בידוד ואפיון של חלבונים דוברי Fc אנושיים כימריים באמצעות חלבון ספיחה ממברנה וזרימת עבודה יעילה
Summary
בהשוואה לכרומטוגרפיה מסורתית של זיקה באמצעות חלבון עמודים עמוסי חרוזים A, חלבון ספיחה קרום A יכולה להאיץ באופן משמעותי בידוד בקנה מידה מעבדתי של נוגדנים וחלבונים אחרים המבטאים שברי Fc. שיטות ניתוח וכימות מתאימות יכולות להאיץ עוד יותר את עיבוד החלבון, ולאפשר השלמת בידוד/אפיון ביום עבודה אחד, במקום 20+ שעות עבודה.
Abstract
סולם מעבדה לטיהור בקנה מידה תעשייתי של biomolecules מתרבות התא supernatants ופתרונות תאים lysed ניתן להשיג באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. בעוד כרומטוגרפיה זיקה באמצעות חלבון נקבובי חרוזי agarose ארוזים בעמודים היא ללא ספק השיטה הנפוצה ביותר של בידוד בקנה מידה מעבדה של נוגדנים וחלבונים רקומביננטיים המבטאים שברי Fc של IgG, זה יכול להיות תהליך זמן רב ויקר. מגבלות זמן ופיננסים מרתיעות במיוחד במעבדות מדע בסיסיות קטנות שחייבות לשחזר מאות מיקרוגרם לכמויות מיליגרם של חלבון מפתרונות מדוללים, אך חסרות גישה למערכות אספקת נוזלים בלחץ גבוה ו/או כוח אדם עם מומחיות בביו-ספרות. יתר על כן, כימות ואפיון המוצר עשוי גם להאריך יתר על המידה את זמן העיבוד על פני מספר ימי עבודה ולנפח הוצאות (חומרים מתכלים, שכר וכו ‘). לכן, פרוטוקול מהיר, זול, אך יעיל נדרש לבידוד בקנה מידה מעבדה ואפיון של נוגדנים וחלבונים אחרים בעלי שבר FC. למטרה זו, פיתחנו פרוטוקול שניתן להשלים על ידי צוות טכני בעל ניסיון מוגבל בפחות מ 9 שעות (בערך יום עבודה אחד) ובמהירות של 4 שעות, בניגוד לשיטות מסורתיות הדורשות 20 + שעות עבודה. רוב הציוד הנדרש זמין בקלות במעבדות הנדסה ביו-רפואית סטנדרטיות, ביוכימיה ו(ביו), וכל ריאגנטים זמינים מסחרית. כדי להדגים פרוטוקול זה, מוצגות תוצאות מייצגות שבהן כימרי מורין galectin-1 התמזגו Fc האנושי (Gal-1hFc) מתרבות התא supernatant היה מבודד באמצעות חלבון ספיחה קרום A. גל-1hFc מטוהרת כובתה באמצעות הליך ניתוח כתמים מערבי מזורז והתאפיינה באמצעות ציטומטריית זרימה. ניתן לשנות את זרימת העבודה היעילה עבור חלבונים אחרים המבטאים Fc, כגון נוגדנים, ו/או לשנות אותה כך שישלבו שיטות כימות ואפיון חלופיות.
Introduction
בידוד של נוגדנים וחלבונים רקומביננטיים המבטאים שברי אימונוגלובולין G (IgG) Fc מתרבות התאים supernatants ופתרונות תאים מדוללים lysed ניתן להשיג באמצעות חלבון כרומטוגרפיה זיקה. במעבדות ובתעשייה בסיסיות של מדע והנדסה, עמודים עמוסים בחלבון נקבובי A מצופה agarose, זכוכית, או חרוזים פולימריים משמשים בדרך כלל עבור כרומטוגרפיה זיקה, למרות עלויות כספיות גבוהות וזמני עיבוד ארוכים1-3. זה מוערך היטב כי כרומטוגרפיה זיקה מייצגת את ההוצאה הגדולה ביותר ועיבוד צוואר בקבוק הן במעבדה והן בהגדרות תעשייתיות2,4. כתוצאה מכך, שיפורים רבים פותחו כדי להקטין את עלות זמן העיבוד מבלי להקריב את התאוששות המוצר הכוללת מרכבת התהליך1,2,5-7. מבטיח במיוחד לבידוד של נוגדנים וחלבונים אחרים מבטא Fc הוא כרומטוגרפיה זיקה באמצעות חלבון ספיחה קרום2,5,7-10. בעוד לכידת Fc ב chromatography עמודה הוא דיפוזיה מוגבלת(כלומר Fc-expressing חלבון חייב להתפזר לתוך ובאמצעות נקבוביות פנימיות כדי להגיע לרוב החלבון A) עם ירידה בלחץ גבוה על פני העמודה, הסעת המונים ספיחה ממברנה מונעת על ידי הסעה בתפזורת, וכתוצאה מכך הימנעות מגבלות דיפוזיה8,9,11,12. בנוסף, ירידה בלחץ על פני ספיחה ממברנה נמוכה, ובכך מאפשר קצב זרימת זלוף מהיר יותר לעומת עמודים ארוזים חרוזים8,9,11,12. לכן, עבור בידוד בקנה מידה מעבדה, כרומטוגרפיה קרום צפוי להפחית את זמן הבידוד על ידי מספר שעות ולהגדיל את לכידת המוצר לעומת כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, מודלים מתמטיים עבור ספיחה IgG ספיחה ממברנה הוצעו8,9,11,12, ובכך מאפשר למשתמשי קצה לחזות ביצועים במעבדה.
צוואר בקבוק נוסף במעבדות מדע והנדסה בסיסיות הוא אפיון החלבון המבטא Fc. עם זאת, בחירת שיטות מתאימות להשלמת מבחני אפיון, כגון כתמים מערביים, יכולה להפחית מאוד את הזמן המושקע בבדיקות מוצרים. לדוגמה, העברה חלקית במערכת חיץ רציפה יכולה להשיג העברה אלקטרופורטית של חלבונים מג’ל SDS-PAGE לקרום פוליוויניל דיפלוורידין (PVDF) תוך דקות ספורות, לעומת העברה של שעה-שעתיים במיכל (רטוב) במערכת חיץ רציפה13.
פרוטוקול מהיר, זול ויעיל לבידוד ואפיון של חלבון היתוך כימרי המבטא שבר FC של IgG אנושי מתואר בזאת. רוב הציוד זמין בקלות במעבדות הנדסה ביו-רפואית בסיסיות סטנדרטיות, ביולוגיה, כימיה ו(ביו), וכל ריאגנטים זמינים מסחרית. למרות שתוצאות מייצגות נוצרו מבידוד ואפיון של חלבון היתוך כימרי של Murine galectin-1/Human Fc (Gal-1hFc), ניתן להחיל את הפרוטוקול היעיל על בידוד של מולקולות אחרות בעלות שבר Fc, כגון נוגדנים, שברי Fc עצמם, או חלבוני היתוך Fc אחרים. השיפורים שלנו הפחיתו באופן דרמטי את זמן העיבוד (עד 4 שעות אך בדרך כלל ~ 9 שעות, לעומת 20 + שעות עבודה) תוך השגת התאוששות מוצר דומה או משופרת בהשוואה לשיטות סטנדרטיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר בזאת פותח כדי לבודד במהירות ולאפיין חלבון היתוך כימרי המבטא Fc אנושי (Gal-1hFc), מבלי להתפשר באופן משמעותי על התאוששות המוצר או עלות ניפוח. המרכיבים העיקריים של זרימת העבודה היעילה הם חלבון ספיחה ממברנה לבידוד, והעברה חלקית ואימונובליקה בסיוע ואקום לאפיון על ידי סופג מערבי.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למר לואיס פ. דלגאדיו (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית, אוניברסיטת אוהיו), למר מתיו ויליאמס (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית, אוניברסיטת אוהיו), ולד”ר פיליברטו סדנו-לורן (בית החולים בריגהם ונשים ובית הספר לרפואה של הרווארד) על סיוע טכני מומחה. המחברים גם מבקשים להודות חורף 2011 CHE 404/BME 504 וסתיו 2012 CHE 4830/BME 5830 סטודנטים (המחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית ותכנית הנדסה ביו רפואית, אוניברסיטת אוהיו) עבור ייעוץ טכני ודיון. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF) מענק מכשור מחקר גדול CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), מענק מחקר קרן דרמטולוגיה A050422 (SRB), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק NCI 1R15CA161 830-01 (MMB), NIH קירששטיין-NRSA פוסט דוקטורט מלגת F32CA144219-01A1 (SRB), NIH / NCI R01CA173610 (CJD), ו NIH NCCAM מענק R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O’Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O’Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
