Summary
بالمقارنة مع الكروماتوغرافيا تقارب التقليدية باستخدام البروتين Agarose حبة معبأة الأعمدة، البروتين A غشاء الممتزات يمكن أن تسرع بشكل كبير العزل المختبرية على نطاق الأجسام المضادة وغيرها من البروتينات Fc التعبير عن جزء. ويمكن أن تزيد أساليب التحليل والتقدير الكمي المناسبة من تسريع معالجة البروتين، مما يسمح بإكمال العزل/التوصيف في يوم عمل واحد، بدلا من 20 ساعة عمل.
Abstract
يمكن إنجاز المقياس المختبري لتنقية الجزيئات الحيوية من الجزيئات الحيوية من الحيوانات الخارقة زراعة الخلايا وحلول الخلايا المتحللة باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب. في حين أن الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام البروتين المسامية حبات agarose معبأة في أعمدة يمكن القول إن الطريقة الأكثر شيوعا لعزل نطاق المختبر من الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة التعبير عن شظايا Fc من IgG، يمكن أن يكون عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. الوقت والقيود المالية شاقة بشكل خاص في مختبرات العلوم الأساسية الصغيرة التي يجب استرداد مئات ميكروغرام لكميات ملليغرام من البروتين من المحاليل المخففة، ولكن تفتقر إلى الوصول إلى أنظمة توصيل السائل الضغط العالي و / أو الموظفين ذوي الخبرة في التركيبات الحيوية. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي تحديد كمية المنتج وتوصيفه أيضا إلى إطالة وقت المعالجة بشكل مفرط على مدى عدة أيام عمل وتضخيم النفقات (المواد الاستهلاكية والأجور وما إلى ذلك). لذلك، هناك حاجة إلى بروتوكول سريع وغير مكلف وفعال في الوقت الذي يتم فيه عزل الأجسام المضادة والبروتينات الأخرى التي تمتلك شظية Fc وتوصيفها على نطاق المختبر. وتحقيقا لهذه الغاية، وضعنا بروتوكولا يمكن أن يكمله موظفون تقنيون محدودو الخبرة في أقل من 9 ساعات (يوم عمل واحد تقريبا) وبسرعة 4 ساعات، على عكس الأساليب التقليدية التي تتطلب أكثر من 20 ساعة عمل. معظم المعدات المطلوبة متاحة بسهولة في العلوم الطبية الحيوية القياسية، والكيمياء الحيوية، ومختبرات الهندسة الكيميائية (الحيوية)، وجميع الكواشف متوفرة تجاريا. لإثبات هذا البروتوكول ، يتم تقديم نتائج تمثيلية تم فيها دمج murine galectin-1 في Fc البشري (Gal-1hFc) من فلورة زراعة الخلايا باستخدام بروتين ممزوج بالغشاء A. تم قياس كمية Gal-1hFc المنقى باستخدام إجراء تحليل النشاف الغربي المعجل وتميز باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويمكن تعديل سير العمل المبسط للبروتينات الأخرى المعبرة عن ال FC، مثل الأجسام المضادة، و/أو تغييره ليشمل أساليب بديلة للقياس الكمي والتوصيف.
Introduction
يمكن تحقيق عزل الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة التي تعبر عن شظايا الغلوبولين المناعي G (IgG) Fc من الخلايا المستنشقة ومحلولات الخلايا المميعة المخففة باستخدام البروتين الكروماتوغرافيا المتقاربة. في مختبرات العلوم والهندسة الأساسية والصناعة ، والأعمدة معبأة مع بروتين مسامية A المغلفة agarose والزجاج ، أو الخرز البوليمري هي الأكثر شيوعا للكروماتوغرافيا تقارب ، على الرغم من ارتفاع التكاليف المالية وأوقات المعالجةالطويلة 1-3. ومن الامتنان أن تقارب الكروماتوغرافيا يمثل أكبر حساب ومعالجة عنق الزجاجة في كل من المختبر والإعدادات الصناعية2،4. ونتيجة لذلك، تم تطوير العديد من التحسينات لتقليل التكلفة ووقت المعالجة دون التضحية باسترداد المنتج بشكل عام من قطار العملية1,2,5-7. واعدة بشكل خاص لعزل الأجسام المضادة وغيرها من البروتينات التي تعبر عن Fc هو الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام البروتين A غشاء adsorber2,5,7-10. في حين أن التقاط Fc في كروماتوغرافيا العمود محدود الانتشار(أي أن البروتين المعبر عن Fc يجب أن ينتشر داخل المسام الداخلية وعبرها للوصول إلى غالبية البروتين A) مع انخفاض الضغط العالي عبر العمود ، فإن النقل الجماعي في الأغشية الممتزة مدفوع بالحماس الحراري السائب ، مما يؤدي إلى تجنب قيود الانتشار8،9،11،12. وبالإضافة إلى ذلك، انخفاض الضغط عبر غشاء الممتز منخفضة، مما يسمح أسرع معدلات تدفق التغلغل مقارنة مع الأعمدة معبأة حبة8،9،11،12. وبالتالي ، بالنسبة لعزل النطاق المختبري ، من المتوقع أن يقلل لون الغشاء من وقت العزل لعدة ساعات ويزيد من التقاط المنتج مقارنة بالكروماتوغرافيا العمودية. وعلاوة على ذلك، تم اقتراح نماذج رياضية لامتزاز IgG في الأغشية adsorbers8،9،11،12، مما يسمح للمستخدمين النهائيين للتنبؤ الأداء في المختبر.
وثمة اختناق آخر في مختبرات العلوم والهندسة الأساسية هو توصيف البروتين المعبر عن ال FC. ومع ذلك ، فإن اختيار الطرق المناسبة لإكمال اختبارات التوصيف ، مثل هذه البقع الغربية ، يمكن أن يقلل إلى حد كبير من الوقت الذي يقضيه في اختبار المنتج. على سبيل المثال، نقل شبه مجفف في نظام عازل متقطع يمكن إنجاز نقل البروتينات الكهربائية من هلام SDS-PAGE إلى غشاء ثنائي فلوريدين متعدد الفينيل (PVDF) في غضون دقائق، في مقابل 1-2 ساعة في نقل خزان (الرطب) في نظام عازل مستمر13.
ويرد هنا وصف بروتوكول سريع وغير مكلف وفعال لعزل وتوصيف بروتين الاندماج الشيمي الذي يعبر عن جزء Fc من IgG البشري. معظم المعدات متاحة بسهولة في العلوم الطبية الحيوية الأساسية القياسية والبيولوجيا والكيمياء ومختبرات الهندسة الكيميائية (الحيوية) ، وجميع الكواشف متوفرة تجاريا. على الرغم من أن النتائج التمثيلية تم إنشاؤها من عزل وتوصيف بروتين الانصهار الموريني galectin-1/human Fc chimeric protein (Gal-1hFc) ، يمكن تطبيق البروتوكول المبسط على عزل الجزيئات الأخرى التي تمتلك جزءا من Fc ، مثل الأجسام المضادة ، أو شظايا Fc نفسها ، أو بروتينات الاندماج Fc الأخرى. وقد انخفضت التحسينات بشكل كبير وقت المعالجة (أقل من 4 ساعات ولكن عادة ~ 9 ساعة ، مقارنة مع 20 + ساعات العمل) مع تحقيق استرداد المنتج مماثلة أو محسنة مقارنة بالطرق القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحقق من تقارب البروتين A
- تحقق من أن البروتين المعبر عن Fc (بروتين الاندماج المؤتلف أو الأجسام المضادة IgG ، المشار إليها حتى الآن باسم "البروتين") لديه تقارب مقبول للبروتين A14-17 قبل استخدام البروتين A غشاء الممتز ، واختبار وجود البروتين في محلول المخزون(على سبيل المثال ثقافة الخلية supernatant أوضحها الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 5 دقائق إلى الخلايا المعلقة بيليه). استخدام قياس التدفق الخلوي، النشاف الغربي، ELISA، الخ. للكشف عن وظيفة البروتين و / أو وجود Fc ، استنادا إلى تفضيل المختبر. من الناحية المثالية، تحديد البروتين في خلية الثقافة الفائقة (الخطوة 6) لتجنب تجاوز البروتين قدرة غشاء الممتز. المضي قدما إذا تم الكشف عن البروتين.
2. إعداد البروتين ومكثف الأغشية وخلايا الثقافة Supernatant
- اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد الغشاء adsorber. لا تدع الهواء يدخل الغشاء الممتز. يجب أن تكون جميع الحلول التي يتم اختراقها من خلال ممتز الغشاء في درجة حرارة الغرفة ومصفاة مسبقا باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر. ملء حقنة 10 مل مع 0.22 ميكرومتر تصفيتها الفوسفات Dulbecco المالحة المخزنة مؤقتا (DPBS) أو العازلة من الاختيار وتفريغ فقاعات الهواء. Perfuse DPBS لإزالة محلول التخزين و equilibrate غشاء adsorber مباشرة قبل الاستخدام.
- تصفية الخلايا الثقافة supernatant مباشرة قبل التغلغل من خلال غشاء adsorber، وذلك باستخدام فراغ يحركها 0.22 ميكرومتر وحدة الترشيح العقيمة.
3. تحميل البروتين A غشاء الممتز
- أسبيرات ثقافة الخلية supernatant في حقنة لوير لوك (30 مل أو أكبر)، وتفريغ أي فقاعات الهواء.
- تجميع المواد والمعدات كما هو موضح في الشكل 1. ربط المحاقن إلى مدخل من غشاء الممتز. إرفاق أنابيب مرنة إلى منفذ الغشاء الممتز. إذا رغبت في ذلك، ضع مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر بين الحقنة وممتز الغشاء. استخدام قارورة أو زجاجة للقبض على تدفق من خلال (المعروف أيضا باسم filtrate)، من الممتز.
- تعيين مضخة حقنة لمعدل التدفق الحجمي المطلوب، ولكن لا تتجاوز معدل التدفق الموصى بها من قبل الشركة المصنعة(على سبيل المثال 10 مل / دقيقة). Perfuse ثقافة الخلية supernatant من خلال غشاء الممتز ، وجمع تدفق من خلال في كوب أو حاوية أخرى. إعادة تحميل المحاقن مع المضادات اللازمة.
- إذا رغبت في ذلك، اختبار تدفق من خلال لوجود البروتين باستخدام قياس التدفق الخلوي، النشاف الغربية، ELISA، الخ. بناء على تفضيل المختبر. عادة ما يكون من غير الضروري إعادة بث التدفق من خلاله.
4. بروتين Elute من مذبات الغشاء
- اغسل الغشاء الممتز مع 10 مل DPBS لإزالة أي بروتين غير منضم.
- بروتين إلوت من غشاء الممتز بمعدل التدفق المطلوب(على سبيل المثال 1 مل / دقيقة) باستخدام 10-15 مل من العازلة elution(على سبيل المثال، العازلة الوضوء القائم على الأمين (pH 2.8)). التقاط eluate في أنبوب يحتوي على العازلة تحييد(على سبيل المثال 1 M تريس (pH 9.4)) في 10٪ من حجم elution (1.0-1.5 مل).
- بدلا من ذلك، elute البروتين في واحد مل زيادات في أنابيب تحتوي على 100 ميكرولتر من العازلة تحييد، وذلك باستخدام حجم إجمالي من 10-15 مل elution العازلة. استخدم طريقة التوصيف المفضلة لاختبار كل كسر لوجود البروتين.
- تجديد الغشاء adsorber وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. Perfuse 10 مل من 0.22 ميكرومتر تصفيتها DPBS أو العازلة من الاختيار، ثم 10 مل من 0.22 ميكرومتر تصفيتها 50 mM NaOH في 1 N NaCl، وأخيرا 10 مل من 0.22 ميكرومتر تصفيتها DPBS. ملء غشاء الامتزاز مع الإيثانول 20٪ في DPBS للتخزين على المدى الطويل في 4 درجة مئوية.
5. التركيز و Dialyze البروتين
- إيداع جميع eluate (أو elution كسور تحتوي على البروتين كما هو محدد في الخطوة 4.3) في 10 كيلودا الوزن الجزيئي قطع وحدة تصفية الطرد المركزي. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للطرد المركزي.
- Dialyze retentate في وحدة غسيل الكلى حجم صغير (10 كيلودا خفض الوزن الجزيئي) ضد العازلة من اختيار, اتباع تعليمات الشركة المصنعة. قد تحتاج إلى إضافة المخزن المؤقت إلى المواد dialyzed إذا كان هطول الأمطار البروتين مصدر قلق. إذا رغبت في ذلك، يمكن تبريد المواد التي تم طلبها حتى يمكن تنفيذ الخطوة 6، ولكن لا ينصح بالتخزين على المدى الطويل دون المواد الحافظة.
6. تحديد وتوصيف المنتج المنقى في إجراء النشاف الغربي المعجل
- حل البروتين النقي ومعايير FC على هلام من اختيار SDS-PAGE، في ظل ظروف الحد أو غير التعليم على النحو المطلوب18-20. استخدام هلام مصغرة بدلا من هلام ميدي لتقليل وقت التشغيل.
- إذا لم تكن معروفة بالفعل، تحديد نطاق معايير FC على إشارة النطاق الذي يختلف خطيا فيما يتعلق بكمية محملة(على سبيل المثال 0.1-1 ملغ). استخدم نفس الجل وظروف التشغيل وظروف النقل والكواشف التي سيتم استخدامها لقياس البروتين النقي وتوصيفه.
- قم بتحميل كميات عينات متعددة من البروتين المنقى، بما في ذلك العينات المخففة مع DPBS، لضمان أن إشارات نطاق البروتين المنقى تقع ضمن نطاق الإشارة الخطية لمعايير Fc في تحليل الصور.
- نقل البروتينات من الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدن (PVDF) في نظام عازل متقطع باستخدام لطخة نصفمجففة 13، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لللطخة. نقل الوقت عادة 5-10 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، Coomassie وصمة عار الجل بعد نقل للتحقق من كفاءة نقل21.
- إجراء الانتفاخ المناعي مع المضادة Fc أو المضادة IgG المقترنة الفوسفاتاز القلوية (AP) أو الحصان الفجل peroxidase (HRP)، استنادا إلى تفضيل المختبر، وذلك باستخدام نظام الكشف عن البروتين بمساعدة فراغ. وقت الانتفاخ المناعي عادة أقل من ساعة واحدة.
- تطوير مناعة باستخدام الركيزة وطريقة الاختيار(مثل ركيزة AP وتعزيز chemiluminescence).
- قياس البروتين المنقى عن طريق تحليل الصورة. إجراء انحدار خطي على إشارات النطاق من معايير Fc. إذا R 2 >0.90، استخدم المعادلة للخط لحسابكميةالبروتين من إشارة الفرقة (ق). حساب لتخفيف العينة إذا لزم الأمر. منذ يتم إجراء القياس الكمي للبروتين على أساس Fc، وضبط قيمة الاختلافات الوزن الجزيئي بين البروتين وFc. إذا R2<0.90، كرر الخطوة 6 في مجملها.
- التحقق من صحة البروتين باستخدام المقايسات الوظيفية أو أساليب للكشف عن Fc عن طريق قياس التدفق الخلوي، النشاف الغربي، ELISA، الخ. بناء على تفضيل المختبر.
- تمييع البروتين إلى التركيز المطلوب و / أو إضافة أي مواد حافظة أو مثبتات مرغوبة إلى محلول البروتين النقي قبل الاقتباس للتخزين على المدى الطويل ، المجمدة أو غير ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم استخدام البروتوكول المبسط لعزل وتوصيف البروتينات المعبرة عن Fc بشكل روتيني لمعالجة البروتينات الموريميرية murine galectin-1 المنصهرة في Fc الإنسان (Gal-1hFc) من الخلايا المخففة ثقافة الخلايا الفائقة. يوضح المخطط الانسيابي في الشكل 2 سير العمل والوقت لكل خطوة في البروتوكول. بالنسبة لدفعة نموذجية من 300 مل من الناموست ، يكون إجمالي وقت المعالجة حوالي 9 ساعات عند إجراء اختبار قياس التدفق الخلوي الاختياري لكسور elution. إذا تم حذف جميع تحليل قياس التدفق الخلوي ، بسبب عدم وجود مقياس تدفق للخلايا أو تفضيل المختبر الفردي ، يمكن أن يكون إجمالي وقت المعالجة قصيرا مثل 4 ساعات. بشكل عام ، يعتمد وقت المعالجة على خبرة المشغل ، ومقدار المعالجة الفائقة ، وطرق القياس الكمي والتوصيف التي يتم إجراؤها.
تم استخدام قياس التدفق الخلوي لاختبار وجود Gal-1hFc الوظيفية(أي Gal-1 قادرة على الكشف عن ليغاندس على خلايا سرطان الثدي) في ثقافة الخلايا بدءا supernatant; خلية جديدة ثقافة متوسطة خدم كالتحكمسلبية 18,22 . مرة واحدة تم التحقق غال-1hFc في الخلايا الثقافة supernatant (الشكل 3A), تم إنجاز تحميل البروتين A غشاء الممتزات عن طريق التغلغل الفائق في 10 مل / دقيقة (مما أدى إلى سرعة سطحية أو تدفق الحجمي من 0.5 سم / دقيقة في 2 مل غشاء الممتز) باستخدام مضخة حقنة (الشكل 1). تم التقاطها بشكل فعال الغشاء الممتز والاحتفاظ غال-1hFc، وترك تدفق من خلال استنفدت أساسا من غال-1hFc (عدم وجود اختراق، الشكل 3A). غال-1hFc كان eluted من غشاء adsorber في زيادات ملليلتر واحد في 1 مل / دقيقة (تدفق الحجم = 0.05 سم / دقيقة) باستخدام المخزن المؤقت الحمضية القائمة على الأمين (الرقم الهيدروجيني 2.8)، وتم اختبار كسور elution تحييد في وقت لاحق لوجود وظيفية غال-1hFc باستخدام قياس التدفق الخلوي(الشكل 3B). إشارة Gal-1hFc زادت بشكل متسلسل من elution 1 (يساوي تقريبا السيطرة السلبية) إلى الحد الأقصى عند elution 3، ثم انخفضت إلى مستوى ثابت تقريبا في elutions 9 و 10(الشكلين 3B و 3C). لم يصل elution 10 النهائي إلى معادلة إشارة التحكم السلبية بسبب بعض الاحتفاظ الممتز ل Gal-1hFc(الشكلان 3B و 3C). غير أن هذه الخسارة اعتبرت مقبولة. كطريقة بديلة لاختبار وجود، ولكن ليس وظيفة، من غال-1hFc في حلول مختلفة، يمكن استخدام تحليل تدفق قياس الخلايا من قدرة غال-1hFc لربط البروتين حبات البوليسترين (من خلال التعرف على منطقة hFc)(الشكل 3D).
بعد اختبار كسر elution، تم تركيز elutions Gal-1hFc إيجابية 2 إلى 10 ثم dialyzed ضد DPBS للحصول على تنقية Gal-1hFc في المخزن المؤقت المطلوب. تم إجراء القياس الكمي وتوصيف Gal-1hFc المنقى في إجراء النشاف الغربي المعجل بنقل شبه مجفف والمناعة بمساعدة الفراغ. وبمقارنة إشارة Gal-1hFc بمعايير التحديد الكمي ل hFc، تم تحديد كمية ونوعية المواد المنقى(الشكلان 4A-C). وكانت كثافة الإشارة للنطاقات القياسية hFc (نطاق واحد في ~ 25 كيلودا لكل في الشكل 4A، الممرات 1-5) مرتبطة خطيا بكمية hFc الحالية(الشكل 4C). Gal-1hFc (نطاق واحد عند ~40 kDa في الشكل 4A, حارة 6) ومتدهور Gal-1hFc (نطاق واحد عند ~ 40 kDa ونطاق واحد في ~ 25 kDa في الشكل 4A, حارة 7) إشارات كانت ضمن نطاق المعايير (الشكل 4A, lanes 1-5). تم تحديد تركيز تنقية غال-1hFc(الشكل 4A، حارة 6) على أساس hFc أن يكون 450 ميكروغرام / مل عن طريق معالجة الصور (الشكل 4C). ضبط للوزن الجزيئي من غال-1hFc، وكان تركيز المواد المنقى 720 غرام / مل. وعلى النقيض من ذلك، تم تحميل الكثير من أجهزة Gal-1hFc المنقى في الممرين 6 و7 من الغرب في الشكل 4B،مما ولد إشارات تشبع نطاق معايير مركبات الكربون الهيدروفلورية أو تتجاوزه، مما يمنع القياس الكمي. بديل للنشاف الغربية، كوماسي هلامتلطيخ 21 يمكن أن تكون بمثابة فحص مراقبة الجودة السريع و / أو طريقة القياس الكمي(الشكل 4D). لاحظ أن الفرقة ~ 10 kDa ، بالإضافة إلى النطاقات ~ 25 kDa و ~ 40 kDa ، كانت موجودة في عينة Gal-1hFc المتدهورة (الشكل 4D، حارة 2). هذا النطاق هو المتدهورة غال-1hFc التي كانت غير تفاعلية مع الأجسام المضادة الكشف المستخدمة في البقع الغربية (الشكلين 4A و 4B).
بعد القياس الكمي والتوصيف النهائي ل Gal-1hFc المنقى ، تمت إضافة BSA معقمة لتحقيق تركيز BSA النهائي بنسبة 0.5٪. ثم تم نقل المواد المنقى وتخزينها عند -20 درجة مئوية. بالإضافة إلى Gal-1hFc، استخدمنا هذا البروتوكول المبسط لعزل متحولة مزدوجة غال-1hFc وغال-7hFc. ويمكن أيضا أن تمتد إلى عمليا أي جزيء التي تمتلك جزء FC (الأجسام المضادة، شظايا Fc أنفسهم، والبروتينات الانصهار Fc أخرى، الخ.من الأنواع والأنماط التي لديها تقارب للبروتين A14-17).
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 تخطيطي للجهاز التجريبي. يمكن عزل الأجسام المضادة وبروتينات الاندماج المؤتلفة التي تعبر عن شظايا Fc من IgG من المحاليل المخففة باستخدام بروتين مامتزاز غشاء. يتم توصيل الغشاء adsorber من خلال قفل Luer المناسب للمحاقن 30 مل على مضخة حقنة ، والتي تتغلغل في محلول يحتوي على البروتين من خلال غشاء الممتز بمعدل تدفق الحجم المطلوب.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم عملية سير العمل لعزل Gal-1hFc من الخلايا الثقافة الفائقة. يوضح هذا المخطط الانسيابي بروتوكول عزل وتوصيف بروتين الانصهار البيني (Gal-1hFc) من تكاثر زراعة الخلايا. بشكل عام، سوف يختلف وقت المعالجة حسب خبرة المشغل، وكمية المعالجة الفائقة، وطرق القياس الكمي والتوصيف المستخدمة.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تحليل قياس التدفق الخلوي للحلول التي تحتوي على Gal-1hFc. يستخدم قياس التدفق الخلوي لتقييم ما إذا كانت Gal-1hFc الوظيفية موجودة في وسط ثقافة الخلايا الطازجة ، وثقافات الخلايا الفائقة ، وتدفق الأغشية الممتزة من خلال ، وكسور elution. APC-اقتران F(ab')2 المضادة للإنسان Fc كان يستخدم كأجسام مضادة ثانوية. تم الحصول على جميع البيانات باستخدام FACS Aria النظام الخاص تدفق تدفق المنتج cytometer / فرز وتحليلها باستخدام برنامج FlowJo. علامات في كل رسم بياني تمثل 2٪ من السكان السيطرة السلبية (أي خلية جديدة ثقافة المتوسطة ل (A) وhFc isotype ل (ب)). (أ) تدفق تراكب الرسم البياني لقياس الخلايا من خلايا سرطان الثدي BT-20 المسمى مع الخلايا الطازجة ثقافة المتوسطة (الأحمر)، والثقافة الخلية supernatant (الأزرق)، أو تدفق الغشاء من خلال الممتز (الأخضر). احتوت ثقافة الخلية الفائقة على مستوى منخفض من Gal-1hFc الوظيفية التي ربطت بنجاح إلى جاليكتين-1 ليغنادس على خلايا BT-20، في حين أن تدفق الغشاء الطازج لثقافة الخلايا المتوسطة والأغشية من خلال تدفق Gal-1hFc، كما هو متوقع. (ب) تدفق مخططات قياس الخلايا من خلايا BT-20 المسماة بكسور elution من ممتز الغشاء. إشارة غال-1hFc على خلايا BT-20 يزيد بالتسلسل إلى الحد الأقصى في elution 4 ثم ينخفض، وإن لم يكن إلى مستوى الخلفية(أي إشارة تعادل المتوسطة ثقافة الخلية الطازجة). (ج) يمكن أيضا رسم متوسط شدة الفلورسينس للعينات في (B) كدالة لعدد كسر elution لتوليد منحنى elution. يظهر متوسط كثافة الفلورسينس للخلايا المسماة بعنصر تحكم hFc متساوي النمط كخط مرجعي. (د) بدلا من ذلك، يمكن استخدام تحليل تدفق قياس الخلايا من غال-1hFc ملزمة البروتين حبات البوليسترين لاختبار وجود البروتين، ولكن ليس وظيفة، في حلول مختلفة. APC-اقتران F(ab')2 المضادة للإنسان Fc كان يستخدم كأجسام مضادة ثانوية. اليسار: تدفق تراكب الرسم البياني لقياس الخلايا من الخلايا الطازجة المتوسطة الثقافة (الأحمر)، والثقافة الخلية supernatant (الأزرق)، وعينة عازلة فارغة (الأخضر). الوسط: الرسم البياني للتحكم في النمط المتساوي HFc. الحضانة مع 10 ملغ / مل hFc هو عنصر تحكم إيجابي للبروتين التقاط A. لوحة الحق: الرسم البياني للبروتين حبات A المحتضنة مع تنقية غال-1hFc, على أساس 10 ملغ hFc/ml. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تحديد كمي وتوصيف Gal-1hFc باستخدام النشاف الغربي وتحليل الصور. (أ) الممرات 1-5 هي معايير hFc من 0.1-0.5 ميكروغرام في زيادات 0.1 ميكروغرام، ويتم تنقية الممرات 6 و 7 غال-1hFc من اثنين من حصص الإنتاج المختلفة. تم حل العينات على هلام TGX 4-15٪ من قبل SDS-PAGE في ظل ظروف الحد، ثم نقلها إلى غشاء PVDF باستخدام ظروف نقل متقطعة. تم حظر الغشاء واحتضانه باستخدام تقنية الانتفاخ المناعي المضادة ل hIgG-AP. تم تطوير الإشارات مع كاشف ECL وتصورها على صور XRS Bio-Rad ChemiDoc. اختلفت الإشارات الخاصة بمعايير مركبات الكربون الهيدروفلورية في الممرات 1-5 خطيا (مرسومة في(C))،وكانت الإشارات لعينتي Gal-1hFc المنقىتين في الممرين 6 و7 ضمن نطاق القياس الخطي. يظهر Lane 7 شريطين، Gal-1hFc وجزء hFc المفترض، مما يشير إلى تدهور البروتين. (ب) إذا تم تحميل الكثير من تنقية Gal-1hFc، قد تشبع الإشارة أو تتجاوز نطاق الإشارة الخطية، مما يمنع القياس الكمي (الممران 6 و7). الممرات، هلام، وظروف التشغيل هي نفسها كما هو الحال في (A). (ج) يسمح برنامج تحليل مختبر الصور بإدخال كميات مطلقة معروفة من معايير مركبات الكربون الهيدروفلورية من مناعة، ثم يحدد كمية النطاق (النطاقات) غير المعروفة من خلال إشارتها بالنسبة للتراجع الخطي للمعايير (ص = 1.36 × 10-7* س + 0.105؛ R2 = 0.95). البيانات المعروضة هي من تحليل المؤامرة المناعية في (أ). (د) يمكن تقييم جودة 1hFc غال تنقية باستخدام تلطيخ Coomassie. Lane M هو علامة الوزن الجزيئي، حارة 1 هو تنقية غال-1hFc (نفس عينة حارة 6 في (أ) و (ب))، حارة 2 هو المتدهورة غال-1hFc (نفس عينة حارة 7 في (A) و (ب))، وحارة 3 هو 0.2 ملغ hFc القياسية. وكانت ظروف الجل والجري هي نفسها كما هو الحال في (أ) و (ب). انقر هنا لعرض صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا لعزل وتوصيف بروتين الاندماج الشيمي الذي يعبر عن Fc البشري (Gal-1hFc) بسرعة ، دون المساس بشكل كبير باسترداد المنتج أو تضخيم التكلفة. المكونات الرئيسية لسير العمل المبسطة هي بروتين ممتز غشاء للعزلة ، ونقل شبه مجفف والمناعة بمساعدة الفراغ لتوصيفها عن طريق النشاف الغربي.
الانخفاض الكبير في وقت المعالجة لعزل وتوصيف Gal-1hFc من 300 مل من الخلايا التناسخية (حوالي 9 ساعات في البروتوكول المبسط مقارنة ب 20 + ساعة في بروتوكول تقليدي) يعزى إلى حد كبير إلى دمج المكونات الرئيسية المذكورة أعلاه ، وخاصة ممتزاز الغشاء. عند الحد الأقصى لمعدل التدفق الموصى به وهو 10 مل فائق / دقيقة ، يمكن إكمال تحميل الغشاء الممتز في 30 دقيقة. جال-1hFc الانتعاش من البروتين A غشاء الممتزات عادة ما تتراوح بين 10-30٪ في مختبراتنا، مع ~ 30٪ الانتعاش يتحقق بشكل روتيني من قبل موظفي المختبر ذوي الخبرة عندما تركيزاتGal-1hFc في خلية الثقافة supernatant هي 5-10 ملغ / مل. على الأكثر، تم تحقيق ~ 50٪ الانتعاش. استعادة المنتج الكامل يكاد يكون مستحيلا بسبب الخسائر المتأصلة بسبب (أ) الاحتفاظ محددة من البروتين Fc التعبير عن البروتين A على غشاء adsorber (الشكلين 3B و 3C) و (ب) الامتزاز السطحي غير محددة من البروتين في جميع أنحاء العزلة. من المهم للمختبرات الفردية لتحديد ما إذا كان استرداد المنتج مع غشاء الممتز مقبولة على أساس احتياجاتهم; إذا كان تغيير معدل تدفق التحميل أو محتوى المواد الخام(على سبيل المثال، ثقافة تركيز الخلايا البروتينية المرغوبة الفائقة ، والتي قد تكون صعبة بشكل خاص) يمكن أن يحسن استرداد المنتج8، أو إذا كان تعديل بروتوكول elution (الخطوة 4) للحصول على استرداد أعلى يستحق زيادة الوقت والنفقات والجهد ، أو الضرر المحتمل للمكثف البروتين أو الغشاء نفسه (في المقام الأول عن طريق الإيلضوء العازلة درجة الحموضة ، تركيز الملح ، الخ). على النقيض من استخدام ممتزاز الغشاء ، يستغرق الأمر حوالي 10 ساعة لأداء دورتين من خلال بروتين 1 مل عمود معبأ بالخرز18بمعدل تدفق مقبول بحد أقصى 1 مل / دقيقة ، ويتم استرداد 10-20٪ فقط Gal-1hFc. كقلق أخير ، قد يؤثر تحليل تكلفة البروتين A الخرز من الشركات المصنعة المختلفة على قرار استخدام عمود قياسي معبأ بالخرز مقابل ممتز غشاء واحد. مع أخذ كل هذه العوامل في الاعتبار ، قد يوفر استخدام ممتز غشاء لعزل نطاق المختبر للبروتينات المعبرة عن Fc للمختبرات الصغيرة مزايا كبيرة على كروماتوغرافي العمود2،5،8،10.
استخدام هلام مصغرة لSDS-PAGE، ونقل نصف متقطعة الكهربائية من البروتينات من هلام لغشاء PVDF، ومكنسة بمساعدة immunoblotting توفر وفورات كبيرة في الوقت بالمقارنة مع المواد الهلامية ميدي، خزان (الرطب) نقل، ونشر القائم على المناعة للقياس الكمي وتوصيف Gal-1hFc (2 ساعة مقابل 8 ساعات). يجب على المختبرات الفردية تحديد ما إذا كان البروتوكول الغربي المعجل مناسبا للقياس الكمي وتوصيف بروتينها. وتشمل الفوائد (أ) وقت قصير للإكمال حتى من قبل موظفي المختبر عديمي الخبرة، (ب) القدرة على تحديد ما إذا كان البروتين سليما أو قد تدهور بسبب المعالجة أو التلوث(الشكل 4B)،و (ج) السهولة النسبية للقياس الكمي من خلال برامج معالجة الصور(الشكل 4C). ومع ذلك، (أ) زيادة الكواشف والتكاليف الاستهلاكية قد تكون غير مقبولة على الرغم من الوقت المقابل للأجور، (ب) قد يكون من المفضل قياس كمية البروتين التقليدية من قبل A280، ELISA، برادفورد المقايسة، أو BCA المقايسة23-27،أو (ج) مختبرات قد لا يكون الوصول إلى بقعة نصف مجففة أو نظام الكشف عن البروتين بمساعدة فراغ ل immunoblotting. في مثل هذه الحالات، تلطيخ Coomassie من SDS-PAGE حل البروتينات21(الشكل 4D) أو نقطة أو فتحة النشاف28 هي بدائل جيدة.
تم استخدام قياس التدفق الخلوي في ثلاثة اختبارات منفصلة لمدة 90 دقيقة للكشف عن Gal-1hFc الوظيفية في هذا البروتوكول المبسط(الشكل 2)، وهو نفس ما هو عليه في المعالجة التقليدية18،22. وأي طريقة توصيف أخرى مثل النشاف الغربي أو ELISA ستكون مقبولة أيضا. المقايسات الوظيفية هي الأمثل(مثل الكشف عن اللاتين galectin-1 على خلايا سرطان الثدي، الأرقام 3A-C). بدلا من ذلك، الكشف عن وحدة FC سيكون مقبولا (على غرار الشكل 3D)،ولكن لا يمكن تحديد الاحتفاظ بوظيفة البروتين المحددة بهذه الطريقة، وهو عيب كبير محتمل.
وقد استخدمت الأساليب الموصوفة هنا لعزل نطاق المختبر السريع وتوصيف بروتين الاندماج الشميري الذي يعبر عن الإنسان Fc (Gal-1hFc). يمكن تطبيق سير العمل المبسط هذا على عزل أي جزيء يمتلك جزءا من Fc (الأجسام المضادة IgG ، وبروتينات الاندماج Fc الأخرى ، وشظايا Fc نفسها ، وما إلى ذلك)ويمكن تعديله بسهولة استنادا إلى تفضيلات المختبر الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا البروتوكول سريع وسهل نسبيا ، حتى بالنسبة لموظفي المختبر ذوي الخبرة المحدودة أو عديمي الخبرة تماما ، مما يجعله مناسبا للاستخدام في برامج البيولوجيا والكيمياء والهندسة الكيميائية (الحيوية) في المدرسة الثانوية أو الكلية التي تغطي مبادئ عزل البروتين وتوصيفه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد شيء للكشف عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يشكرا السيد لويس ف. دلغاديو (قسم الهندسة الكيميائية والجزئية الحيوية، جامعة أوهايو)، والسيد ماثيو ويليامز (قسم الهندسة الكيميائية والجزيئات الحيوية، جامعة أوهايو)، والدكتور فيليبرتو سيدينو - لوران (مستشفى بريغهام ومستشفى النساء وكلية الطب بجامعة هارفارد) على المساعدة التقنية الخبيرة. الكتاب أيضا أن أشكر شتاء 2011 CHE 404/BME 504 و خريف 2012 CHE 4830/BME 5830 الطلاب (قسم الهندسة الكيميائية والبيولوجية الجزيئية وبرنامج الهندسة الطبية الحيوية, جامعة أوهايو) للحصول على المشورة التقنية والمناقشة. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) منحة أدوات البحوث الرئيسية CBET-1039869 (MMB)، NSF CBET-1106118 (MMB)، منحة أبحاث مؤسسة الأمراض الجلدية A050422 (SRB)، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة NCI 1R15CA 161830-01 (MMB)، زمالة ما بعد الدكتوراه NIH Kirschstein-NRSA F32CA144219-01A1 (SRB)، NIH/NCI R01CA173610 (CJD)، ومنحة NIH NCCAM R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P.
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S.
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M.
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T.
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al.
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
