Protein A Membran Adsorberleri ve Kolaylaştırılmış bir İş Akışı Kullanarak Kimerik İnsan Fc Ekspresyon Proteinlerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Summary
Protein A agarose boncuk dolu sütunlar kullanılarak geleneksel benzeşim kromatografisi ile karşılaştırıldığında, protein A membran adsorberleri antikorların ve diğer Fc parça ifade eden proteinlerin laboratuvar ölçeğinde izolasyonunu önemli ölçüde hızlandırabilir. Uygun analiz ve niceleme yöntemleri protein işlemeyi daha da hızlandırarak izolasyonun/karakterizasyonun 20+ iş saati yerine tek bir iş gününde tamamlanmasını sağlayabilir.
Abstract
Biyomoleküllerin hücre kültüründen endüstriyel ölçekte arındırılması için laboratuvar ölçeğinde süpernatantlar ve lisli hücre çözümleri benzeşim kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Gözenekli protein kullanılarak benzeşim kromatografisi Sütunlar halinde paketlenmiş agarose boncukları, IgG’nin Fc parçalarını ifade eden antikorların ve rekombinant proteinlerin laboratuvar ölçeği izolasyonunun tartışmasız en yaygın yöntemi olsa da, zaman alıcı ve pahalı bir süreç olabilir. Zaman ve finansal kısıtlamalar, özellikle seyreltilmiş çözeltilerden yüzlerce mikrogram ila miligram proteini geri kurtarması gereken, ancak yüksek basınçlı sıvı dağıtım sistemlerine ve / veya biyobenzerlik konusunda uzman personele erişimi olmayan küçük temel bilim laboratuvarlarında göz korkutucudur. Ayrıca, ürün nicelemesi ve karakterizasyonu da birkaç iş günü boyunca işlem süresini aşırı uzatabilir ve giderleri (sarf malzemeleri, ücretler vb.)şişirebilir. Bu nedenle, bir Fc parçasına sahip antikorların ve diğer proteinlerin laboratuvar ölçeği izolasyonu ve karakterizasyonu için hızlı, ucuz, ancak etkili bir protokol gereklidir. Bu amaçla, 20′ den fazla çalışma saati gerektiren geleneksel yöntemlerin aksine, sınırlı deneyime sahip teknik personel tarafından 9 saatten daha kısa bir sürede (kabaca bir iş günü) ve 4 saat kadar hızlı bir şekilde tamamlanabilen bir protokol tasarladık. Gerekli ekipmanların çoğu standart biyomedikal bilim, biyokimya ve (biyo)kimya mühendisliği laboratuvarlarında mevcuttur ve tüm reaktifler ticari olarak mevcuttur. Bu protokolü göstermek için, hücre kültürü üstnatantından insan Fc’ye (Gal-1hFc) kaynaşmış kimerik murine galectin-1’in A membran adsorber proteini kullanılarak izole edildiği temsili sonuçlar sunulmaktadır. Saflaştırılmış Gal-1hFc hızlandırılmış bir Batı blotting analiz prosedürü kullanılarak ölçüldü ve akış sitometrisi kullanılarak karakterize edildi. Kolaylaştırılmış iş akışı, antikorlar gibi diğer Fc ekspresyel proteinleri için değiştirilebilir ve/veya alternatif niceleme ve karakterizasyon yöntemlerini içerecek şekilde değiştirilebilir.
Introduction
Hücre kültürü süpernatantlarından ve seyreltilmiş lir hücre çözeltilerinden immünoglobulin G (IgG) Fc parçalarını ifade eden antikorların ve rekombinant proteinlerin izolasyonu protein A benzeşim kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Temel bilim ve mühendislik laboratuvarlarında ve endüstrisinde, gözenekli protein A kaplı agarose, cam veya polimerik boncuklarla dolu sütunlar, yüksek finansal maliyetlere ve uzun işlem sürelerine rağmen, benzeşim kromatografisi için en yaygın olarak1-3kullanılır. Benzeşim kromatografisinin hem laboratuvar hem de endüstriyel ortamlardaki en büyük gider ve işleme darboğazını temsil ettiği iyi takdir edilir2,4. Sonuç olarak, proses treni1,2,5-7’dengenel ürün geri kazanımından ödün vermeden maliyet ve işlem süresini azaltmak için çok sayıda iyileştirme geliştirilmiştir. Antikorların ve diğer Fc ekspresyon proteinlerinin izolasyonu için özellikle umut verici olan, A membran adsorber2,5,7-10proteini kullanılarak benzeşim kromatografisidir. Kolon kromatografisinde FC yakalaması difüzyon sınırlıyken(yani Fc ekspresyon proteini, protein A’nın çoğunluğuna ulaşmak için iç gözeneklere ve a yoluyla dağılmalı) sütun boyunca yüksek basınç düşüşü ile, membran adsorberlerindeki kütle taşımacılığı toplu konveksiyon ile yönlendirilir ve bu da difüzyon sınırlamalarından kaçınmaya neden olur8,9,11,12. Ek olarak, membran adsorber boyunca basınç düşüşü düşüktür, böylece boncuk dolu sütunlara kıyasla daha hızlı perfüzyon akış hızlarına izin verir8,9,11,12. Böylece laboratuvar ölçeği izolasyonu için membran kromatografinin izolasyon süresini birkaç saat azaltarak kolon kromatografisine göre ürün yakalamayı artıracağı öngörülür. Ayrıca, membran adsorberlerinde IgG adsorpsiyonu için matematiksel modeller önerilmiştir8,9,11,12, böylece son kullanıcıların laboratuvardaki performansı tahmin etmelerini sağlar.
Temel bilim ve mühendislik laboratuvarlarındaki bir diğer darboğaz, Fc ekspresyasyon proteininin karakterizasyonudur. Bununla birlikte, Batı lekeleri gibi karakterizasyon testlerini tamamlamak için uygun yöntemlerin seçilmesi, ürün testlerine harcanan zamanı büyük ölçüde azaltabilir. Örneğin, süreksiz bir tampon sisteminde semidry transferi, sürekli bir tampon sisteminde 1-2 saat tank (ıslak) transferinin aksine, proteinlerin bir SDS-PAGE jelinden polivinil difluoridin (PVDF) membrana elektroforetik transferini birkaç dakika içinde gerçekleştirebilir13.
İnsan IgG’nin fc parçasını ifade eden bir kimerik füzyon proteinini izole etmek ve karakterize etmek için hızlı, ucuz ve etkili bir protokol burada açıklanmıştır. Çoğu ekipman standart temel biyomedikal bilim, biyoloji, kimya ve (biyo)kimya mühendisliği laboratuvarlarında mevcuttur ve tüm reaktifler ticari olarak mevcuttur. Bir murine galektin-1/insan Fc chimeric füzyon proteininin (Gal-1hFc) izolasyonundan ve karakterizasyonundan temsili sonuçlar elde edilmiş olsa da, aerodinamik protokol antikorlar, Fc parçaları veya diğer Fc füzyon proteinleri gibi fc parçasına sahip diğer moleküllerin izolasyonuna uygulanabilir. Geliştirmelerimiz, standart yöntemlere kıyasla benzer veya geliştirilmiş ürün geri kazanımı elde ederken işlem süresini önemli ölçüde azalttı (4 saat kadar az ancak daha tipik olarak ~9 saat, 20+ çalışma saatine kıyasla).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, ürün geri kazanımını veya şişirme maliyetini önemli ölçüde tehlikeye atmadan, insan Fc’yi (Gal-1hFc) ifade eden bir kimerik füzyon proteinini hızla izole etmek ve karakterize etmek için geliştirilmiştir. Aerodinamik iş akışının temel bileşenleri, izolasyon için bir protein A membran adsorber ve Batı şişkinliği ile karakterize için semidry transferi ve vakum destekli immünobotting’dir.
Gal-1hFc’nin 300 ml hücre kültürü süpernatant?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, uzman teknik yardım için Bay Luis F. Delgadillo’ya (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü), Bay Matthew H. Williams’a (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü) ve Dr. Filiberto Cedeno-Laurent’e (Brigham ve Kadın Hastanesi ve Harvard Tıp Fakültesi) teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca 2011 Kış 2011 CHE 404/BME 504 ve Sonbahar 2012 CHE 4830/BME 5830 öğrencilerine (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik ve Biyomedikal Mühendisliği Programı Bölümü) teknik tavsiye ve tartışma için teşekkür etmek istemeleridir. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Büyük Araştırma Araçları hibesi CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatoloji Vakfı Araştırma Hibesi A050422 (SRB), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) NCI hibesi 1R15CA1618 tarafından desteklendi.30-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Doktora Sonrası Burs F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) ve NIH NCCAM hibe R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O’Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O’Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
