Summary
Sammenlignet med traditionel affinitetskromatografi ved hjælp af protein A agarose perlepakkede søjler kan protein A-membrane adsorbere betydeligt fremskynde laboratorieskala isolering af antistoffer og andre FC fragment-udtrykke proteiner. Passende analyse- og kvantificeringsmetoder kan yderligere fremskynde proteinforarbejdningen, så isolation/karakterisering kan gennemføres på én arbejdsdag i stedet for 20+ arbejdstimer.
Abstract
Laboratorieskala til industriel rensning af biomolekyler fra cellekultur supernatants og lysed celleopløsninger kan opnås ved hjælp af affinitetskromatografi. Mens affinitet kromatografi ved hjælp af porøse protein A agarose perler pakket i kolonner er velsagtens den mest almindelige metode til laboratorieskala isolering af antistoffer og rekombinant proteiner udtrykke Fc fragmenter af IgG, kan det være en tidskrævende og dyr proces. Tid og finansielle begrænsninger er især skræmmende i små grundlæggende videnskab labs, der skal inddrive hundredvis af mikrogram til milligram mængder af protein fra fortyndede løsninger, men mangler adgang til højtryksvæske leveringssystemer og / eller personale med ekspertise i bioseparationer. Desuden kan produktkvantificering og karakterisering også forlænge behandlingstiden for meget over flere arbejdsdage og oppuste udgifterne (forbrugsvarer, lønninger osv.). Derfor er der brug for en hurtig, billig, men effektiv protokol til laboratorieskalaisolering og karakterisering af antistoffer og andre proteiner, der besidder et Fc-fragment. Til dette formål har vi udarbejdet en protokol, der kan udfyldes af teknisk personale med begrænset erfaring på mindre end 9 timer (ca. en arbejdsdag) og så hurtigt som 4 timer, i modsætning til traditionelle metoder, der kræver 20 + arbejdstid. Det meste nødvendige udstyr er let tilgængeligt i standard biomedicinsk videnskab, biokemi og (bio)kemitekniske laboratorier, og alle reagenser er kommercielt tilgængelige. For at demonstrere denne protokol præsenteres repræsentative resultater, hvor kimær murine galectin-1 smeltet til human Fc (Gal-1hFc) fra cellekultur supernatant blev isoleret ved hjælp af et protein A membran adsorber. Renset Gal-1hFc blev kvantificeret ved hjælp af en fremskyndet vestlig blotting analyseprocedure og karakteriseret ved hjælp af flow cytometry. Den strømlinede arbejdsgang kan ændres for andre Fc-udtrykkende proteiner, såsom antistoffer, og / eller ændres til at omfatte alternative kvantificerings- og karakteriseringsmetoder.
Introduction
Isolering af antistoffer og rekombinante proteiner, der udtrykker immunglobulin G (IgG) Fc fragmenter fra cellekultur supernatants og fortyndet lyserede celleopløsninger kan opnås ved hjælp af protein A affinitet kromatografi. I grundlæggende videnskabs- og ingeniørlaboratorier og industri anvendes kolonner fyldt med porøst protein A-belagt agarose, glas eller polymere perler oftest til affinitetskromatografi på trods af høje økonomiske omkostninger og lange behandlingstider1-3. Det er godt værdsat, at affinitetskromatografi repræsenterer den største udgift og behandling af flaskehals i både laboratorie- og industrimiljøer2,4. Som følge heraf er der udviklet en lang række forbedringer for at reducere omkostninger og behandlingstid uden at ofre den samlede produktgenvinding fra procestoget1,2,5-7. Særligt lovende for isolering af antistoffer og andre Fc-udtrykke proteiner er affinitet kromatografi ved hjælp af et protein A membran adsorber2,5,7-10. Mens Fc indfangning i kolonnekromatografi er diffusionsbegrænset (dvs. at det fc-udtrykkende protein skal spredes ind i og gennem indvendige porer for at nå størstedelen af proteinet A) med højt trykfald over kolonnen, er massetransport i membran adsorbere drevet af bulk konvektion, hvilket resulterer i undgåelse af diffusionsbegrænsninger8,9,11,12. Derudover er trykfaldet på tværs af membranens adsorber lavt, hvilket muliggør hurtigere perfusionsflowhastigheder sammenlignet med perlepakkede kolonner8,9,11,12. For laboratorieskalaisolering forventes membrankromatografi således at reducere isolationstiden med flere timer og øge produktfangst sammenlignet med kolonnekromatografi. Desuden er matematiske modeller for IgG adsorption i membran adsorbere blevet foreslået8,9,11,12, hvilket giver slutbrugerne mulighed for at forudsige ydeevnen i laboratoriet.
En anden flaskehals i grundlæggende videnskab og teknik laboratorier er karakteriseringen af Fc-udtrykke protein. Men, udvælgelse af passende metoder til at fuldføre karakterisering assays, såsom vestlige blots, kan i høj grad reducere den tid, der bruges på produkttest. For eksempel kan halvdry-overførsel i et diskontinuerligt buffersystem udføre elektrofobtisk overførsel af proteiner fra en SDS-PAGE gel til en polyvinyldifluoridin (PVDF) membran i løbet af få minutter i modsætning til 1-2 timers tankoverførsel (våd) overførsel i et kontinuerligt buffersystem13.
En hurtig, billig og effektiv protokol til at isolere og karakterisere et kimært fusionsprotein, der udtrykker et Fc-fragment af menneskelig IgG, er beskrevet heri. Det meste udstyr er let tilgængeligt i grundlæggende biomedicinsk videnskab, biologi, kemi og (bio)kemitekniske laboratorier, og alle reagenser er kommercielt tilgængelige. Selv om repræsentative resultater blev genereret fra isolation og karakterisering af en murine galectin-1/human Fc kimære fusion protein (Gal-1hFc), den strømlinede protokol kan anvendes til isolering af andre molekyler, der besidder en Fc fragment, såsom antistoffer, Fc fragmenter selv, eller andre Fc fusion proteiner. Vores forbedringer reducerede behandlingstiden dramatisk (så få som 4 timer, men mere typisk ~ 9 timer sammenlignet med 20 + arbejdstimer), samtidig med at vi opnåede lignende eller forbedret produktgendannelse sammenlignet med standardmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kontroller affiniteten for protein A
- Kontroller, at det Fc-udtrykkende protein (rekombinant fusionsprotein eller IgG-antistof, herunder benævnt "protein") har acceptabel affinitet for protein A14-17, inden proteinet A-membrane adsorber anvendes, og test for tilstedeværelsen af proteinet i stamopløsningen(f.eks. cellekulturens supernatant afklaret ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min. til pellet suspenderede celler). Brug flowcytometri, vestlig blotting, ELISA osv. at opdage proteinfunktion og/eller tilstedeværelse af Fc, baseret på laboratoriepræference. Ideelt set kvantificere proteinet i cellekulturen supernatant (trin 6) for at undgå at overskride protein A membran adsorber kapacitet. Fortsæt, hvis der opdages protein.
2. Forbered Protein A Membrane Adsorber og Cell Kultur Supernatant
- Følg producentens anvisninger for at forberede membranen adsorber. Lad aldrig luft komme ind i membranen adsorber. Alle opløsninger, der er perfunderet gennem membranens adsorber, skal være ved stuetemperatur og forfiltreret med et 0,22 μm filter. Fyld en 10 ml sprøjte med 0,22 μm-filtreret Dulbeccos fosfatbufferet saltvand (DPBS) eller buffer efter eget valg og udledningsluftbobler. Perfuse DPBS for at fjerne opbevaringsopløsningen og for at afbalancere membran adsorberen umiddelbart før brug.
- Cellkulturens supernatant filtreres umiddelbart før perfusion gennem membran adsorberen ved hjælp af en vakuumdrevet steril filtreringsenhed på 0,22 μm.
3. Læg protein A Membran adsorber
- Aspirat cellekultur supernatant i en Luer Lock sprøjte (30 ml eller større), og udledning eventuelle luftbobler.
- Materialer og udstyr samles som vist i figur 1. Tilslut sprøjten til membranens adsorber. Fastgør fleksibel slange til membranens adsorberudtag. Hvis det ønskes, skal du placere et 0,22 μm sprøjtefilter mellem sprøjten og membran adsorberen. Brug en kolbe eller flaske til at fange flow igennem (også kendt som filtrat), fra adsorberen.
- Sæt sprøjtepumpen til den ønskede volumenstrømshastighed, men overstiger ikke producentens anbefalede strømningshastighed(f.eks. 10 ml/min. ). Perfuse cellekulturen supernatant gennem membranen adsorber, indsamling flow igennem i et bægerglas eller anden beholder. Lad sprøjten med supernatants nødvendige.
- Hvis det ønskes, teste strømmen igennem for tilstedeværelsen af protein ved hjælp af flow cytomi, vestlige blotting, ELISA, etc. baseret på laboratoriepræference. Det er typisk unødvendigt at reperfuse strømmen igennem.
4. Elute Protein fra membranen Adsorber
- Membranen adsorber med 10 ml DPBS for at fjerne eventuelle ikke-bundne protein.
- Eluteprotein fra membranens adsorber ved den ønskede strømningshastighed(f.eks. 1 ml/min) ved hjælp af 10-15 ml elueringsbuffer(f.eks. aminbaseret elueringsbuffer (pH 2.8)). Eluat fanges i et rør, der indeholder neutraliserende buffer(f.eks. 1 M Tris (pH 9.4)) ved 10% af el-volumen (1,0-1,5 ml).
- Alternativt kan eluteprotein i en ml-trins til rør, der indeholder 100 μl neutraliseringsbuffer, ved hjælp af et samlet volumen på 10-15 ml elueringsbuffer. Brug den foretrukne karakteriseringsmetode til at teste hver fraktion for tilstedeværelsen af protein.
- Regenerere membranen adsorber i henhold til producentens anvisninger. 10 ml μm-filtreret DPBS eller buffer efter eget valg, derefter 10 ml 0,22 μm-filtreret 50 mM NaOH i 1 N NaCl og endelig 10 ml 0,22 μm-filtrerede DDPBS. Fyld membranen adsorber med 20% ethanol i DPBS til langtidsopbevaring ved 4 ºC.
5. Koncentrer og dialyze proteinet
- Aflejr alle eluat (eller elueringsfraktioner, der indeholder protein som bestemt i trin 4.3) i en 10 kDa molekylær vægtafskærings centrifugalfilterenhed. Følg producentens anvisninger for centrifugering.
- Dialyze retentatet i en lille volumen dialyse enhed (10 kDa molekylvægt cut-off) mod buffer valg, efter producentens anvisninger. Buffer kan være nødvendigt at tilføje til dialyzed materiale, hvis protein nedbør er et problem. Hvis det ønskes, kan det dialyzed materiale nedkøles, indtil trin 6 kan udføres, men langtidsopbevaring uden konserveringsmidler anbefales ikke.
6. Kvantificer og karakterisere renset produkt i en fremskyndet vestlig blotting procedure
- Løse renset protein og Fc standarder på gel valg af SDS-PAGE, under reduktion eller nonreducing betingelser som ønsket18-20. Brug en mini gel i stedet for midi gel for at minimere køretiden.
- Hvis det ikke allerede er kendt, bestemmes Fc-standardområdet, over hvilket båndsignal varierer lineært med hensyn til mængden af indlæst(f.eks. 0,1-1 mg). Brug den samme gel, driftsbetingelser, overførselsbetingelser og reagenser, der vil blive brugt til at kvantificere og karakterisere renset protein.
- Indlæs flere prøvemængder af renset protein, herunder prøver fortyndet med DPBS, for at sikre, at de rensede proteinbåndssignaler er inden for det lineære signalområde af Fc-standarder i billedanalyse.
- Overfør proteiner fra gelen til en polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) i et diskontinuerligt buffersystem ved hjælp af en halvdry blotter13, efter blotterproducentens anvisninger. Transfertiden er typisk 5-10 min. Hvis det ønskes, coomassie plette gel efter overførsel for at kontrollere overførsel effektivitet21.
- Udfør immunoblotting med anti-Fc eller anti-IgG konjugeret til alkalisk fosfatase (AP) eller heste radiseperoxidase (HRP), baseret på lab præference, ved hjælp af et vakuum-assisteret proteindetekteringssystem. Immunoblotting tid er typisk mindre end 1 time.
- Udvikle immunoblot ved hjælp af substratet og den foretrukne metode(f.eks. AP-substrat og forbedret chemiluminescens).
- Kvantificere renset protein ved billedanalyse. Udfør en lineær regression på bandets signaler fra Fc standarder. Hvis R2>0,90, skal du bruge ligningen for linjen til at beregne proteinmængden ud fra dens båndsignal(er). Om nødvendigt redegøres der for fortynding af prøverne. Da kvantificeringen af proteinet udføres på basis af Fc, skal du justere værdien for molekylvægtforskelle mellem proteinet og Fc. HvisR 2<0,90, gentag trin 6 i sin helhed.
- Valider protein ved hjælp af funktionelle assays eller metoder til at detektere Fc via flow cytometry, vestlig blotting, ELISA osv. baseret på laboratoriepræference.
- Fortyndet protein til den ønskede koncentration og/eller tilsættes de ønskede konserveringsmidler eller stabilisatorer til den rensede proteinopløsning, inden det til langtidsopbevaring opbevares på lang sigt, fryses eller på anden måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den strømlinede protokol for isolation og karakterisering af Fc-udtrykke proteiner er rutinemæssigt bruges til at behandle kimære murine galectin-1 fusioneret til menneskelige Fc (Gal-1hFc) fra fortyndet cellekultur supernatants. Rutediagrammet i Figur 2 illustrerer arbejdsprocessen og klokkeslættet for hvert trin i protokollen. For et typisk parti på 300 ml supernatant er den samlede behandlingstid ca. 9 timer, når den valgfrie flowcytometritest af elueringsfraktioner udføres. Hvis al flowcytometrianalyse udelades på grund af manglende flowcytometer eller individuel laboratoriepræference, kan den samlede behandlingstid være så kort som 4 timer. Generelt afhænger behandlingstiden af operatørerfaring, mængden af supernatantforarbejdet, og hvilke kvantificerings- og karakteriseringsmetoder der udføres.
Flow cytometry blev brugt til at teste for tilstedeværelsen af funktionelle Gal-1hFc(dvs. Gal-1 i stand til at opdage sine ligands på brystkræftceller) i startcellekulturen supernatant; frisk cellekultur medium tjente som den negative kontrol18,22 . Når Gal-1hFc i cellen kultur supernatant blev verificeret (Figur 3A), lastning af proteinet En membran adsorber blev udført ved supernatant perfusion ved 10 ml / min (resulterer i overfladisk hastighed eller volumetrisk flux på 0,5 cm / min i en 2 ml membran adsorber) ved hjælp af en sprøjte pumpe (Figur 1). Membranen adsorber effektivt fanget og bevaret Gal-1hFc, forlader strømmen gennem væsentlige udtømt af Gal-1hFc (manglende gennembrud, Figur 3A). Gal-1hFc blev udråbt fra membranen adsorber i en milliliter stigninger på 1 ml / min (volumetrisk flux = 0,05 cm / min) ved hjælp af en amin-baseret sur buffer (pH 2,8), og neutraliseret eluering fraktioner blev efterfølgende testet for tilstedeværelsen af funktionelle Gal-1hFc ved hjælp af flow cytometry (Figur 3B). Gal-1hFc signal sekventielt steget fra eluering 1 (omtrent lig med negativ kontrol) til en maksimal ved eluering 3, derefter faldt til et næsten konstant niveau ved elutions 9 og 10(Figur 3B og 3C). Den endelige eluering 10 nåede ikke ækvivalens med det negative kontrolsignal på grund af en vis adsorber fastholdelse af Gal-1hFc (Figur 3B og 3C). Dette tab blev imidlertid anset for acceptabelt. Som en alternativ metode til at teste for tilstedeværelse, men ikke funktion, af Gal-1hFc i forskellige opløsninger, flow cytometry analyse af Gal-1hFc evne til at binde sig til protein A polystyren perler (gennem anerkendelse af hFc-regionen) kan anvendes (Figur 3D).
Efter elution fraktion test, Gal-1hFc-positive udligninger 2 til 10 blev koncentreret og derefter dialyzed mod DPBS at opnå renset Gal-1hFc i den ønskede buffer. Kvantificering og karakterisering af den rensede Gal-1hFc blev udført i en vestlig blotting procedure fremskyndet af halvdry overførsel og vakuum-assisteret immunoblotting. Ved at sammenligne Gal-1hFc-signalet med hFc-kvantificeringsstandarder blev både mængden og kvaliteten af renset materiale bestemt (figur 4A-C). Signalintensiteter for hFc-standardbånd (et bånd ved ~25 kDa hver i figur 4A, bane 1-5) var lineært relateret til mængden af hFc til stede(figur 4C). Gal-1hFc (et bånd på ~ 40 kDa i figur 4A, lane 6) og forringet Gal-1hFc (et band på ~ 40 kDa og et band på ~ 25 kDa i Figur 4A, lane 7) signaler var inden for standardområdet(Figur 4A, baner 1-5). Koncentrationen af renset Gal-1hFc (Figur 4A, bane 6) på grundlag af hFc blev bestemt til at være 450 μg/ml ved billedbehandling (Figur 4C). Ved justering for gal-1hFc's molekylvægt var koncentrationen af det rensede materiale 720 g/ml. I modsætning hertil blev for meget renset Gal-1hFc lastet i bane 6 og 7 i western i figur 4B, som genererede signaler, der mættede eller overskred hFc-standardområdet og derved forhindrede kvantificering. Alternativ til vestlig blotting, Coomassie gel farvning21 kan tjene som en hurtig kvalitetskontrol og / eller kvantificering metode (Figur 4D). Bemærk, at et bånd ~10 kDa, ud over bands ~25 kDa og ~40 kDa, var til stede i den nedbrudte Gal-1hFc prøve (Figur 4D, bane 2). Dette bånd nedbrydes Gal-1hFc, der var ikke-reaktivt med det detektionsantistof, der blev brugt i vestlige blots (Figur 4A og 4B).
Efter kvantificering og endelig karakterisering af den rensede Gal-1hFc blev steril BSA tilføjet for at opnå en endelig BSA-koncentration på 0,5%. Det rensede materiale blev derefter aliquoted og opbevaret ved -20 ºC. Ud over Gal-1hFc, har vi brugt denne strømlinede protokol til at isolere dobbelt mutant Gal-1hFc og Gal-7hFc. Det kan også udvides til stort set ethvert molekyle, der besidder en Fc fragment (antistoffer, Fc fragmenter selv, andre Fc fusion proteiner, etc. af arter og isotyper, der har affinitet for protein A14-17).
Figur 1. Skematisk over forsøgsapparatet. Antistoffer og rekombinante fusionsproteiner, der udtrykker Fc-fragmenter af IgG, kan isoleres fra fortyndede opløsninger ved hjælp af en protein A-membran adsorber. Membranen adsorber er forbundet via en Luer lås montering til en 30 ml sprøjte på en sprøjte pumpe, som gennemsyrer protein-holdige opløsning gennem membranen adsorber på en ønsket volumetrisk strømningshastighed.
Figur 2. Procesarbejdsgang for isolering af Gal-1hFc fra cellekultur supernatant. Dette rutediagram illustrerer protokollen for isolation og karakterisering af en kimær murine galectin-1/human Fc-udtrykke fusion protein (Gal-1hFc) fra cellekultur supernatant. Generelt vil behandlingstiden variere afhængigt af operatørens erfaring, mængden af supernatantforarbejdet, og hvilke kvantificerings- og karakteriseringsmetoder der anvendes.
Figur 3. Flow cytometri analyse af Gal-1hFc-holdige løsninger. Flow cytometry bruges til at vurdere, om funktionelle Gal-1hFc er til stede i frisk celle kultur medium, cellekultur supernatant, membran adsorber flow igennem, og elution fraktioner. APC-konjugerede F(ab')2 anti-menneskelige Fc blev brugt som det sekundære antistof. Alle data blev anskaffet ved hjælp af en FACS Aria Special Order Research Product flow cytometer / sorteringsmaskine og analyseret ved hjælp af FlowJo software. Markører i hvert histogram repræsenterer 2% af den negative kontrolpopulation (dvs. friskcellekulturmedium for (A) og hFc-isotype for (B)). (A) Flow cytometri histogram overlay af BT-20 brystkræftceller mærket med frisk cellekultur medium (rød), cellekultur supernatant (blå), eller membran adsorber flow igennem (grøn). Cellekultur supernatant indeholdt et lavt niveau af funktionelle Gal-1hFc, der med succes bundet til galectin-1 ligands på BT-20 celler, mens den friske celle kultur medium og membran adsorber flow gennem manglede Gal-1hFc, som forventet. (B) Flow cytometri histogrammer af BT-20 celler mærket med eluering fraktioner fra membranen adsorber. Gal-1hFc signal på BT-20 celler sekventielt stiger til et maksimum ved eluering 4 derefter falder, men ikke til baggrundsniveau(dvs. signal svarende til frisk celle kultur medium). (C) De gennemsnitlige fluorescensintensiteter for prøverne i (B) kan også afbildes som en funktion af elueringsfraktionstallet for at generere en elueringskurve. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet for celler, der er mærket med hFc-isotypekontrol, vises som en referencelinje. (D) Alternativt kan flowcytometrianalyse af Gal-1hFc bundet til protein A polystyrenperler anvendes til at teste for proteintilstedeværelse, men ikke funktion, i forskellige opløsninger. APC-konjugerede F(ab')2 anti-menneskelige Fc blev brugt som det sekundære antistof. Til venstre: Flow cytometri histogram overlay af frisk celle kultur medium (rød), cellekultur supernatant (blå), og blank buffer prøve (grøn). Midt: Histogram af hFc isotype kontrol. Inkubation med 10 mg/ml hFc er en positiv kontrol for protein A-opsamling. Højre panel: Histogram af protein A perler inkuberet med renset Gal-1hFc, på grundlag af 10 mg hFc/ml. Klik her for at se større billede.
Figur 4. Kvantificering og karakterisering af Gal-1hFc ved hjælp af vestlig blotting og billedanalyse. (A) Vognbane 1-5 er hFc-standarder på 0,1-0,5 μg i trin på 0,1 μg, og bane 6 og 7 renses Gal-1hFc fra to forskellige produktionspartier. Prøver blev løst på en 4-15% TGX gel af SDS-PAGE under reduktionsforhold og derefter overført til PVDF-membranen ved hjælp af diskontinuerlige overførselsbetingelser. Membranen blev blokeret og inkuberet med anti-hIgG-AP ved hjælp af en vakuumassisteret immunoblottingteknik. Signaler blev udviklet med ECL reagens og visualiseret på en Bio-Rad ChemiDoc XRS imager. Signaler for hFc-standarder i vognbane 1-5 varierede lineært (afbildet i (C)), og signalerne til de to rensede Gal-1hFc-prøver i vognbane 6 og 7 var inden for det lineære måleområde. Lane 7 viser to bånd, Gal-1hFc og formentlig hFc fragment, der angiver nedbrydning af proteinet. (B) Hvis der indlæses for meget renset Gal-1hFc, kan signalet mætte eller overskride det lineære signalområde, hvilket forhindrer kvantificering (vognbane 6 og 7). Baner, gel og kørselsforhold er de samme som i (A). (C) Image Lab analyse software gør det muligt at indtaste kendte absolutte mængder af hFc standarder fra en immunoblot, derefter bestemmer mængden af det ukendte bånd (r) gennem sit signal i forhold til den lineære regression af standarder (y = 1,36 x 10-7*x + 0,105; R2 = 0,95). De viste data er fra analysen af immunoblottet i (A). (D) Kvaliteten af renset Gal-1hFc kan vurderes ved hjælp af Coomassie farvning. Bane M er en molekylvægtmarkør, vognbane 1 er renset Gal-1hFc (samme prøve som bane 6 i (A) og (B)),vognbane 2 nedbrydes Gal-1hFc (samme prøve som vognbane 7 i (A) og (B)),og bane 3 er 0,2 mg hFc standard. Gel- og driftsbetingelserne var de samme som i (A) og (B). Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet heri blev udviklet til hurtigt at isolere og karakterisere et kimært fusionsprotein, der udtrykker menneskelige Fc (Gal-1hFc), uden at det væsentligt kompromitterer produktgenvinding eller oppustningsomkostninger. Nøglekomponenterne i den strømlinede arbejdsgang er et protein A-membran adsorber til isolation, og halvdryk overførsel og vakuumassisteret immunoblotting til karakterisering af vestlig blotting.
Det dramatiske fald i behandlingstiden for isolation og karakterisering af Gal-1hFc fra 300 ml cellekultur supernatant (ca. 9 timer i den strømlinede protokol sammenlignet med 20 + timer i en traditionel protokol) kan i vid udstrækning tilskrives inkorporering af ovennævnte nøglekomponenter, især membranen adsorber. Ved den maksimale anbefalede strømningshastighed på 10 ml supernatant/min. kan membran adsorberbelastningen udføres på 30 min. Gal-1hFc opsving fra protein En membran adsorbere typisk spænder fra 10-30% i vores laboratorier, med ~ 30% nyttiggørelse rutinemæssigt opnås ved erfarne lab personale whenGal-1hFc koncentrationer i cellekultur supernatant er 5-10 mg/ml. På de fleste, ~ 50% opsving er opnået. Komplet produktgenvinding er praktisk talt umulig på grund af iboende tab som følge af (a) specifik tilbageholdelse af Fc-udtrykkende protein med protein A på membranen adsorber (Figur 3B og 3C) og (b) uspecifik overflade adsorption af proteinet i hele isolationen. Det er vigtigt for de enkelte laboratorier at afgøre, om produktgenvinding med en membran adsorber er acceptabelt baseret på deres behov; hvis ændring af belastningshastigheden eller råvareindholdet(f.eks. ønsket proteincellekoncentrationskultursornagen, som kan være særlig vanskelig) kan forbedre produktgenvindingen8, eller hvis ændring af elueringsprotokollen (trin 4) for at opnå højere restitution er værd at øge tiden, udgiften og indsatsen eller den mulige skade på selve protein- eller membran adsorberen (primært ved elution buffer pH, saltkoncentration osv.). I modsætning til at bruge membranen adsorber, tager det cirka 10 timer at udføre to perfusionscyklusser gennem et 1 ml protein En perlepakket kolonne18ved den maksimale tolerable strømningshastighed på 1 ml / min, og kun 10-20% Gal-1hFc genvindes typisk. Som en sidste bekymring, en omkostningsanalyse for protein A perler fra forskellige producenter kan påvirke beslutningen om at bruge en standard perle-pakket kolonne versus en enkelt membran adsorber. Under hensyntagen til alle disse faktorer kan brugen af en membran adsorber til laboratorieskala isolering af Fc-udtrykkende proteiner give små laboratorier betydelige fordele i forhold til kolonnekromatografi2,5,8,10.
Brug af en minigel til SDS-PAGE, halvdry diskontinuerlig elektrofobtisk overførsel af proteiner fra gelen til PVDF-membranen og vakuumassisteret immunoblotting giver betydelige tidsbesparelser sammenlignet med midi geler, tank (våd) overførsel og diffusionsbaseret immunostaining til kvantificering og karakterisering af Gal-1hFc (2 timer versus 8 timer). Individuelle laboratorier skal afgøre, om den fremskyndede vestlige protokol er egnet til kvantificering og karakterisering af deres protein. Fordelene omfatter (a) kort tid til færdiggørelse selv af uerfarne lab personale, (b) evne til at afgøre, om proteinet er intakt eller er forringet på grund af forarbejdning eller forurening (Figur 4B), og (c) relativ lethed kvantificering af billedbehandling programmer (Figur 4C). A) øgede omkostninger til reagenser og forbrugsstoffer kan dog være uacceptable på trods af den tid, der kompenseres for lønninger, b) traditionel proteinkvantificering med A280, ELISA, Bradford-analyse eller BCA-analyse kan foretrækkes23-27, eller (c) laboratorier har muligvis ikke adgang til en halvdryknudløser eller et vakuumassisteret proteindetekteringssystem til immunlotobting. I sådanne tilfælde er Coomassie farvning af SDS-PAGE-opløste proteiner21(Figur 4D)eller prik eller slot blotting28 gode alternativer.
Flowcytometri blev anvendt i tre separate 90-minutters test til påvisning af funktionel Gal-1hFc i denne strømlinede protokol (figur 2), som er den samme som i traditionel forarbejdning18,22. Enhver anden karakteriseringsmetode som vestlig blotting eller ELISA ville også være acceptabel. Funktionelle assays er optimale (f.eks. påvisning af galectin-1-ligands på brystkræftceller, figur 3A-C). Alternativt ville det være acceptabelt at påvise Fc-enheden (svarende til figur 3D), men fastholdelse af proteinets specifikke funktion kan ikke bestemmes på denne måde, hvilket er en potentielt betydelig ulempe.
De metoder, der er beskrevet heri, er blevet anvendt til hurtig laboratorieskala isolation og karakterisering af et kimært fusionsprotein, der udtrykker humant Fc (Gal-1hFc). Denne strømlinede arbejdsgang kan anvendes til isolering af stort set ethvert molekyle, der besidder et Fc-fragment (IgG-antistoffer, andre Fc-fusionsproteiner, Fc-fragmenter selv osv.)og kan let ændres baseret på individuelle laboratoriepræferencer. Derudover er denne protokol relativt hurtig og nem, selv for begrænset erfaring eller helt uerfarne laboratoriepersonale, hvilket gør den egnet til brug i high school eller college biologi, kemi og (bio)kemiteknikkurser, der dækker principper for proteinisolation og karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Mr. Luis F. Delgadillo (Institut for Kemisk og Biomolekylær Engineering, Ohio University), Matthew H. Williams (Institut for Kemisk og Biomolekylær Engineering, Ohio University), og Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham og Women's Hospital og Harvard Medical School) for ekspert teknisk bistand. Forfatterne vil også gerne takke Winter 2011 CHE 404/BME 504 og Fall 2012 CHE 4830/BME 5830 studerende (Institut for Kemisk og Biomolekylær Engineering og Biomedicinsk Engineering Program, Ohio University) for teknisk rådgivning og diskussion. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI tilskud 1R15CA16 1830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctoral Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) og NIH NCCAM tilskud R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P.
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S.
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M.
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T.
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al.
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
