Isolasjon og karakterisering av chimeric human fc-uttrykkende proteiner ved hjelp av protein A membrane adsorbere og en strømlinjeformet arbeidsflyt
Summary
Sammenlignet med tradisjonell affinitetskromatografi ved hjelp av protein A agarose perle-pakket kolonner, protein A membran adsorbere kan betydelig hastighet laboratorieskala isolasjon av antistoffer og andre Fc fragment-uttrykkende proteiner. Hensiktsmessige analyse- og kvantifiseringsmetoder kan ytterligere akselerere proteinbehandling, slik at isolasjon/karakterisering kan fullføres i løpet av en arbeidsdag, i stedet for 20+ arbeidstimer.
Abstract
Laboratorieskala til industriell skala rensing av biomolekyler fra cellekultur supernatanter og lysede celleløsninger kan oppnås ved hjelp av affinitetskromatografi. Mens affinitetskromatografi ved hjelp av porøst protein A agarose perler pakket i kolonner er uten tvil den vanligste metoden for laboratorieskalaisolasjon av antistoffer og rekombinante proteiner som uttrykker Fc fragmenter av IgG, kan det være en tidkrevende og dyr prosess. Tids- og økonomiske begrensninger er spesielt skremmende i små grunnleggende vitenskapslaboratorier som må gjenopprette hundrevis av mikrogram til milligram mengder protein fra fortynnede løsninger, men mangler tilgang til høytrykks væskeleveringssystemer og / eller personell med kompetanse innen bioseparasjoner. Videre kan produkt kvantifisering og karakterisering også forlenge behandlingstiden for mye over flere arbeidsdager og blåse opp utgifter (forbruksvarer, lønn, etc.). Derfor er det nødvendig med en rask, billig, men effektiv protokoll for laboratorieskalaisolasjon og karakterisering av antistoffer og andre proteiner som har et Fc-fragment. For dette formål har vi utarbeidet en protokoll som kan fullføres av teknisk personale med begrenset erfaring på mindre enn 9 timer (omtrent en arbeidsdag) og så raskt som 4 timer, i motsetning til tradisjonelle metoder som krever 20+ arbeidstimer. Det mest nødvendige utstyret er lett tilgjengelig i standard biomedisinsk vitenskap, biokjemi og (bio)kjemiske ingeniørlaboratorier, og alle reagenser er kommersielt tilgjengelige. For å demonstrere denne protokollen presenteres representative resultater der chimeric murine galectin-1 smeltet til human Fc (Gal-1hFc) fra cellekultur supernatant ble isolert ved hjelp av et protein A membran adsorber. Renset Gal-1hFc ble kvantifisert ved hjelp av en fremskyndet vestlig blotting analyse prosedyre og karakterisert ved hjelp av strømning cytometri. Den strømlinjeformede arbeidsflyten kan endres for andre Fc-uttrykkende proteiner, for eksempel antistoffer, og/eller endres for å inkorporere alternative kvantifiserings- og karakteriseringsmetoder.
Introduction
Isolering av antistoffer og rekombinante proteiner som uttrykker immunglobulin G (IgG) Fc fragmenter fra cellekultur supernatanter og fortynnede lysede celleløsninger kan oppnås ved hjelp av protein A affinitet kromatografi. I grunnleggende vitenskaps- og ingeniørlaboratorier og industri brukes kolonner fullpakket med porøst protein A-belagt agarose, glass eller polymere perler oftest til affinitetskromatografi, til tross for høye økonomiske kostnader og lange behandlingstider1-3. Det er godt verdsatt at affinitetskromatografi representerer den største utgiften og behandling av flaskehals i både lab og industrielle omgivelser2,4. Som et resultat er det utviklet mange forbedringer for å redusere kostnads- og behandlingstiden uten å ofre den totale produktgjenvinningen fra prosesstoget1,2,5-7. Spesielt lovende for isolering av antistoffer og andre Fc-uttrykkende proteiner er affinitet kromatografi ved hjelp av et protein A membrane adsorber2,5,7-10. Mens Fc-fangst i kolonnekromatografi er diffusjonsbegrenset (dvs. det Fc-uttrykkende proteinet må spre seg inn i og gjennom indre porer for å nå mesteparten av proteinet A) med høyt trykkfall over kolonnen, er massetransport i membran adsorbere drevet av bulkkonveksjon, noe som resulterer i unngåelse av diffusjonsbegrensninger8,9,11,12. I tillegg er trykkfallet over membran adsorberen lavt, og tillater dermed raskere perfusjonsstrømningshastigheter sammenlignet med perlepakkede kolonner8,9,11,12. For laboratorieskalaisolasjon forventes derfor membrankromatografi å redusere isolasjonstiden med flere timer og øke produktfangst sammenlignet med kolonnekromatografi. Videre har matematiske modeller for IgG-adsorpsjon i membran adsorbere blitt foreslått8,9,11,12, slik at sluttbrukere kan forutsi ytelse i laboratoriet.
En annen flaskehals i grunnleggende vitenskaps- og ingeniørlaboratorier er karakteriseringen av fc-uttrykkende protein. Imidlertid kan valg av passende metoder for å fullføre karakteriseringsanalyser, slike vestlige flekker, redusere tiden som brukes på produkttesting. For eksempel kan semidryoverføring i et diskontinuerlig buffersystem oppnå elektroforetisk overføring av proteiner fra en SDS-PAGE gel til en polyvinyldifluoridin (PVDF) membran i løpet av få minutter, i motsetning til 1-2 timer i tankoverføring (våt) i et kontinuerlig buffersystem13.
En rask, billig og effektiv protokoll for å isolere og karakterisere et chimerisk fusjonsprotein som uttrykker et Fc-fragment av menneskelig IgG er beskrevet heri. Det meste av utstyret er lett tilgjengelig i standard grunnleggende biomedisinsk vitenskap, biologi, kjemi og (bio)kjemiske ingeniørlaboratorier, og alle reagenser er kommersielt tilgjengelige. Selv om representative resultater ble generert fra isolasjon og karakterisering av en murine galectin-1/human Fc chimeric fusion protein (Gal-1hFc), kan den strømlinjeformede protokollen brukes på isolasjon av andre molekyler som har et Fc fragment, for eksempel antistoffer, Fc fragmenter selv, eller andre Fc fusjon proteiner. Våre forbedringer reduserte behandlingstiden dramatisk (så få som 4 timer, men mer typisk ~ 9 timer, sammenlignet med 20 + arbeidstimer) samtidig som vi oppnådde lignende eller forbedret produktgjenoppretting sammenlignet med standardmetoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet heri ble utviklet for raskt å isolere og karakterisere et chimerisk fusjonsprotein som uttrykker menneskelig Fc (Gal-1hFc), uten å gå betydelig på kompromiss med produktgjenoppretting eller oppblåsende kostnader. Nøkkelkomponentene i den strømlinjeformede arbeidsflyten er et protein A membrane adsorber for isolasjon, og semidry overføring og vakuumassistert immunoblotting for karakterisering av vestlig blotting.
Den dramatiske nedgangen i behandlingstid for isola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Mr. Luis F. Delgadillo (Institutt for kjemisk og biomolekylær ingeniørfag, Ohio University), Mr. Matthew H. Williams (Institutt for kjemisk og biomolekylær ingeniørfag, Ohio University) og Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women’s Hospital og Harvard Medical School) for ekspert teknisk assistanse. Forfatterne ønsker også å takke Winter 2011 CHE 404/BME 504 og Fall 2012 CHE 4830/BME 5830 studenter (Institutt for kjemisk og biomolekylær ingeniørfag og biomedisinsk ingeniørfag, Ohio University) for teknisk rådgivning og diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI grant 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoktorstipend F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) og NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O’Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O’Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
