Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow
Summary
In vergelijking met traditionele affiniteitschromatografie met behulp van eiwit A agarose kraal-verpakte kolommen, eiwit A membraan adsorbers kunnen aanzienlijk versnellen laboratorium-schaal isolatie van antilichamen en andere Fc fragment-expresserende eiwitten. Geschikte analyse- en kwantificeringsmethoden kunnen de eiwitverwerking verder versnellen, waardoor isolatie/karakterisering in één werkdag kan worden voltooid, in plaats van 20+ werkuren.
Abstract
Laboratoriumschaal tot industriële schaalzuivering van biomoleculen uit celkweeksupernatanten en lysed cell-oplossingen kan worden bereikt met behulp van affiniteitschromatografie. Hoewel affiniteitschromatografie met poreus eiwit A-agarose kralen verpakt in kolommen misschien wel de meest voorkomende methode is voor laboratoriumschaalisolatie van antilichamen en recombinante eiwitten die Fc-fragmenten van IgG uitdrukken, kan het een tijdrovend en duur proces zijn. Tijds- en financiële beperkingen zijn vooral ontmoedigend in kleine basiswetenschappelijke laboratoria die honderden microgrammen tot milligram eiwit moeten terugwinnen uit verdunde oplossingen, maar geen toegang hebben tot hogedruksystemen voor vloeistofafgifte en/of personeel met expertise in bioseparaties. Bovendien kan productkwantificering en karakterisering ook de verwerkingstijd over meerdere werkdagen te lang verlengen en de kosten (verbruiksgoederen, lonen, enz.)opblazen. Daarom is een snel, goedkoop, maar effectief protocol nodig voor laboratoriumschaalisolatie en karakterisering van antilichamen en andere eiwitten die een Fc-fragment bezitten. Hiervoor hebben we een protocol opgesteld dat kan worden ingevuld door technisch personeel met beperkte ervaring in minder dan 9 uur (ongeveer één werkdag) en zo snel als 4 uur, in tegenstelling tot traditionele methoden die meer dan 20 werkuren vereisen. De meeste benodigde apparatuur is direct beschikbaar in standaard biomedische wetenschap, biochemie en (bio)chemische engineering labs, en alle reagentia zijn in de handel verkrijgbaar. Om dit protocol aan te tonen, worden representatieve resultaten gepresenteerd waarin chimerische muriene galectine-1 gesmolten tot menselijke Fc (Gal-1hFc) uit celkweek supernatant werd geïsoleerd met behulp van een eiwit A membraanadsorber. Gezuiverde Gal-1hFc werd gekwantificeerd met behulp van een versnelde westerse blotting analyse procedure en gekenmerkt met behulp van flow cytometrie. De gestroomlijnde workflow kan worden aangepast voor andere Fc-uitdrukkende eiwitten, zoals antilichamen, en/of worden gewijzigd om alternatieve kwantificerings- en karakteriseringsmethoden op te nemen.
Introduction
Isolatie van antilichamen en recombinante eiwitten die immunoglobuline G (IgG) uitdrukken Fc-fragmenten van celkweeksupernatanten en verdunde lysed cell-oplossingen kan worden bereikt met behulp van eiwit A affiniteitschromatografie. In basiswetenschappen en technische laboratoria en industrie worden kolommen vol poreuze eiwitten met A-gecoate agarose, glas of polymere kralen het meest gebruikt voor affiniteitschromatografie, ondanks hoge financiële kosten en lange verwerkingstijden1-3. Het wordt zeer gewaardeerd dat affiniteitschromatografie het grootste kosten- en verwerkingsknelpunt vormt in zowel laboratorium- als industriële omgevingen2,4. Als gevolg hiervan zijn tal van verbeteringen ontwikkeld om de kosten en verwerkingstijd te verlagen zonder in te boeten aan algehele productterugwinning van de procestrein1,2,5-7. Bijzonder veelbelovend voor de isolatie van antilichamen en andere Fc-uitdrukkende eiwitten is affiniteitschromatografie met behulp van een eiwit A membraanadsorber2,5,7-10. Terwijl de fc-afvang in kolomchromatografie diffusiebeprijzingsbeïnvloeding is (d.w.z. het Fc-uitdrukkende eiwit moet diffuus zijn in en door interne poriën om het grootste deel van het eiwit A te bereiken) met een hoge drukval over de kolom, wordt massatransport in membraanadsorbers aangedreven door bulkconvectie, wat resulteert in het vermijden van diffusiebeperkingen8,9,11,12. Bovendien is de drukval over de membraanadsorber laag, waardoor snellere perfusiedebieten mogelijk zijn in vergelijking met met kralen gevulde kolommen8,9,11,12. Voor laboratoriumschaalisolatie wordt dus voorspeld dat membraanchromatografie de isolatietijd met enkele uren zal verkorten en de productopname zal verhogen in vergelijking met kolomchromatografie. Bovendien zijn wiskundige modellen voor IgG-adsorptie in membraanadsorbers voorgesteld8,9,11,12, waardoor eindgebruikers de prestaties in het lab kunnen voorspellen.
Een ander knelpunt in basiswetenschappelijke en technische laboratoria is de karakterisering van het Fc-uitdrukkende eiwit. De selectie van geschikte methoden om karakteriseringstests, zoals westerse vlekken, te voltooien, kan de tijd die aan producttests wordt besteed echter aanzienlijk verminderen. Semidry-overdracht in een discontinu buffersysteem kan bijvoorbeeld elektroforetische overdracht van eiwitten van een SDS-PAGE-gel naar een polyvinyldifluoridine (PVDF) membraan in een kwestie van minuten bereiken, in tegenstelling tot 1-2 uur in tank (natte) overdracht in een continu buffersysteem13.
Een snel, goedkoop en effectief protocol om een chimerisch fusie-eiwit te isoleren en te karakteriseren dat een Fc-fragment van menselijke IgG uitdrukt, wordt hierin beschreven. De meeste apparatuur is direct beschikbaar in standaard basis biomedische wetenschap, biologie, chemie en (bio)chemische engineering labs, en alle reagentia zijn in de handel verkrijgbaar. Hoewel representatieve resultaten werden gegenereerd uit de isolatie en karakterisering van een murien galectine-1/menselijk Fc chimerisch fusie-eiwit (Gal-1hFc), kan het gestroomlijnde protocol worden toegepast op de isolatie van andere moleculen die een Fc-fragment bezitten, zoals antilichamen, Fc-fragmenten zelf of andere Fc-fusie-eiwitten. Onze verbeteringen verminderden de verwerkingstijd drastisch (slechts 4 uur maar meer typisch ~ 9 uur, vergeleken met 20 + werkuren) terwijl we vergelijkbare of verbeterde productherstel bereikten in vergelijking met standaardmethoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierin beschreven protocol is ontwikkeld om snel een chimerisch fusie-eiwit te isoleren en te karakteriseren dat menselijke Fc (Gal-1hFc) uitdrukt, zonder het herstel van het product of de opblaaskosten aanzienlijk in gevaar te brengen. De belangrijkste componenten van de gestroomlijnde workflow zijn een eiwit A membraanadsorber voor isolatie, en semidry transfer en vacuüm-ondersteunde immunoblotting voor karakterisering door western blotting.
De dramatische afname van de verwerkingstijd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de heer Luis F. Delgadillo (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University), mr. Matthew H. Williams (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University) en Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School) bedanken voor deskundige technische bijstand. De auteurs willen ook de che 404/BME 504 van de winter 2011 en de studenten che 4830/BME 5830 (Department of Chemical and Biomolecular Engineering and Biomedical Engineering Program, Ohio University) bedanken voor technisch advies en discussie. Dit werk werd ondersteund door National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI grant 1R15CA1618 30-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctorale Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) en NIH NCCAM-beurs R01AT004628 (CJD).
Materials
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12–A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O’Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O’Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
