По сравнению с традиционной хроматографией сродства с использованием белка агароза бисероубитарные колонки, мембранные адсорберы белка A могут значительно ускорить лабораторно-масштабную изоляцию антител и других фрагмент-экспрессионных белков Fc. Надлежащие методы анализа и количественной оценки могут еще больше ускорить обработку белка, что позволит завершить изоляцию/характеристику за один рабочий день, а не за 20 часов работы.
Лабораторный масштаб до промышленной очистки биомолекул от супернатантов клеточной культуры и лизированных клеточных растворов может быть выполнен с помощью хроматографии сродства. Хотя сродство хроматографии с использованием пористого белка Агароза бисер упакованы в колонки, возможно, наиболее распространенным методом лабораторного масштаба изоляции антител и рекомбинантных белков, выражают Fc фрагменты IgG, это может быть трудоемким и дорогостоящим процессом. Время и финансовые ограничения особенно огромны в небольших базовых научных лабораториях, которые должны восстановить сотни микрограммов до миллиграммовых количеств белка из разбавленных растворов, но не имеют доступа к системам доставки жидкостей высокого давления и/или персоналу, опыту в биоразделение. Кроме того, количественная оценка и характеристика продукции могут также чрезмерно удлинять время обработки в течение нескольких рабочих дней и завышать расходы (расходные расходы, заработная плата и т.д.). Таким образом, быстрый, недорогой, но эффективный протокол необходим для лабораторной изоляции масштаба и характеристики антител и других белков, обладающих фрагментом Fc. С этой целью мы разработали протокол, который может быть завершен ограниченным опытом технического персонала менее чем за 9 часов (примерно один рабочий день) и так же быстро, как 4 часа, в отличие от традиционных методов, которые требуют 20 часов работы. Большинство необходимого оборудования легкодоступно в стандартных биомедицинских науках, биохимии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Чтобы продемонстрировать этот протокол, репрезентативные результаты представлены, в которых химерин галектин-1 сливается с человеком Fc (Gal-1hFc) из клеточной культуры супернатант был изолирован с помощью белка мембраны AdSorber. Очищенный Gal-1hFc был количественно оценен с помощью ускоренной процедуры анализа западного blotting и характеризовался использованием цитометрии потока. Оптимизированный рабочий процесс может быть изменен для других белков, выражаюющих Fc, таких как антитела, и/или изменен для включения альтернативных методов количественной оценки и характеристики.
Изоляция антител и рекомбинантных белков, выражаюющих иммуноглобулин G (IgG) Fc фрагменты из клеточной культуры supernatants и разбавления облизатических клеточных растворов может быть достигнуто с помощью белка сродство хроматографии. В фундаментальных научно-технических лабораториях и промышленности, колонны упакованы с пористым белком Агароза, стекло, или полимерные бусы чаще всего используются для сродства хроматографии, несмотря на высокие финансовые затраты и длительноевремя обработки 1-3. Это хорошо оценили, что сродство хроматографии представляет собой крупнейший счет и обработка узкое место в лабораторных ипромышленных условиях 2,4. В результате, многочисленные улучшения были разработаны для снижения затрат и времени обработки без ущерба для общего восстановления продуктаот процесса поезд 1,2,5-7. Особенно перспективным для изоляции антител и других белков, выражаюющих Fc, является сродство хроматографии с использованием белка мембраны А adorber2,5,7-10. В то время как fc захвата в колонке хроматографии диффузии ограничено(т.е. Fc-экспрессии белка должны диффузии в и через внутренние поры, чтобы достичь большинства белка А) с высоким давлением падение по всей колонке, массовый транспорт в мембранных адсорберов приводит к массовой конвекции, в результатечего избежать диффузии ограничения 8,9,11,12. Кроме того, падение давления через мембрану adorber является низким, что позволяет быстрее перфузии скорости потока по сравнению с бисером упакованыколонны 8,9,11,12. Таким образом, для изоляции лабораторных масштабах, мембранная хроматография, по прогнозам, сократит время изоляции на несколько часов и увеличит улавливание продукта по сравнению с колонкой хроматографии. Кроме того, математические модели для IgG adorption в мембранных адсорбенахбыли предложены 8,9,11,12, что позволяет конечных пользователей прогнозировать производительность в лаборатории.
Еще одним узким местом в фундаментальных научно-технических лабораториях является характеристика белка Fc-expressing. Тем не менее, выбор соответствующих методов для завершения анализа характеристик, таких западных помарки, может значительно сократить время, затученные на тестирование продукта. Например, полудровый переход в прерывистой буферной системе может выполнить электрофоретический перенос белков из геля SDS-PAGE в мембрану поливинила дифторидина (PVDF) в считанные минуты, в отличие от 1-2 часов в баке (мокрый) передачи в непрерывной буфернойсистеме 13.
Быстрый, недорогой и эффективный протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать химерный синтез белка, выражаюго Fc фрагмент человека IgG описывается здесь. Большинство оборудования легкодоступно в стандартных базовых биомедицинских науках, биологии, химии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Хотя репрезентативные результаты были получены в результате изоляции и характеристики murine galectin-1/human Fc химерного белка синтеза (Gal-1hFc), обтекаемый протокол может быть применен к изоляции других молекул, обладающих фрагментом Fc, таких как антитела, сами фрагменты Fc или другие белки синтеза Fc. Наши улучшения значительно сократили время обработки (всего за 4 часа, но, как правило, на 9 часов, по сравнению с 20 часами работы) при одновременном достижении аналогичного или улучшенного восстановления продукта по сравнению со стандартными методами.
Протокол, описанный в этом, был разработан для быстрой изоляции и характеристики химерного синтеза белка, выражаюго человека Fc (Gal-1hFc), без существенного ущерба для восстановления продукта или завышения стоимости. Ключевыми компонентами обтекаемого рабочего процесса являются белок ме…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить г-на Луиса Ф. Дельгадильо (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо), г-на Мэтью Х. Уильямса (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо) и д-ра Филиберто Седено-Лорана (Brigham and Women’s Hospital и Harvard Medical School) за экспертную техническую помощь. Авторы также хотели бы поблагодарить Зимой 2011 CHE 404/BME 504 и осень 2012 CHE 4830/BME 5830 студентов (Департамент химической и биомолекулярной инженерии и биомедицинской инженерной программы, Университет Огайо) за технические консультации и обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Основные исследования инструментов грант CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Дерматология Фонд исследований Грант A050422 (SRB), Национальные институты здравоохранения (NIH) NCI грант 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Постдокторская стипендий F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD), и NIH NCCAM грант R01AT004628 (CJD).
Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
BSA | Sigma | A9647 | |
Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |