Summary
In vergelijking met traditionele affiniteitschromatografie met behulp van eiwit A agarose kraal-verpakte kolommen, eiwit A membraan adsorbers kunnen aanzienlijk versnellen laboratorium-schaal isolatie van antilichamen en andere Fc fragment-expresserende eiwitten. Geschikte analyse- en kwantificeringsmethoden kunnen de eiwitverwerking verder versnellen, waardoor isolatie/karakterisering in één werkdag kan worden voltooid, in plaats van 20+ werkuren.
Abstract
Laboratoriumschaal tot industriële schaalzuivering van biomoleculen uit celkweeksupernatanten en lysed cell-oplossingen kan worden bereikt met behulp van affiniteitschromatografie. Hoewel affiniteitschromatografie met poreus eiwit A-agarose kralen verpakt in kolommen misschien wel de meest voorkomende methode is voor laboratoriumschaalisolatie van antilichamen en recombinante eiwitten die Fc-fragmenten van IgG uitdrukken, kan het een tijdrovend en duur proces zijn. Tijds- en financiële beperkingen zijn vooral ontmoedigend in kleine basiswetenschappelijke laboratoria die honderden microgrammen tot milligram eiwit moeten terugwinnen uit verdunde oplossingen, maar geen toegang hebben tot hogedruksystemen voor vloeistofafgifte en/of personeel met expertise in bioseparaties. Bovendien kan productkwantificering en karakterisering ook de verwerkingstijd over meerdere werkdagen te lang verlengen en de kosten (verbruiksgoederen, lonen, enz.)opblazen. Daarom is een snel, goedkoop, maar effectief protocol nodig voor laboratoriumschaalisolatie en karakterisering van antilichamen en andere eiwitten die een Fc-fragment bezitten. Hiervoor hebben we een protocol opgesteld dat kan worden ingevuld door technisch personeel met beperkte ervaring in minder dan 9 uur (ongeveer één werkdag) en zo snel als 4 uur, in tegenstelling tot traditionele methoden die meer dan 20 werkuren vereisen. De meeste benodigde apparatuur is direct beschikbaar in standaard biomedische wetenschap, biochemie en (bio)chemische engineering labs, en alle reagentia zijn in de handel verkrijgbaar. Om dit protocol aan te tonen, worden representatieve resultaten gepresenteerd waarin chimerische muriene galectine-1 gesmolten tot menselijke Fc (Gal-1hFc) uit celkweek supernatant werd geïsoleerd met behulp van een eiwit A membraanadsorber. Gezuiverde Gal-1hFc werd gekwantificeerd met behulp van een versnelde westerse blotting analyse procedure en gekenmerkt met behulp van flow cytometrie. De gestroomlijnde workflow kan worden aangepast voor andere Fc-uitdrukkende eiwitten, zoals antilichamen, en/of worden gewijzigd om alternatieve kwantificerings- en karakteriseringsmethoden op te nemen.
Introduction
Isolatie van antilichamen en recombinante eiwitten die immunoglobuline G (IgG) uitdrukken Fc-fragmenten van celkweeksupernatanten en verdunde lysed cell-oplossingen kan worden bereikt met behulp van eiwit A affiniteitschromatografie. In basiswetenschappen en technische laboratoria en industrie worden kolommen vol poreuze eiwitten met A-gecoate agarose, glas of polymere kralen het meest gebruikt voor affiniteitschromatografie, ondanks hoge financiële kosten en lange verwerkingstijden1-3. Het wordt zeer gewaardeerd dat affiniteitschromatografie het grootste kosten- en verwerkingsknelpunt vormt in zowel laboratorium- als industriële omgevingen2,4. Als gevolg hiervan zijn tal van verbeteringen ontwikkeld om de kosten en verwerkingstijd te verlagen zonder in te boeten aan algehele productterugwinning van de procestrein1,2,5-7. Bijzonder veelbelovend voor de isolatie van antilichamen en andere Fc-uitdrukkende eiwitten is affiniteitschromatografie met behulp van een eiwit A membraanadsorber2,5,7-10. Terwijl de fc-afvang in kolomchromatografie diffusiebeprijzingsbeïnvloeding is (d.w.z. het Fc-uitdrukkende eiwit moet diffuus zijn in en door interne poriën om het grootste deel van het eiwit A te bereiken) met een hoge drukval over de kolom, wordt massatransport in membraanadsorbers aangedreven door bulkconvectie, wat resulteert in het vermijden van diffusiebeperkingen8,9,11,12. Bovendien is de drukval over de membraanadsorber laag, waardoor snellere perfusiedebieten mogelijk zijn in vergelijking met met kralen gevulde kolommen8,9,11,12. Voor laboratoriumschaalisolatie wordt dus voorspeld dat membraanchromatografie de isolatietijd met enkele uren zal verkorten en de productopname zal verhogen in vergelijking met kolomchromatografie. Bovendien zijn wiskundige modellen voor IgG-adsorptie in membraanadsorbers voorgesteld8,9,11,12, waardoor eindgebruikers de prestaties in het lab kunnen voorspellen.
Een ander knelpunt in basiswetenschappelijke en technische laboratoria is de karakterisering van het Fc-uitdrukkende eiwit. De selectie van geschikte methoden om karakteriseringstests, zoals westerse vlekken, te voltooien, kan de tijd die aan producttests wordt besteed echter aanzienlijk verminderen. Semidry-overdracht in een discontinu buffersysteem kan bijvoorbeeld elektroforetische overdracht van eiwitten van een SDS-PAGE-gel naar een polyvinyldifluoridine (PVDF) membraan in een kwestie van minuten bereiken, in tegenstelling tot 1-2 uur in tank (natte) overdracht in een continu buffersysteem13.
Een snel, goedkoop en effectief protocol om een chimerisch fusie-eiwit te isoleren en te karakteriseren dat een Fc-fragment van menselijke IgG uitdrukt, wordt hierin beschreven. De meeste apparatuur is direct beschikbaar in standaard basis biomedische wetenschap, biologie, chemie en (bio)chemische engineering labs, en alle reagentia zijn in de handel verkrijgbaar. Hoewel representatieve resultaten werden gegenereerd uit de isolatie en karakterisering van een murien galectine-1/menselijk Fc chimerisch fusie-eiwit (Gal-1hFc), kan het gestroomlijnde protocol worden toegepast op de isolatie van andere moleculen die een Fc-fragment bezitten, zoals antilichamen, Fc-fragmenten zelf of andere Fc-fusie-eiwitten. Onze verbeteringen verminderden de verwerkingstijd drastisch (slechts 4 uur maar meer typisch ~ 9 uur, vergeleken met 20 + werkuren) terwijl we vergelijkbare of verbeterde productherstel bereikten in vergelijking met standaardmethoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Controleer de affiniteit voor eiwit A
- Controleer of het Fc-uitdrukkende eiwit (recombinant fusie-eiwit of IgG-antilichaam, hierna "eiwit" genoemd) een aanvaardbare affiniteit heeft voor eiwit A14-17 voordat het eiwit A-membraanadsorber wordt gebruikt, en test op de aanwezigheid van het eiwit in de stamoplossing(bijv. celkweeksupernatant verduidelijkt door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 minuten naar pellets gesuspendeerde cellen). Gebruik flow cytometrie, Western blotting, ELISA, etc. om de eiwitfunctie en/of aanwezigheid van Fc te detecteren, op basis van laboratoriumvoorkeur. Kwantificeer idealiter het eiwit in het celkweeksupernatans (stap 6) om te voorkomen dat het eiwit de adsorbercapaciteit van het membraan overschrijdt. Ga verder als er eiwit wordt gedetecteerd.
2. Bereid eiwit een membraanadsorber en celkweek supernatant
- Volg de instructies van de fabrikant voor het bereiden van de membraanadsorber. Laat nooit lucht in de membraanadsorber komen. Alle oplossingen die door de membraanadsorber worden geperfuseerd, moeten op kamertemperatuur zijn en voorgefilterd met een filter van 0,22 μm. Vul een spuit van 10 ml met 0,22 μm gefilterde Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) of buffer naar keuze en ontlaad luchtbellen. Perfuse DPBS om de opslagoplossing te verwijderen en de membraanadsorber vlak voor gebruik te equilibreren.
- Filtreer het celkweeksupernaant onmiddellijk voor de perfusie door de membraanadsorber met behulp van een vacuümgestuurde steriele filtratie-eenheid van 0,22 μm.
3. Laad de Protein A Membraanadsorber
- Aspireer celkweeksupernatant in een Luer Lock spuit (30 ml of groter) en ontlaad eventuele luchtbellen.
- Monteer materialen en apparatuur zoals weergegeven in figuur 1. Sluit de spuit aan op de inlaat van de membraanadsorber. Bevestig flexibele slangen aan de membraanadsorberuitlaat. Plaats indien gewenst een spuitfilter van 0,22 μm tussen de spuit en de membraanadsorber. Gebruik een kolf of fles om de stroom (ook wel filtraat genoemd) uit de adsorber op te vangen.
- Stel de spuitpomp in op het gewenste volumetrische debiet, maar overschrijd het door de fabrikant aanbevolen debiet(bijv. 10 ml/min) niet. Doordrenkt de celkweek supernatans door de membraanadsorber en verzamel de stroom door in een bekerglas of andere container. Herlaad de spuit met supernatanten die nodig zijn.
- Test indien gewenst de doorstroming op de aanwezigheid van eiwitten met behulp van flowcytometrie, western blotting, ELISA, enz. op basis van labvoorkeur. Het is meestal niet nodig om de stroom er doorheen te halen.
4. Elute-eiwit uit de membraanadsorber
- Was de membraanadsorber met 10 ml DPBS om eventuele niet-gebonden eiwitten te verwijderen.
- Elute-eiwit uit de membraanadsorber bij het gewenste debiet(bijv. 1 ml/min) met 10-15 ml elutiebuffer(bv. elutiebuffer op basis van amine (pH 2,8)). Vang eluaat in een buis met neutraliserende buffer(bijv. 1 M Tris (pH 9,4)) bij 10% van het elutievolume (1,0-1,5 ml).
- Als alternatief wordt elute-eiwit in stappen van één ml in buizen met 100 μl neutralisatiebuffer gebracht, met een totaal volume van 10-15 ml elutiebuffer. Gebruik de voorkeurskarakteriseringsmethode om elke fractie te testen op de aanwezigheid van eiwitten.
- Regenereer de membraanadsorber volgens de instructies van de fabrikant. Perfuseer 10 ml 0,22 μm-gefilterde DPBS of buffer naar keuze, vervolgens 10 ml 0,22 μm gefilterde 50 mM NaOH in 1 N NaCl en ten slotte 10 ml 0,22 μm gefilterd DPBS. Vul de membraanadsorber met 20% ethanol in DPBS voor langdurige opslag bij 4 ºC.
5. Concentraat en dialyse het eiwit
- Deponeer alle eluaat (of elutied fracties die eiwit bevatten zoals bepaald in stap 4.3) in een 10 kDa moleculair gewicht afgesneden centrifugaal filtereenheid. Volg de instructies van de fabrikant voor centrifugeren.
- Dialyseer het retentaat in een kleine volumedialyse-eenheid (10 kDa moleculaire gewichtsafsnijding) tegen de buffer van keuze, volgens de instructies van de fabrikant. Buffer moet mogelijk worden toegevoegd aan gedialyseerd materiaal als eiwitprecipitatie een probleem is. Indien gewenst kan het gedialyseerde materiaal worden gekoeld tot stap 6 kan worden uitgevoerd, maar langdurige opslag zonder conserveringsmiddelen wordt niet aanbevolen.
6. Kwantificeer en karakteriseer gezuiverd product in een versnelde westerse blotting-procedure
- Los gezuiverde eiwit- en Fc-normen op de gel van keuze door SDS-PAGE op, onder reducerende of niet-reducerende omstandigheden zoals gewenst18-20. Gebruik een minigel in plaats van midi-gel om de looptijd te minimaliseren.
- Indien nog niet bekend, bepaal dan het Fc-normenbereik waarover het bandsignaal lineair varieert ten opzichte van de hoeveelheid geladen(bijv. 0,1-1 mg). Gebruik dezelfde gel, loopomstandigheden, overdrachtsomstandigheden en reagentia die zullen worden gebruikt om gezuiverd eiwit te kwantificeren en te karakteriseren.
- Laad meerdere monsterhoeveelheden gezuiverd eiwit, inclusief monsters verdund met DPBS, om ervoor te zorgen dat de gezuiverde eiwitbandsignalen binnen het lineaire signaalbereik van de Fc-normen in beeldanalyse liggen.
- Breng eiwitten van de gel over naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan in een discontinu buffersysteem met behulp van een semidry blotter13, volgens de instructies van de fabrikant van de blotter. Transfertijd is meestal 5-10 min. Indien gewenst, Coomassie beits de gel na overdracht om overdrachtsefficiëntie te controleren21.
- Voer immunoblotting uit met anti-Fc of anti-IgG geconjugeerd tot alkalische fosfatase (AP) of paardenradijsperoxidase (HRP), op basis van laboratoriumvoorkeur, met behulp van een vacuümondersteund eiwitdetectiesysteem. Immunoblotting tijd is meestal minder dan 1 uur.
- Ontwikkel immunoblot met behulp van het substraat en de methode van keuze(bijv. AP-substraat en verbeterde chemiluminescentie).
- Kwantificeer gezuiverd eiwit door beeldanalyse. Voer een lineaire regressie uit op de bandsignalen van fc-normen. Als R2>0,90, gebruikt u de vergelijking voor de lijn om de eiwithoeveelheid te berekenen op basis van het bandsignaal(en). Houd zo nodig rekening met monsterverdunning. Aangezien de kwantificering van het eiwit wordt uitgevoerd op basis van Fc, past u de waarde voor moleculaire gewichtsverschillen tussen het eiwit en Fc aan. Als R2<0,90, herhaalt u stap 6 in zijn geheel.
- Valideer eiwitten met behulp van functionele testen of methoden om Fc te detecteren via flowcytometrie, western blotting, ELISA, enz. op basis van labvoorkeur.
- Verdun eiwitten tot de gewenste concentratie en/of voeg de gewenste conserveermiddelen of stabilisatoren toe aan de gezuiverde eiwitoplossing voordat u ze aliquoteert voor langdurige opslag, bevroren of anderszins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gestroomlijnde protocol voor isolatie en karakterisering van Fc-uitdrukkende eiwitten wordt routinematig gebruikt om chimerische muriene galectine-1 gesmolten tot menselijke Fc (Gal-1hFc) te verwerken uit verdunde celkweeksupernatanten. Het stroomdiagram in figuur 2 illustreert de workflow en tijd voor elke stap in het protocol. Voor een typische partij van 300 ml supernatans is de totale verwerkingstijd ongeveer 9 uur wanneer de optionele flowcytometrietests van elutiefracties worden uitgevoerd. Als alle flowcytometrie-analyse wordt weggelaten, vanwege het ontbreken van een flowcytometer of individuele laboratoriumvoorkeur, kan de totale verwerkingstijd zo kort zijn als 4 uur. Over het algemeen hangt de verwerkingstijd af van de ervaring van de operator, de hoeveelheid supernatant die wordt verwerkt en welke kwantificerings- en karakteriseringsmethoden worden uitgevoerd.
Flowcytometrie werd gebruikt om te testen op de aanwezigheid van functionele Gal-1hFc(d.w.z. Gal-1 in staat om zijn liganden op borstkankercellen te detecteren) in het supernatant van de startcelkweek; vers celkweekmedium diende als negatieve controle18,22 . Zodra Gal-1hFc in de celkweek supernatans werd geverifieerd(figuur 3A),werd het laden van het eiwit A membraanadsorber bereikt door supernatantperfusie bij 10 ml/min (resulterend in oppervlakkige snelheid of volumetrische flux van 0,5 cm/min in een membraanadsorber van 2 ml) met behulp van een spuitpomp (Figuur 1). De membraanadsorber ving en behield Gal-1hFc efficiënt, waardoor de stroom door in wezen uitgeput van Gal-1hFc (gebrek aan doorbraak, figuur 3A). Gal-1hFc werd in stappen van één milliliter (volumetrische flux = 0,05 cm/min) uit de membraanadsorber geëesdeerd met behulp van een zure buffer op basis van amine (pH 2,8) en geneutraliseerde elutied fracties werden vervolgens getest op de aanwezigheid van functionele Gal-1hFc met behulp van flowcytometrie (Figuur 3B). Gal-1hFc signaal opeenvolgend verhoogd van elutie 1 (ongeveer gelijk aan negatieve controle) tot een maximum bij elutie 3, vervolgens verlaagd tot een bijna constant niveau bij elutions 9 en 10 (Figuren 3B en 3C). De laatste elutie 10 bereikte geen equivalentie met het negatieve controlesignaal als gevolg van enige adsorberretentie van Gal-1hFc (figuren 3B en 3C). Dit verlies werd echter aanvaardbaar geacht. Als alternatieve methode om te testen op aanwezigheid, maar niet functie, van Gal-1hFc in verschillende oplossingen, flow cytometrie analyse van Gal-1hFc's vermogen om te binden aan eiwit Een polystyreen kralen (door herkenning van de hFc regio) kan worden gebruikt (Figuur 3D).
Na elutiefractietesten werden Gal-1hFc-positieve elutions 2 tot en met 10 geconcentreerd en vervolgens gedialyseerd tegen DPBS om gezuiverde Gal-1hFc in de gewenste buffer te verkrijgen. Kwantificering en karakterisering van de gezuiverde Gal-1hFc werd uitgevoerd in een westerse blotting procedure versneld door semidry transfer en vacuüm-assisted immunoblotting. Door het Gal-1hFc signaal te vergelijken met de hFc kwantificeringsnormen werden zowel de kwantiteit als de kwaliteit van gezuiverd materiaal bepaald (Figuren 4A-C). Signaalintensiteiten van hFc-standaardbanden (één band bij ~25 kDa elk in figuur 4A, rijstroken 1-5) waren lineair gerelateerd aan de hoeveelheid aanwezige hfk 's (figuur 4C). Gal-1hFc (één band bij ~40 kDa in Figuur 4A, baan 6) en gedegradeerde Gal-1hFc (één band bij ~40 kDa en één band bij ~25 kDa in Figuur 4A, baan 7) signalen lagen binnen het normenbereik(figuur 4A,rijstroken 1-5). De concentratie gezuiverd Gal-1hFc (Figuur 4A, baan 6) op basis van hfk werd bepaald op 450 μg/ml door beeldverwerking (Figuur 4C). Gecorrigeerd voor het molecuulgewicht van Gal-1hFc was de concentratie van het gezuiverde materiaal 720 g/ml. Daarentegen werd te veel gezuiverde Gal-1hFc geladen in baan 6 en 7 van de Western in figuur 4B, die signalen genereerde die verzadigd waren of het hFc-normenbereik overschreden, waardoor kwantificering werd voorkomen. Alternatief voor western blotting, Coomassie gel kleuring21 kan dienen als een snelle kwaliteitscontrole en / of kwantificeringsmethode (Figuur 4D). Merk op dat een band ~ 10 kDa, naast banden ~ 25 kDa en ~ 40 kDa, aanwezig was in het gedegradeerde Gal-1hFc-monster(figuur 4D,baan 2). Deze band is gedegradeerd Gal-1hFc die niet-reactief was met het detectieantilichaam dat werd gebruikt in westerse vlekken (Figuren 4A en 4B).
Na kwantificering en uiteindelijke karakterisering van de gezuiverde Gal-1hFc werd steriele BSA toegevoegd om een uiteindelijke BSA-concentratie van 0,5% te bereiken. Het gezuiverde materiaal werd vervolgens ge aliquoted en opgeslagen bij -20 ºC. Naast Gal-1hFc hebben we dit gestroomlijnde protocol gebruikt om dubbel mutant Gal-1hFc en Gal-7hFc te isoleren. Het kan ook worden uitgebreid tot vrijwel elk molecuul dat een Fc-fragment bezit (antilichamen, Fc-fragmenten zelf, andere Fc-fusie-eiwitten, enz.van soorten en isotypen die affiniteit hebben met eiwit A14-17).
Figuur 1. Schematisch van het experimentele apparaat. Antilichamen en recombinante fusie-eiwitten die Fc-fragmenten van IgG uitdrukken, kunnen worden geïsoleerd uit verdunde oplossingen met behulp van een eiwit A-membraanadsorber. De membraanadsorber wordt verbonden door middel van een Luer-vergrendeling die past op een spuit van 30 ml op een spuitpomp, die de eiwithoudende oplossing door de membraanadsorber doordringt met een gewenste volumetrische stroomsnelheid.
Figuur 2. Procesworkflow voor de isolatie van Gal-1hFc van celkweeksupernatant. Dit stroomdiagram illustreert het protocol voor de isolatie en karakterisering van een chimerische muriene galectine-1/menselijke Fc-uitdrukkende fusie-eiwit (Gal-1hFc) uit celkweek supernatans. Over het algemeen zal de verwerkingstijd variëren afhankelijk van de ervaring van de operator, de hoeveelheid supernatant die wordt verwerkt en welke kwantificerings- en karakteriseringsmethoden worden gebruikt.
Figuur 3. Flow cytometrie analyse van Gal-1hFc-bevattende oplossingen. Flowcytometrie wordt gebruikt om te beoordelen of functionele Gal-1hFc aanwezig is in verse celkweekmedium, celkweeksupernatant, membraanadsorberstroom door en elutied fracties. APC-geconjugeerd f(ab')2 anti-humaan Fc werd gebruikt als secundair antilichaam. Alle gegevens werden verkregen met behulp van een FACS Aria Special Order Research Product flow cytometer/sorter en geanalyseerd met behulp van FlowJo software. Markers in elk histogram vertegenwoordigen 2% van de negatieve controlepopulatie(d.w.z. vers celkweekmedium voor (A) en hFc isotype voor (B)). (A) Flow cytometrie histogram overlay van BT-20 borstkankercellen gelabeld met verse celkweek medium (rood), celkweek supernatans (blauw), of membraan adsorber flow through (groen). Celkweeksupernaant bevatte een laag niveau van functionele Gal-1hFc dat met succes gebonden was aan galectine-1 liganden op BT-20 cellen, terwijl het verse celkweekmedium en membraanadsorber door miste Gal-1hFc, zoals verwacht. B) Flowcytometrie histogrammen van BT-20 cellen gelabeld met elutied fracties van de membraanadsorber. Gal-1hFc signaal op de BT-20 cellen neemt opeenvolgend toe tot een maximum bij elutie 4 en neemt dan af, hoewel niet tot achtergrondniveau(d.w.z. signaal equivalent aan vers celkweekmedium). C) De gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de monsters in (B) kunnen ook worden uitgezet als functie van het elutiefractiegetal om een elutiecurve te genereren. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van cellen met hFc-isotyperegeling wordt weergegeven als referentielijn. (D) Als alternatief kan flowcytometrieanalyse van Gal-1hFc gebonden aan eiwit Een polystyreenparel kan worden gebruikt om te testen op eiwitaanwezigheid, maar niet op functie, in verschillende oplossingen. APC-geconjugeerd f(ab')2 anti-humaan Fc werd gebruikt als secundair antilichaam. Links: Flow cytometrie histogram overlay van vers celkweekmedium (rood), celkweek supernatans (blauw) en blanco buffermonster (groen). Midden: Histogram van hFc isotype controle. Incubatie met 10 mg/ml HFK is een positieve controle voor eiwit A-afvang. Rechterpaneel: Histogram van eiwit A kralen geïncubeerd met gezuiverde Gal-1hFc, op basis van 10 mg hFc/ml. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Kwantificering en karakterisering van Gal-1hFc met behulp van western blotting en beeldanalyse. (A) Rijstroken 1-5 zijn hFc-normen van 0,1-0,5 μg in stappen van 0,1 μg, en rijstroken 6 en 7 worden gezuiverd Gal-1hFc van twee verschillende productiepartijen. Monsters werden opgelost op een 4-15% TGX-gel door SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden en vervolgens overgebracht naar het PVDF-membraan met behulp van discontinue overdrachtsomstandigheden. Het membraan werd geblokkeerd en geïncubeerd met anti-hIgG-AP met behulp van een vacuüm-ondersteunde immunoblotting techniek. Signalen werden ontwikkeld met ECL-reagens en gevisualiseerd op een Bio-Rad ChemiDoc XRS-imager. Signalen voor hFc-normen in rijbanen 1-5 varieerden lineair (uitgezet in (C)), en de signalen voor de twee gezuiverde Gal-1hFc-monsters in baan 6 en 7 lagen binnen het lineaire meetbereik. Lane 7 toont twee banden, Gal-1hFc en vermoedelijk hFc fragment, wat wijst op afbraak van het eiwit. (B) Als te veel gezuiverde Gal-1hFc wordt geladen, kan het signaal het lineaire signaalbereik verzadigen of overschrijden, waardoor kwantificering wordt voorkomen (rijstroken 6 en 7). Rijstroken, gel en rijomstandigheden zijn hetzelfde als in (A). (C) Image Lab-analysesoftware maakt het mogelijk om bekende absolute hoeveelheden hFc-normen van een immunoblot in te voeren en bepaalt vervolgens de hoeveelheid van de onbekende band(en) door zijn signaal ten opzichte van de lineaire regressie van normen (y = 1,36 x 10-7*x + 0,105; R2 = 0,95). De getoonde gegevens zijn afkomstig van de analyse van het immunobloed in (A). (D) Kwaliteit van gezuiverde Gal-1hFc kan worden beoordeeld met behulp van Coomassie-kleuring. Baan M is een moleculaire gewichtsmarker, baan 1 is gezuiverd Gal-1hFc (hetzelfde monster als baan 6 in (A) en (B)), baan 2 is gedegradeerd Gal-1hFc (hetzelfde monster als baan 7 in (A) en (B)), en baan 3 is 0,2 mg hFc standaard. De gel- en loopomstandigheden waren hetzelfde als in (A) en (B). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hierin beschreven protocol is ontwikkeld om snel een chimerisch fusie-eiwit te isoleren en te karakteriseren dat menselijke Fc (Gal-1hFc) uitdrukt, zonder het herstel van het product of de opblaaskosten aanzienlijk in gevaar te brengen. De belangrijkste componenten van de gestroomlijnde workflow zijn een eiwit A membraanadsorber voor isolatie, en semidry transfer en vacuüm-ondersteunde immunoblotting voor karakterisering door western blotting.
De dramatische afname van de verwerkingstijd voor isolatie en karakterisering van Gal-1hFc uit 300 ml celkweeksupernaant (ongeveer 9 uur in het gestroomlijnde protocol in vergelijking met 20+ uur in een traditioneel protocol) is grotendeels toe te schrijven aan de integratie van de bovengenoemde belangrijke componenten, met name de membraanadsorber. Bij het maximaal aanbevolen debiet van 10 ml supernatans/min kan de membraanadsorberbelasting in 30 minuten worden voltooid. Gal-1hFc herstel van eiwit Een membraan adsorbers variëren meestal van 10-30% in onze laboratoria, met ~30% herstel routinematig bereikt door ervaren laboratoriumpersoneel wanneerGal-1hFc concentraties in celkweek supernatant zijn 5-10 mg/ml. Hoogste tot het hoogste deel is ~50% herstel bereikt. Volledige productterugwinning is vrijwel onmogelijk als gevolg van inherente verliezen als gevolg van (a) specifieke retentie van Fc-uitdrukkend eiwit door eiwit A op de membraanadsorber (figuren 3B en 3C) en (b) niet-specifieke oppervlakte-adsorptie van het eiwit tijdens de isolatie. Het is belangrijk voor individuele laboratoria om te bepalen of productherstel met een membraanadsorber acceptabel is op basis van hun behoeften; als het wijzigen van het belastingsdebiet of het grondstofgehalte(bijv. gewenste eiwitcelconcentratiecultuur supernatans, wat bijzonder moeilijk kan zijn) het productherstel kan verbeteren8, of als wijziging van het elutieprotocol (stap 4) om een hoger herstel te verkrijgen de verhoogde tijd, kosten en inspanning waard is, of de mogelijke schade aan de eiwit- of membraanadsorber zelf (voornamelijk door elutiebuffer pH, zoutconcentratie, enz.). In tegenstelling tot het gebruik van de membraanadsorber duurt het ongeveer 10 uur om twee perfusiecycli uit te voeren door een 1 ml eiwit Een kolom met kraalverpakking18bij het maximaal toelaatbare debiet van 1 ml/min, en slechts 10-20% Gal-1hFc wordt meestal teruggewonnen. Als laatste zorg kan een kostenanalyse voor eiwit A-kralen van verschillende fabrikanten van invloed zijn op de beslissing om een standaard kolom met kraal te gebruiken versus een enkele membraanadsorber. Rekening houdend met al deze factoren kan het gebruik van een membraanadsorber voor laboratoriumschaalisolatie van Fc-uitdrukkende eiwitten kleine laboratoria aanzienlijke voordelen bieden ten opzichte van kolomchromatografie2,5,8,10.
Het gebruik van een minigel voor SDS-PAGE, semidry discontinue elektroforetische overdracht van eiwitten van het gel naar PVDF-membraan en vacuümondersteunde immunoblotting bieden aanzienlijke tijdsbesparingen in vergelijking met midi-gels, tank (natte) overdracht en diffusiegebaseerde immunostaining voor kwantificering en karakterisering van Gal-1hFc (2 uur versus 8 uur). Individuele laboratoria moeten bepalen of het versnelde westerse protocol geschikt is voor kwantificering en karakterisering van hun eiwit. Voordelen zijn onder meer a) korte tijd tot voltooiing, zelfs door onervaren laboratoriumpersoneel, b) het vermogen om te bepalen of het eiwit intact is of is afgebroken als gevolg van verwerking of verontreiniging (figuur 4B), en (c) relatief gemak van kwantificering door beeldverwerkingsprogramma's (figuur 4C). A) hogere kosten van reagentia en verbruiksgoederen kunnen echter onaanvaardbaar zijn, ondanks de tijdscompensatie voor lonen, b) traditionele eiwitkwantificering door A280, ELISA, Bradford-assay of BCA-test kan de voorkeur hebben23-27, of (c) laboratoria hebben mogelijk geen toegang tot een semidry blotter of een vacuümondersteund eiwitdetectiesysteem voor immunoblotting. In dergelijke gevallen zijn Coomassie-kleuring van SDS-PAGE opgeloste eiwitten21(figuur 4D) of dot of slot blotting28 goede alternatieven.
Flowcytometrie werd gebruikt in drie afzonderlijke tests van 90 minuten voor de detectie van functionele Gal-1hFc in dit gestroomlijnde protocol (figuur 2), dat hetzelfde is als bij traditionele verwerking18,22. Elke andere karakteriseringsmethode zoals Western blotting of ELISA zou ook acceptabel zijn. Functionele test is optimaal (bijv. detectie van galectine-1 liganden op borstkankercellen, figuren 3A-C). Als alternatief zou detectie van de Fc-eenheid aanvaardbaar zijn (vergelijkbaar met figuur 3D),maar het behoud van de specifieke functie van het eiwit kan niet op deze manier worden bepaald, wat een potentieel aanzienlijk nadeel is.
De hierin beschreven methoden zijn gebruikt voor de snelle isolatie en karakterisering van een chimerisch fusie-eiwit dat menselijke Fc (Gal-1hFc) uitdrukt. Deze gestroomlijnde workflow kan worden toegepast op de isolatie van vrijwel elk molecuul dat een Fc-fragment bezit (IgG-antilichamen, andere Fc-fusie-eiwitten, Fc-fragmenten zelf, enz.)en kan gemakkelijk worden aangepast op basis van individuele laboratoriumvoorkeuren. Bovendien is dit protocol relatief snel en eenvoudig, zelfs voor beperkte ervaring of volledig onervaren laboratoriumpersoneel, waardoor het geschikt is voor gebruik in middelbare school- of universiteitsbiologie, chemie en (bio)chemische engineeringcursussen die principes van eiwitisolatie en karakterisering behandelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er valt niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de heer Luis F. Delgadillo (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University), mr. Matthew H. Williams (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University) en Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School) bedanken voor deskundige technische bijstand. De auteurs willen ook de che 404/BME 504 van de winter 2011 en de studenten che 4830/BME 5830 (Department of Chemical and Biomolecular Engineering and Biomedical Engineering Program, Ohio University) bedanken voor technisch advies en discussie. Dit werk werd ondersteund door National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI grant 1R15CA1618 30-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctorale Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) en NIH NCCAM-beurs R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
