Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato
Summary
Rispetto alla cromatografia di affinità tradizionale che utilizza colonne piene di perline di agarosio A, gli adsorbenti a membrana A proteici possono accelerare significativamente l’isolamento su scala di laboratorio degli anticorpi e di altre proteine che esprimono frammenti Fc. Metodi di analisi e quantificazione appropriati possono accelerare ulteriormente l’elaborazione delle proteine, consentendo di completare l’isolamento / caratterizzazione in un giorno lavorativo, anziché oltre 20 ore lavorative.
Abstract
La purificazione su scala industriale su scala industriale delle biomolecole dai supernanti di coltura cellulare e dalle soluzioni cellulari liscivie può essere effettuata utilizzando la cromatografia di affinità. Mentre la cromatografia di affinità che utilizza proteine porose A agarose perline imballate in colonne è probabilmente il metodo più comune di isolamento in scala di laboratorio di anticorpi e proteine ricombinanti che esprimono frammenti fc di IgG, può essere un processo dispendioso in termini di tempo e costoso. I vincoli di tempo e finanziari sono particolarmente scoraggianti nei piccoli laboratori scientifici di base che devono recuperare centinaia di microgrammi a quantità di proteine milligrammi da soluzioni diluite, ma non hanno accesso a sistemi di erogazione di liquidi ad alta pressione e / o personale con esperienza in bioseparazioni. Inoltre, la quantificazione e la caratterizzazione dei prodotti possono anche allungare eccessivamente il tempo di lavorazione per diversi giorni lavorativi e gonfiare le spese (materiali di consumo, salari, ecc.). Pertanto, è necessario un protocollo veloce, economico ma efficace per l’isolamento su scala di laboratorio e la caratterizzazione di anticorpi e altre proteine in possesso di un frammento Fc. A tal fine, abbiamo ideato un protocollo che può essere completato da personale tecnico a esperienza limitata in meno di 9 ore (circa un giorno lavorativo) e fino a 4 ore, rispetto ai metodi tradizionali che richiedono oltre 20 ore lavorative. La maggior parte delle attrezzature richieste è prontamente disponibile nei laboratori standard di scienze biomediche, biochimiche e (bio)ingegneria chimica, e tutti i reagenti sono disponibili in commercio. Per dimostrare questo protocollo, vengono presentati risultati rappresentativi in cui la galettanina murina chimerica-1 fusa all’Fc umano (Gal-1hFc) dal supernatante di coltura cellulare è stata isolata usando una proteina A adsorbente di membrana. Il Gal-1hFc purificato è stato quantificato utilizzando una procedura accelerata di analisi western blotting e caratterizzato utilizzando citometria a flusso. Il flusso di lavoro semplificato può essere modificato per altre proteine che esprimono Fc, come gli anticorpi, e /o alterato per incorporare metodi alternativi di quantificazione e caratterizzazione.
Introduction
L’isolamento di anticorpi e proteine ricombinanti che esprimono frammenti di immunoglobulina G (IgG) Fc dai supernatanti di coltura cellulare e dalle soluzioni cellulari diluite può essere realizzato utilizzando la cromatografia di affinità proteinA A. Nei laboratori e nell’industria scientifica e ingegneristica di base, le colonne piene di proteina porosa A agarosio, vetro o perline polimeriche sono più comunemente utilizzate per la cromatografia di affinità, nonostante gli elevati costi finanziari e i lunghi tempi dilavorazione 1-3. È molto apprezzato che la cromatografia di affinità rappresenti il più grande collo di bottiglia di spesa e lavorazione sia in laboratorio che in ambienteindustriale 2,4. Di conseguenza, sono stati sviluppati numerosi miglioramenti per ridurre i costi e i tempi di elaborazione senza sacrificare il recupero complessivo delprodotto dal treno di processo 1,2,5-7. Particolarmente promettente per l’isolamento di anticorpi e altre proteine che esprimono Fc è la cromatografia di affinità utilizzando una proteina A membrane adsorber2,5,7-10. Mentre la cattura fc nella cromatografia a colonna è limitata dalladiffusione (cioè la proteina che esprime fc deve diffondersi nei pori interni e attraverso di esso per raggiungere la maggior parte della proteina A) con caduta di alta pressione attraverso la colonna, il trasporto di massa negli adsorbenti a membrana è guidato dalla convezione alla rinfusa, con conseguente evitare limitazioni didiffusione 8,9,11,12. Inoltre, la caduta di pressione attraverso l’adsorbente a membrana è bassa, consentendo così portate di perfusione più elevate rispetto alle colonne imballate perline8,9,11,12. Pertanto, per l’isolamento su scala di laboratorio, si prevede che la cromatografia a membrana riduca i tempi di isolamento di diverse ore e aumenti la cattura del prodotto rispetto alla cromatografia a colonna. Inoltre, sono stati proposti modelli matematici per l’adsorbimento IgG negli adsorbenti a membrana8,9,11,12, consentendo così agli utenti finali di prevedere le prestazioni in laboratorio.
Un altro collo di bottiglia nei laboratori di scienze e ingegneria di base è la caratterizzazione della proteina che esprime fc. Tuttavia, la selezione di metodi appropriati per completare i test di caratterizzazione, come le macchie occidentali, può ridurre notevolmente il tempo dedicato ai test dei prodotti. Ad esempio, il trasferimento semidry in un sistema tampone discontinuo può realizzare il trasferimento elettroforetico di proteine da un gel SDS-PAGE a una membrana di polivinile difluoridina (PVDF) in pochi minuti, rispetto a 1-2 ore di trasferimento di serbatoio (bagnato) in un sistema tampone continuo13.
Un protocollo rapido, economico ed efficace per isolare e caratterizzare una proteina di fusione chimerica che esprime un frammento Fc di IgG umano è descritto nel presente documento. La maggior parte delle apparecchiature è prontamente disponibile nei laboratori standard di scienze biomediche di base, biologia, chimica e (bio)ingegneria chimica, e tutti i reagenti sono disponibili in commercio. Sebbene siano stati generati risultati rappresentativi dall’isolamento e dalla caratterizzazione di una proteina di fusione chimerica Fc murina-1/umana (Gal-1hFc), il protocollo semplificato può essere applicato all’isolamento di altre molecole che possiedono un frammento Fc, come anticorpi, frammenti Fc stessi o altre proteine di fusione Fc. I nostri miglioramenti hanno ridotto drasticamente i tempi di elaborazione (fino a 4 ore ma più in genere ~ 9 ore, rispetto a oltre 20 ore lavorative) ottenendo al contempo un recupero del prodotto simile o migliorato rispetto ai metodi standard.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per isolare e caratterizzare rapidamente una proteina di fusione chimerica che esprime fc umano (Gal-1hFc), senza compromettere significativamente il recupero del prodotto o il costo di gonfiaggio. I componenti chiave del flusso di lavoro semplificato sono un adsorbente a membrana A proteico per l’isolamento e il trasferimento semidry e l’immunoblotting sottovuoto per la caratterizzazione da parte dell’assorbente occidentale.
La drastica diminuz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Sig. Luis F. Delgadillo (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare, Ohio University), il Sig. Matthew H. Williams (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare, Ohio University) e il Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women’s Hospital e Harvard Medical School) per l’assistenza tecnica di esperti. Gli autori desiderano inoltre ringraziare gli studenti dell’inverno 2011 CHE 404/BME 504 e dell’autunno 2012 CHE 4830/BME 5830 (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare e Ingegneria Biomedica, Ohio University) per la consulenza tecnica e la discussione. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione per la strumentazione di ricerca principale della National Science Foundation (NSF) CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NSC grant 1R15CA161 830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctoral Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) e NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
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