altre proteine di fusione Fc, ecc.di specie e isotipi che hanno affinità per la proteina A14-17).
Figura 1. Schema dell'apparato sperimentale. Gli anticorpi e le proteine di fusione ricombinante che esprimono frammenti Fc di IgG possono essere isolati da soluzioni diluite utilizzando un adsorbente a membrana A proteica. L'adsorbente a membrana è collegato attraverso un raccordo di bloccaggio Luer a una siringa da 30 ml su una pompa per siringa, che perfonde la soluzione contenente proteine attraverso l'adsorbente a membrana a una portata volumetrica desiderata.
Figura 2. Flusso di lavoro di processo per l'isolamento di Gal-1hFc dal supernatante per la coltura cellulare. Questo diagramma di flusso illustra il protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di una galettanina murina chimerica-1/umana Fc-expressing proteina di fusione (Gal-1hFc) dal supernatante di coltura cellulare. In generale, il tempo di elaborazione varia a seconda dell'esperienza dell'operatore, della quantità di supernatante elaborato e dei metodi di quantificazione e caratterizzazione utilizzati.
Figura 3. Analisi della citometria del flusso delle soluzioni contenenti Gal-1hFc. La citometria del flusso viene utilizzata per valutare se gal-1hFc funzionale è presente nel mezzo di coltura cellulare fresco, nel supernatante della coltura cellulare, nel flusso dell'adsorbente di membrana e nelle frazioni di eluizione. L'Fc anti-umano F(ab')2 coniugato da APC è stato usato come anticorpo secondario. Tutti i dati sono stati acquisiti utilizzando un citometro/smistatore del flusso del prodotto facs Aria Special Order Research e analizzati utilizzando il software FlowJo. I marcatori in ogni istogramma rappresentano il 2% della popolazione di controllo negativo (cioè il mezzo di coltura cellulare fresco per (A) e l'isotipo hFc per (B)). (A) Sovrapposizione dell'istogramma citometrico a flusso delle cellule tumorali del seno BT-20 etichettate con mezzo di coltura cellulare fresco (rosso), supernatante per la coltura cellulare (blu) o flusso di adsorbente a membrana (verde). Il supernatante per la coltura cellulare conteneva un basso livello di Gal-1hFc funzionale che si legava con successo ai ligandi della galectin-1 sulle cellule BT-20, mentre il mezzo di coltura cellulare fresco e il flusso di adsorbente a membrana mancavano di Gal-1hFc, come previsto. (B) Istogrammi di citometria a flusso di cellule BT-20 etichettate con frazioni di eluizione dall'adsorbente a membrana. Il segnale Gal-1hFc sulle cellule BT-20 aumenta sequenzialmente fino a un massimo all'eluizione 4 quindi diminuisce, anche se non a livello di fondo(cioè segnale equivalente al mezzo di coltura cellulare fresco). (C) Le intensità media di fluorescenza dei campioni di cui alla letteraBpossono anche essere tracciate in funzione del numero di frazione di eluizione per generare una curva di eluizione. L'intensità media di fluorescenza delle cellule etichettate con controllo dell'isotipo hFc è indicata come linea di riferimento. (D) In alternativa, l'analisi citometrica del flusso di Gal-1hFc legata alla proteina A le perline di polistirolo possono essere utilizzate per testare la presenza proteica, ma non la funzione, in varie soluzioni. L'Fc anti-umano F(ab')2 coniugato da APC è stato usato come anticorpo secondario. A sinistra: sovrapposizione dell'istogramma citometrico del flusso del mezzo di coltura cellulare fresco (rosso), del supernatante per la coltura cellulare (blu) e del campione di buffer vuoto (verde). Centrale: Istogramma del controllo dell'isotipo hFc. L'incubazione con 10 mg/ml di hFc è un controllo positivo per la cattura delle proteine A. Pannello destro: Istogramma della proteina A perline incubate con Gal-1hFc purificato, sulla base di 10 mg hFc/ml. Clicca qui per vedere un'immagine più grande.
Figura 4. Quantificazione e caratterizzazione di Gal-1hFc utilizzando l'assorbimento occidentale e l'analisi delle immagini. (A) Le corsie 1-5 sono standard hFc di 0,1-0,5 μg in incrementi di 0,1 μg e le corsie 6 e 7 sono purificate Gal-1hFc da due diversi lotti di produzione. I campioni sono stati risolti su un gel TGX al 4-15% da SDS-PAGE in condizioni di riduzione, quindi trasferiti su membrana PVDF utilizzando condizioni di trasferimento discontinue. La membrana è stata bloccata e incubata con anti-hIgG-AP utilizzando una tecnica di immunoblotting assistita da vuoto. I segnali sono stati sviluppati con reagente ECL e visualizzati su un imager Bio-Rad ChemiDoc XRS. I segnali per gli standard hFc nelle corsie 1-5 variavano linearmente (tracciati in (C)), e i segnali per i due campioni gal-1hFc purificati nelle corsie 6 e 7 rientravano nell'intervallo di misurazione lineare. La corsia 7 mostra due bande, Gal-1hFc e presumibilmente frammento hFc, che indica la degradazione della proteina. (B) Se viene caricato un Gal-1hFc troppo purificato, il segnale può saturare o superare l'intervallo di segnale lineare, impedendo la quantificazione (corsie 6 e 7). Le corsie, il gel e le condizioni di corsa sono le stesse di in (A). (C) Il software di analisi Image Lab consente l'ingresso di quantità assolute note di standard hFc da un'immunoblot, quindi determina la quantità delle bande sconosciute attraverso il suo segnale rispetto alla regressione lineare degli standard (y = 1,36 x 10-7*x + 0,105; R2 = 0,95). I dati riportati provengono dall'analisi dell'immunoblot in (A). (D) La qualità del Gal-1hFc purificato può essere valutata utilizzando la colorazione Coomassie. La corsia M è un marcatore di peso molecolare, la corsia 1 è purificata Gal-1hFc (stesso campione della corsia 6 in (A) e (B)), la corsia 2 è degradata Gal-1hFc (stesso campione della corsia 7 in (A) e (B)), e la corsia 3 è standard 0,2 mg hFc. Il gel e le condizioni di esecuzione erano gli stessi di (A) e (B). Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
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Discussion
Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per isolare e caratterizzare rapidamente una proteina di fusione chimerica che esprime fc umano (Gal-1hFc), senza compromettere significativamente il recupero del prodotto o il costo di gonfiaggio. I componenti chiave del flusso di lavoro semplificato sono un adsorbente a membrana A proteico per l'isolamento e il trasferimento semidry e l'immunoblotting sottovuoto per la caratterizzazione da parte dell'assorbente occidentale.
La drastica diminuzione dei tempi di elaborazione per l'isolamento e la caratterizzazione del Gal-1hFc da 300 ml di supernatante di coltura cellulare (circa 9 ore nel protocollo semplificato rispetto alle oltre 20 ore di un protocollo tradizionale) è in gran parte attribuibile all'incorporazione dei suddetti componenti chiave, in particolare l'adsorbente a membrana. Alla portata massima raccomandata di 10 ml di supernatante/min, il caricamento dell'adsorbente a membrana può essere completato in 30 min. Il recupero gal-1hFc dagli adsorbenti a membrana proteica A varia in genere dal 10-30% nei nostri laboratori, con un recupero del ~30% regolarmente raggiunto da personale di laboratorio esperto quando le concentrazioni di Potassio-1hFc nel supernatante per coltura cellulare sono di 5-10 mg / ml. Al massimo, è stato raggiunto un recupero di ~ 50%. Il recupero completo del prodotto è praticamente impossibile a causa di perdite intrinseche dovute a (a) ritenzione specifica di proteine che esprimono fc da parte della proteina A sull'adsorbente di membrana(figure 3B e 3C)e (b) adsorbimento superficiale non specifico della proteina durante l'isolamento. È importante che i singoli laboratori determinino se il recupero del prodotto con un adsorbente a membrana è accettabile in base alle loro esigenze; se l'alterazione della portata di carico o del contenuto di materie prime(ad esempio il supernatante coltura di concentrazione delle cellule proteiche desiderate, che può essere particolarmente difficile) può migliorare il recupero del prodotto8, o se la modifica del protocollo di eluizione (fase 4) per ottenere un recupero più elevato vale l'aumento del tempo, delle spese e dello sforzo, o il possibile danno all'adsorbente proteico o di membrana stesso (principalmente per pH tampone di eluizione, concentrazione di sale, ecc.). A differenza dell'uso dell'adsorbente a membrana, ci vogliono circa 10 ore per eseguire due cicli di perfusione attraverso una proteina da 1 ml Una colonna imballata di perline18alla portata massima tollerabile di 1 ml / min e solo il 10-20% Gal-1hFc viene tipicamente recuperato. Come preoccupazione finale, un'analisi dei costi per le perline proteiche A di diversi produttori può influire sulla decisione di utilizzare una colonna standard imballata di perline rispetto a un singolo adsorbente a membrana. Tenendo conto di tutti questi fattori, l'uso di un adsorbente a membrana per l'isolamento su scala di laboratorio di proteine che esprimono Fc può offrire ai piccoli laboratori vantaggi significativi rispetto alla cromatografia acolonna 2,5,8,10.
L'uso di un mini gel per SDS-PAGE, il trasferimento elettroforetico semidry discontinuo di proteine dal gel alla membrana PVDF e l'immunoblotting sottovuoto offrono un notevole risparmio di tempo rispetto ai gel midi, al trasferimento del serbatoio (bagnato) e all'immunostaining a base di diffusione per la quantificazione e la caratterizzazione di Gal-1hFc (2 ore contro 8 ore). I singoli laboratori devono determinare se il protocollo occidentale accelerato è appropriato per la quantificazione e la caratterizzazione della loro proteina. I vantaggi includono (a) breve tempo per il completamento anche da parte di personale di laboratorio inesperto, (b) capacità di determinare se la proteina è intatta o si è degradata a causa di lavorazione o contaminazione (Figura 4B) e (c) relativa facilità di quantificazione da parte dei programmi di elaborazione delle immagini(Figura 4C). Tuttavia, (a) l'aumento dei costi dei reagenti e dei materiali di consumo può essere inaccettabile nonostante il tempo compensato per i salari, (b) la quantificazione tradizionale delle proteine da parte del saggio A280, ELISA, Bradford o BCA può esserepreferita 23-27, o (c) i laboratori potrebbero non avere accesso a un blotter semidry o a un sistema di rilevamento proteico aspirato per l'immunoblotting. In questi casi, la colorazione Coomassie delle proteine risolte SDS-PAGE21(Figura 4D) o l'blotting a punti ofessure 28 sono buone alternative.
La citometria a flusso è stata utilizzata in tre test separati da 90 minuti per il rilevamento di Gal-1hFc funzionale in questo protocollo semplificato (Figura 2), che è lo stesso dell'elaborazionetradizionale 18,22. Qualsiasi altro metodo di caratterizzazione come western blotting o ELISA sarebbe accettabile. I test funzionali sono ottimali(ad esempio, rilevamento di ligandi di galectin-1 sulle cellule tumorali del seno, figure 3A-C). In alternativa, il rilevamento dell'unità Fc sarebbe accettabile (simile alla Figura 3D), ma la ritenzione della funzione specifica della proteina non può essere determinata in questo modo, il che è uno svantaggio potenzialmente significativo.
I metodi qui descritti sono stati utilizzati per il rapido isolamento su scala di laboratorio e la caratterizzazione di una proteina di fusione chimerica che esprime fc umano (Gal-1hFc). Questo flusso di lavoro semplificato può essere applicato all'isolamento di praticamente qualsiasi molecola che possiede un frammento Fc (anticorpi IgG, altre proteine di fusione Fc, frammenti Fc stessi, ecc.)e può essere facilmente modificato in base alle preferenze di laboratorio individuali. Inoltre, questo protocollo è relativamente veloce e facile, anche per personale di laboratorio a esperienza limitata o completamente inesperto, rendendolo adatto per l'uso nei corsi di biologia, chimica e (bio)chimica del liceo o del college che coprono i principi di isolamento e caratterizzazione delle proteine.
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Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Sig. Luis F. Delgadillo (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare, Ohio University), il Sig. Matthew H. Williams (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare, Ohio University) e il Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital e Harvard Medical School) per l'assistenza tecnica di esperti. Gli autori desiderano inoltre ringraziare gli studenti dell'inverno 2011 CHE 404/BME 504 e dell'autunno 2012 CHE 4830/BME 5830 (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare e Ingegneria Biomedica, Ohio University) per la consulenza tecnica e la discussione. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione per la strumentazione di ricerca principale della National Science Foundation (NSF) CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NSC grant 1R15CA161 830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctoral Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) e NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P.
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S.
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M.
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T.
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al.
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
