Isolation und Charakterisierung von chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow
Summary
Im Vergleich zur traditionellen Affinitätschromatographie mit Protein A Agarose Perlen-verpackten Säulen können Protein-A-Membranadsorber die Isolation von Antikörpern und anderen Fc-Fragment-exemittierenden Proteinen im Labormaßstab erheblich beschleunigen. Geeignete Analyse- und Quantifizierungsmethoden können die Proteinverarbeitung weiter beschleunigen, so dass die Isolierung/Charakterisierung an einem Werktag statt an mehr als 20 Arbeitsstunden abgeschlossen werden kann.
Abstract
Laborwaage numerativ zur industriellen Reinigung von Biomolekülen aus Zellkulturüberstand und Lysed-Zell-Lösungen kann mit Affinitätschromatographie durchgeführt werden. Während die Affinitätschromatographie mit porösem Protein A AgarosePerlen, die in Säulen verpackt sind, wohl die häufigste Methode zur Isolierung von Antikörpern und rekombinanten Proteinen im Labor maßstabsgetreu ist, die Fc-Fragmente von IgG exdrücken, kann es ein zeitaufwändiger und teurer Prozess sein. Zeit- und Finanzzwänge sind besonders beängstigend in kleinen wissenschaftlichen Grundlagenlabors, die Hunderte von Mikrogramm bis Milligramm Proteinmengen aus verdünnten Lösungen zurückgewinnen müssen, aber keinen Zugang zu Hochdruck-Flüssigkeitsabgabesystemen und/oder Personal mit Expertise in Bioseparationen haben. Darüber hinaus kann die Produktquantifizierung und -charakterisierung auch die Bearbeitungszeit über mehrere Arbeitstage hinaus übermäßig verlängern und die Ausgaben (Verbrauchsmaterialien, Löhne usw.)aufblähen. Daher ist ein schnelles, kostengünstiges und dennoch effektives Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Antikörpern und anderen Proteinen, die ein Fc-Fragment besitzen, erforderlich. Zu diesem Zweck haben wir ein Protokoll entwickelt, das von technischem Personal mit begrenzter Erfahrung in weniger als 9 Stunden (ungefähr einen Arbeitstag) und bis zu 4 Stunden abgeschlossen werden kann, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die mehr als 20 Arbeitsstunden erfordern. Die meisten benötigten Geräte sind in standardbiomedizinischen, biochemischen und (bio-)chemischen Engineering-Labors leicht verfügbar, und alle Reagenzien sind im Handel erhältlich. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, werden repräsentative Ergebnisse präsentiert, in denen chimäres murinisches Galant-1 mit dem menschlichen Fc (Gal-1hFc) aus Zellkulturüberstand verschmolzen wurde, mit einem Protein-A-Membranadsorber isoliert wurde. Gereinigte Gal-1hFc wurde mit einem beschleunigten Western Blotting-Analyseverfahren quantifiziert und mit Durchflusszytometrie charakterisiert. Der optimierte Workflow kann für andere Fc-exzessiven Proteine, wie Antikörper, geändert und/oder geändert werden, um alternative Quantifizierungs- und Charakterisierungsmethoden zu integrieren.
Introduction
Die Isolierung von Antikörpern und rekombinanten Proteinen, die Immunglobulin G (IgG) fc-Fragmente aus Zellkulturüberstand und verdünnten lysierten Zelllösungen exemitzenen, kann mit Hilfe der Protein-A-Affinitätschromatographie erreicht werden. In wissenschaftlichen und technischen Grundlagenlaboren und der Industrie werden Säulen, die mit porösem Protein A-beschichteter Agarose, Glas oder Polymerperlen verpackt sind, am häufigsten für die Affinitätschromatographie verwendet, trotz hoher finanzieller Kosten und langer Verarbeitungszeiten1-3. Es ist sehr zu schätzen, dass die Affinitätschromatographie den größten Aufwands- und Verarbeitungsengpass sowohl im Labor als auch in der Industrie darstellt2,4. Als Ergebnis wurden zahlreiche Verbesserungen entwickelt, um Kosten und Verarbeitungszeit zu senken, ohne die gesamte Produktrückgewinnung aus dem Prozesszug1,2,5-7zu opfern. Besonders vielversprechend für die Isolierung von Antikörpern und anderen Fc-exemittierenden Proteinen ist die Affinitätschromatographie mit einem Protein A Membranadsorber2,5,7-10. Während die Fc-Capture in der Säulenchromatographie diffusionsbegrenzt ist(d.h. das Fc-extierende Protein muss in und durch die inneren Poren diffundieren, um den Großteil des Proteins A zu erreichen) mit hohem Druckabfall über die Säule, wird der Massentransport in Membranadsorbern durch Massenkonvektion angetrieben, was zur Vermeidung von Diffusionsbeschränkungen8,9,11,12führt. Darüber hinaus ist der Druckabfall über den Membranadsorber gering, was eine schnellere Durchblutung im Vergleich zu perlenverpackten Säulen8,9,11,12ermöglicht. Daher wird für die Isolierung von Laborskalen prognostiziert, dass die Membranchromatographie die Isolationszeit um mehrere Stunden reduziert und die Produkterfassung im Vergleich zur Säulenchromatographie erhöht. Darüber hinaus wurden mathematische Modelle für die IgG-Adsorption in Membranadsorbern8,9,11,12vorgeschlagen, so dass Endbenutzer die Leistung im Labor vorhersagen können.
Ein weiterer Engpass in wissenschaftlichen und technischen Grundlagenlaboren ist die Charakterisierung des Fc-exemittigen Proteins. Die Auswahl geeigneter Methoden zum Abschließen von Charakterisierungstests, wie westlichen Flecken, kann jedoch den Zeitaufwand für Produkttests erheblich reduzieren. Zum Beispiel kann die semitrockene Übertragung in einem diskontinuierlichen Puffersystem den elektrophoretischen Transfer von Proteinen von einem SDS-PAGE-Gel auf eine Polyvinyldifluoridin -Membran (PVDF) in wenigen Minuten erreichen, im Gegensatz zu 1-2 Stunden im Tank (Nasstransfer) in einem kontinuierlichen Puffersystem13.
Ein schnelles, kostengünstiges und effektives Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung eines chimerischen Fusionsproteins, das ein Fc-Fragment menschlichen IgG ausdrückt, wird hierin beschrieben. Die meisten Geräte sind in grundlegenden biomedizinischen Grundlagen, Biologie, Chemie und (Bio-)Chemie-Engineering-Labors leicht verfügbar, und alle Reagenzien sind im Handel erhältlich. Obwohl repräsentative Ergebnisse aus der Isolierung und Charakterisierung eines murinen Galectin-1/menschlichen Fc chimeric Fusion Protein (Gal-1hFc) generiert wurden, kann das gestraffte Protokoll auf die Isolierung anderer Moleküle angewendet werden, die ein Fc-Fragment besitzen, wie Antikörper, Fc-Fragmente selbst oder andere Fc-Fusionsproteine. Unsere Verbesserungen verringerten die Verarbeitungszeit drastisch (nur 4 Stunden, aber in der Regel 9 Stunden, im Vergleich zu 20+ Arbeitsstunden) und erreichten gleichzeitig eine ähnliche oder verbesserte Produktwiederherstellung im Vergleich zu Standardmethoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um ein chimäres Fusionsprotein, das den menschlichen Fc (Gal-1hFc) exzeichnet, schnell zu isolieren und zu charakterisieren, ohne die Produktrückgewinnung oder die Aufblähungskosten erheblich zu beeinträchtigen. Die wichtigsten Komponenten des optimierten Workflows sind ein Protein-A-Membranadsorber für die Isolierung sowie semidry transfer und vakuumunterstütztes Immunoblotting zur Charakterisierung durch Western Blotting.
Die dramatisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Herrn Luis F. Delgadillo (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University), Herrn Matthew H. Williams (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University) und Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women es Hospital und Harvard Medical School) für die technische Unterstützung von Experten. Die Autoren danken auch den Studenten des Winter 2011 CHE 404/BME 504 und des Herbst 2012 CHE 4830/BME 5830 (Department of Chemical and Biomolecular Engineering and Biomedical Engineering Program, Ohio University) für technische Beratung und Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Major Research Instrumentation Grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI Grant 1R15CA1 61830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoktorandenstipendium F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) und NIH NCCAM-Stipendium R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
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