Summary
Par rapport à la chromatographie d’affinité traditionnelle utilisant des colonnes remplies de perles d’agarose de protéine A, les adsorbeurs membranaires de protéine A peuvent accélérer considérablement l’isolement à l’échelle du laboratoire des anticorps et d’autres protéines exprimant des fragments Fc. Des méthodes d’analyse et de quantification appropriées peuvent accélérer davantage le traitement des protéines, permettant d’isoler et de caractériser en une journée de travail, au lieu de plus de 20 heures de travail.
Abstract
La purification à l’échelle du laboratoire à l’échelle industrielle des biomolécules des surnageants de culture cellulaire et des solutions cellulaires lysées peut être réalisée à l’aide de la chromatographie d’affinité. Bien que la chromatographie d’affinité utilisant des billes d’agarose A poreuses emballées dans des colonnes soit sans doute la méthode la plus courante d’isolement à l’échelle du laboratoire d’anticorps et de protéines recombinantes exprimant des fragments fc d’IgG, cela peut être un processus long et coûteux. Les contraintes de temps et financières sont particulièrement intimidantes dans les petits laboratoires de sciences fondamentales qui doivent récupérer des centaines de microgrammes à des quantités de milligrammes de protéines à partir de solutions diluées, mais qui n’ont pas accès à des systèmes d’administration de liquides à haute pression et / ou à du personnel spécialisé dans les bioséparations. De plus, la quantification et la caractérisation des produits peuvent également allonger excessivement le temps de traitement sur plusieurs jours de travail et gonfler les dépenses (consommables, salaires, etc.). Par conséquent, un protocole rapide, peu coûteux, mais efficace est nécessaire pour l’isolement à l’échelle de laboratoire et la caractérisation des anticorps et d’autres protéines possédant un fragment de Fc. À cette fin, nous avons conçu un protocole qui peut être complété par un personnel technique à expérience limitée en moins de 9 heures (environ une journée de travail) et aussi rapidement que 4 heures, par opposition aux méthodes traditionnelles qui exigent plus de 20 heures de travail. La plupart des équipements requis sont facilement disponibles dans les laboratoires standard de science biomédicale, de biochimie et de génie (bio)chimique, et tous les réactifs sont disponibles dans le commerce. Pour démontrer ce protocole, on présente des résultats représentatifs dans lesquels galectin-1 murin chimérique fusionné au Fc humain (Gal-1hFc) du surnageant de culture cellulaire utilisant un adsorbeur de membrane de la protéine A. Gal-1hFc purifié a été quantifié utilisant une procédure occidentale accélérée d’analyse buvarde et caractérisé utilisant la cytométrie d’écoulement. Le flux de travail rationalisé peut être modifié pour d’autres protéines exprimant fc, telles que les anticorps, et/ou modifié pour intégrer d’autres méthodes de quantification et de caractérisation.
Introduction
L’isolement des anticorps et des protéines recombinantes exprimant des fragments de l’immunoglobuline G (IgG) Fc à partir de surnageants de culture cellulaire et de solutions cellulaires lysées diluées peut être accompli en utilisant la chromatographie d’affinité de la protéine A. Dans les laboratoires de sciences fondamentales et d’ingénierie et l’industrie, les colonnes remplies d’agarose, de verre ou de perles polymères revêtues de protéines poreuses A sont les plus couramment utilisées pour la chromatographie d’affinité, malgré des coûts financiers élevés et de longs délais de traitement1-3. Il est bien connu que la chromatographie d’affinité représente le plus grand goulot d’étranglement des dépenses et du traitement en laboratoire et en milieu industriel2,4. En conséquence, de nombreuses améliorations ont été développées pour réduire les coûts et le temps de traitement sans sacrifier la récupération globale du produit à partir du train de processus1,2,5-7. La chromatographie d’affinité utilisant une protéine membranaire de protéines2,5,7-10est particulièrement prometteuse pour l’isolement des anticorps et autres protéines exprimant fc. Alors que la capture fc en chromatographie sur colonne est limitée en diffusion(c’est-à-dire que la protéine exprimant Fc doit diffuser dans et à travers les pores internes pour atteindre la majorité de la protéine A) avec une chute de pression élevée à travers la colonne, le transport de masse dans les adsorbeurs membranaires est entraîné par la convection en vrac, ce qui permet d’éviter les limitations de diffusion8,9,11,12. De plus, la chute de pression à travers l’adsorbeur membranaire est faible, permettant ainsi des débits de perfusion plus rapides par rapport aux colonnes bourrées de perles8,9,11,12. Ainsi, pour l’isolement à l’échelle du laboratoire, la chromatographie sur membrane devrait réduire le temps d’isolement de plusieurs heures et augmenter la capture du produit par rapport à la chromatographie sur colonne. En outre, des modèles mathématiques pour l’adsorption d’IgG dans les adsorbeurs membranaires ont été proposés8,9,11,12, permettant ainsi aux utilisateurs finaux de prédire les performances en laboratoire.
Un autre goulot d’étranglement dans les laboratoires de sciences fondamentales et d’ingénierie est la caractérisation de la protéine exprimant Fc. Cependant, le choix de méthodes appropriées pour effectuer des essais de caractérisation, comme les western blots, peut réduire considérablement le temps consacré aux essais de produits. Par exemple, le transfert semi-dentaire dans un système tampon discontinu peut accomplir le transfert électrophorétique de protéines d’un gel SDS-PAGE vers une membrane de polyvinyl difluoridine (PVDF) en quelques minutes, par opposition à un transfert de 1 à 2 heures en réservoir (humide) dans un système tampon continu13.
Un protocole rapide, peu coûteux, et efficace pour isoler et caractériser une protéine de fusion chimérique exprimant un fragment de Fc d’IgG humain est décrit ci-dessus. La plupart des équipements sont facilement disponibles dans les laboratoires standard de sciences biomédicales fondamentales, de biologie, de chimie et de génie (bio)chimique, et tous les réactifs sont disponibles dans le commerce. Bien que des résultats représentatifs aient été générés à partir de l’isolement et de la caractérisation d’une protéine murine galectin-1/human Fc de fusion (Gal-1hFc), le protocole rationalisé peut être appliqué à l’isolement d’autres molécules qui possèdent un fragment de Fc, telles que des anticorps, des fragments de Fc eux-mêmes, ou d’autres protéines de fusion de Fc. Nos améliorations ont considérablement réduit le temps de traitement (aussi peu que 4 heures, mais plus généralement ~ 9 heures, par rapport à plus de 20 heures de travail) tout en obtenant une récupération de produit similaire ou améliorée par rapport aux méthodes standard.
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Protocol
1. Vérifiez l’affinité pour la protéine A
- Vérifier que la protéine exprimant Fc (protéine de fusion recombinante ou anticorps IgG, ci-après appelée « protéine ») a une affinité acceptable pour la protéine A14-17 avant d’utiliser l’adsorbeur membranaire de la protéine A, et tester la présence de la protéine dans la solution mère(p. ex. surnageant de culture cellulaire clarifié par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min aux cellules en suspension de granulés). Utilisez la cytométrie de flux, le western blotting, ELISA, etc. pour détecter la fonction protéique et/ou la présence de Fc, en fonction des préférences du laboratoire. Idéalement, quantifier la protéine dans le surnageant de culture cellulaire (étape 6) pour éviter de dépasser la capacité d’adsorbeur membranaire de la protéine A. Procéder si des protéines sont détectées.
2. Préparer l’adsorbeur membranaire de protéine A et le surnageant de culture cellulaire
- Suivez les instructions du fabricant pour préparer l’adsorbeur à membrane. Ne laissez jamais l’air entrer dans l’adsorbeur membranaire. Toutes les solutions perfusées à travers l’adsorbeur membranaire doivent être à température ambiante et préfiltrées à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Remplissez une seringue de 10 ml avec une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco filtrée de 0,22 μm ou un tampon de choix et déchargez des bulles d’air. Perfuser DPBS pour retirer la solution de stockage et équilibrer l’adsorbeur à membrane immédiatement avant utilisation.
- Filtrer le surnageant de culture cellulaire immédiatement avant la perfusion à travers l’adsorbeur membranaire, à l’aide d’une unité de filtration stérile de 0,22 μm entraînée par le vide.
3. Chargez l’adsorbeur de membrane de protéine A
- Aspirez le surnageant de culture cellulaire dans une seringue Luer Lock (30 ml ou plus) et déchargez toutes les bulles d’air.
- Assemblez les matériaux et l’équipement comme le montre la figure 1. Connectez la seringue à l’entrée de l’adsorbeur membranaire. Fixez un tube flexible à la sortie de l’adsorbeur membranaire. Si vous le souhaitez, placez un filtre à seringue de 0,22 μm entre la seringue et l’adsorbeur membranaire. Utilisez un ballon ou une bouteille pour capter le flux à travers (également connu sous le nom de filtrat), à partir de l’adsorbeur.
- Réglez la pompe de la seringue sur le débit volumétrique souhaité, mais ne dépassez pas le débit recommandé par le fabricant(par exemple 10 ml/min). Impréner le surnageant de culture cellulaire à travers l’adsorbeur membranaire, recueillant le flux à travers dans un bécher ou un autre récipient. Rechargez la seringue avec les surnageants nécessaires.
- Si vous le souhaitez, testez le flux à travers la présence de protéines en utilisant la cytométrie de flux, western blotting, ELISA, etc. en fonction des préférences du laboratoire. Il n’est généralement pas nécessaire de reperfuse le flux à travers.
4. Elute Protein de l’adsorbeur membranaire
- Laver l’adsorbeur membranaire avec 10 ml de DPBS pour éliminer toute protéine non liée.
- Protéine éluée de l’adsorbeur membranaire au débit souhaité(par exemple 1 ml/min) en utilisant 10 à 15 ml de tampon d’élution(par exemple, tampon d’élution à base d’amine (pH 2,8)). Attraper l’éluat dans un tube contenant un tampon neutralisant(par exemple 1 M Tris (pH 9,4)) à 10 % du volume d’élution (1,0-1,5 ml).
- Alternativement, la protéine éluée en un ml s’incrémente dans des tubes contenant 100 μl de tampon de neutralisation, en utilisant un volume total de tampon d’élution de 10-15 ml. Utilisez la méthode de caractérisation préférée pour tester la présence de protéines dans chaque fraction.
- Régénérer l’adsorbeur membranaire selon les instructions du fabricant. Perfuser 10 ml de DPBS filtré de 0,22 μm ou tampon de choix, puis 10 ml de NaOH filtré de 0,22 μm dans 1 N NaCl, et enfin 10 ml de DPBS filtré de 0,22 μm. Remplissez l’adsorbeur membranaire avec de l’éthanol à 20 % dans du DPBS pour un stockage à long terme à 4 ºC.
5. Concentrez et dialysez la protéine
- Déposer tout éluat (ou fractions d’élution contenant des protéines tel que déterminé à l’étape 4.3) dans une unité de filtre centrifuge de 10 kDa de coupure de poids moléculaire. Suivez les instructions du fabricant pour la centrifugation.
- Dialyser le rétentiment dans une unité de dialyse de petit volume (coupure de poids moléculaire de 10 kDa) contre le tampon de choix, en suivant les instructions du fabricant. Il peut être nécessaire d’ajouter un tampon au matériau dialysé si la précipitation des protéines est préoccupante. Si vous le souhaitez, le matériau dialysé peut être réfrigéré jusqu’à l’étape 6, mais le stockage à long terme sans conservateurs n’est pas recommandé.
6. Quantifier et caractériser le produit purifié dans une procédure de buvardage occidental accéléré
- Résoudre les étalons de protéines purifiées et fc sur le gel de choix par SDS-PAGE, dans des conditions réductrices ou non réductrices comme vous le souhaitez18-20. Utilisez un mini gel plutôt qu’un gel midi pour minimiser le temps d’exécution.
- Si ce n’est pas déjà fait, déterminer la plage d’étalons Fc sur laquelle le signal de bande varie linéairement par rapport à la quantité de signaux chargés(p. ex. 0,1-1 mg). Utilisez le même gel, les mêmes conditions de fonctionnement, les mêmes conditions de transfert et les mêmes réactifs qui seront utilisés pour quantifier et caractériser les protéines purifiées.
- Chargez plusieurs quantités d’échantillons de protéines purifiées, y compris des échantillons dilués avec du DPBS, pour vous assurer que les signaux de bande de protéines purifiées se situent dans la plage de signaux linéaires des étalons Fc dans l’analyse d’images.
- Transférer les protéines du gel vers une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans un système tampon discontinu à l’aide d’un buvardsemi-dentaire 13,en suivant les instructions du fabricant du buvard. Le temps de transfert est généralement de 5 à 10 minutes. Si vous le souhaitez, Coomassie tache le gel après transfert pour vérifier l’efficacité du transfert21.
- Effectuer un immunoblotting avec de l’anti-Fc ou de l’anti-IgG conjugué à la phosphatase alcaline (AP) ou à la peroxydase de radis de cheval (HRP), selon les préférences du laboratoire, à l’aide d’un système de détection de protéines assisté par vide. Le temps d’immunoblotting est généralement inférieur à 1 heure.
- Développer l’immunoblot en utilisant le substrat et la méthode de choix(p. ex. substrat AP et chimiluminescence améliorée).
- Quantifier les protéines purifiées par analyse d’image. Effectuez une régression linéaire sur les signaux de bande des étalons Fc. Si R2>0,90, utilisez l’équation de la ligne pour calculer la quantité de protéines à partir de son ou ses signaux de bande. Tenir compte de la dilution de l’échantillon si nécessaire. Étant donné que la quantification de la protéine est effectuée sur la base de Fc, ajustez la valeur des différences de poids moléculaire entre la protéine et Fc. SiR2<0,90, répétez l’étape 6 dans son intégralité.
- Valider les protéines à l’aide d’essais fonctionnels ou de méthodes pour détecter fc via la cytométrie de flux, western blotting, ELISA, etc. en fonction des préférences du laboratoire.
- Diluer les protéines à la concentration désirée et/ou ajouter les conservateurs ou stabilisants désirés à la solution de protéines purifiées avant de les aliquoter pour le stockage à long terme, congelé ou autre.
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Representative Results
Le protocole simplifié pour l’isolement et la caractérisation des protéines exprimant Fc est couramment utilisé pour traiter la galectine-1 murine chimérique fusionnée au Fc humain (Gal-1hFc) à partir de surnageants dilués de culture cellulaire. L’organigramme de la figure 2 illustre le flux de travail et l’heure de chaque étape du protocole. Pour un lot typique de 300 ml de surnageant, le temps de traitement total est d’environ 9 heures lorsque le test facultatif de cytométrie en flux des fractions d’élution est effectué. Si toute l’analyse de cytométrie de flux est omise, en raison de l’absence d’un cytomètre de flux ou d’une préférence de laboratoire individuelle, le temps de traitement total peut être aussi bref que 4 heures. En général, le temps de traitement dépend de l’expérience de l’opérateur, de la quantité de surnageant traité et des méthodes de quantification et de caractérisation effectuées.
La cytométrie d’écoulement a été employée pour tester la présence de Gal-1hFc fonctionnel(c.-à-d. Gal-1 capable de détecter ses ligands sur des cellules de cancer du sein) dans le surnageant de culture cellulaire de départ ; milieu de culture cellulaire fraîche a servi de témoin négatif18,22 . Une fois que Gal-1hFc dans le surnageant de culture cellulaire a été vérifié(figure 3A),la charge de l’adsorbeur membranaire de la protéine A a été accomplie par perfusion surnageante à 10 ml/min (résultant en une vitesse superficielle ou un flux volumétrique de 0,5 cm/min dans un adsorbeur membranaire de 2 ml) à l’aide d’une pompe à seringue(Figure 1). L’adsorbeur membranaire a efficacement capturé et retenu Gal-1hFc, laissant le flux à travers essentiellement épuisé de Gal-1hFc (absence de percée, Figure 3A). Gal-1hFc a été élué de l’adsorbeur membranaire par incréments d’un millilitre à 1 ml/min (flux volumétrique = 0,05 cm/min) à l’aide d’un tampon acide à base d’amine (pH 2,8), et des fractions d’élution neutralisées ont ensuite été testées pour la présence de Gal-1hFc fonctionnel à l’aide de la cytométrie en flux(figure 3B). Gal-1hFc signal séquentiellement augmenté de l’élution 1 (approximativement égal à un contrôle négatif) à un maximum à l’élution 3, puis diminué à un niveau presque constant aux élutions 9 et 10(figures 3B et 3C). L’élution finale 10 n’a pas atteint l’équivalence avec le signal de commande négatif en raison d’une certaine rétention de l’adsorbeur de Gal-1hFc(figures 3B et 3C). Toutefois, cette perte a été jugée acceptable. Comme méthode alternative pour tester la présence, mais non la fonction, de Gal-1hFc dans diverses solutions, l’analyse cytométrique en flux de la capacité de Gal-1hFc à se lier aux billes de polystyrène de la protéine A (par reconnaissance de la région hFc) peut être utilisée(Figure 3D).
Après l’essai de fraction d’élution, les élutions Gal-1hFc-positives 2 à 10 ont été concentrées puis dialysées contre le DPBS pour obtenir du Gal-1hFc purifié dans le tampon désiré. La quantification et la caractérisation du Gal-1hFc purifié ont été exécutées dans un procédé éponger occidental accéléré par transfert semidry et immunoblotting aspirateur-aidé. En comparant le signal Gal-1hFc aux étalons de quantification hFc, la quantité et la qualité du matériau purifié ont été déterminées(figures 4A-C). Les intensités de signal des bandes standard hFc (une bande à ~25 kDa chacune sur la figure 4A,voies 1 à 5) étaient linéairement liées à la quantité de hFc présente(figure 4C). Gal-1hFc (une bande à ~40 kDa dans la figure 4A,voie 6) et dégradé Gal-1hFc (une bande à ~40 kDa et une bande à ~25 kDa dans la figure 4A,voie 7) signaux étaient dans la plage de normes(Figure 4A,voies 1-5). La concentration de Gal-1hFc purifié(figure 4A,voie 6) sur la base de hFc a été déterminée à 450 μg/ml par traitement d’image(figure 4C). En tenant compte du poids moléculaire de Gal-1hFc, la concentration du matériau purifié était de 720 g/ml. En revanche, trop de Gal-1hFc purifié a été chargé dans les voies 6 et 7 de l’Ouest sur la figure 4B,ce qui a généré des signaux qui ont saturé ou dépassé la plage d’étalons hFc, empêchant ainsi la quantification. Alternative au western blotting, la coloration au gel Coomassie21 peut servir de contrôle qualité rapide et/ou de méthode de quantification(figure 4D). Notez qu’une bande ~10 kDa, en plus des bandes ~25 kDa et ~40 kDa, était présente dans l’échantillon Gal-1hFc dégradé(figure 4D,voie 2). Cette bande est dégradée Gal-1hFc qui n’était pas réactive avec l’anticorps de détection utilisé dans les western blots(figures 4A et 4B).
Après quantification et caractérisation finale du Gal-1hFc purifié, des BSA stériles ont été ajoutés pour atteindre une concentration finale de BSA de 0,5%. Le matériau purifié a ensuite été aliquoted et stocké à -20 ºC. En plus de Gal-1hFc, nous avons utilisé ce protocole simplifié pour isoler le double mutant Gal-1hFc et Gal-7hFc. Elle peut également être étendue à pratiquement n’importe quelle molécule possédant un fragment Fc (anticorps, fragments Fc eux-mêmes, autres protéines de fusion Fc, etc.d’espèces et d’isotypes ayant une affinité pour la protéine A14-17).
Figure 1. Schéma de l’appareil expérimental. Les anticorps et les protéines de fusion recombinantes exprimant des fragments Fc d’IgG peuvent être isolés à partir de solutions diluées à l’aide d’un adsorbeur membranaire de protéine A. L’adsorbeur membranaire est relié par un raccord de verrouillage Luer à une seringue de 30 ml sur une pompe à seringue, qui perfuse la solution contenant des protéines à travers l’adsorbeur membranaire à un débit volumétrique souhaité.
Figure 2. Processus de flux de travail pour l’isolation de Gal-1hFc du surnageant de culture cellulaire. Cet organigramme illustre le protocole pour l’isolement et la caractérisation d’une galectine-1 murine chimérique/protéine de fusion Fc-expression humaine (Gal-1hFc) du surnageant de culture cellulaire. En général, le temps de traitement varie en fonction de l’expérience de l’opérateur, de la quantité de surnageant traité et des méthodes de quantification et de caractérisation utilisées.
Figure 3. Analyse cytométrique en flux de solutions contenant gal-1hFc. La cytométrie de flux est utilisée pour évaluer si gal-1hFc fonctionnel est présent dans le milieu de culture cellulaire frais, le surnageant de culture cellulaire, le flux d’adsorbeur membranaire et les fractions d’élution. le fc anti-humain APC-conjugué de F (ab') 2 a été employé comme anticorps secondaire. Toutes les données ont été acquises à l’aide d’un cytomètre/trieur de flux facs Aria Special Order Research Product et analysées à l’aide du logiciel FlowJo. Les marqueurs de chaque histogramme représentent 2 % de la population témoin négative(c.-à-d. milieu de culture cellulaire fraîche pour (A) et isotype hFc pour (B)). (A) Superposition d’histogramme de cytométrie de flux de cellules de cancer du sein BT-20 étiquetées avec le milieu frais de culture cellulaire (rouge), le surnageant de culture cellulaire (bleu), ou l’écoulement d’adsorbeur de membrane (vert). Le surnageant de culture cellulaire a contenu un niveau bas de Gal-1hFc fonctionnel qui a avec succès lié aux ligands galectin-1 sur les cellules BT-20, alors que le milieu frais de culture cellulaire et l’adsorbeur de membrane traversaient le Gal-1hFc manqué, comme prévu. (B) Histogrammes de cytométrie d’écoulement des cellules BT-20 marqués avec des fractions d’élution de l’adsorbeur de membrane. Le signal Gal-1hFc sur les cellules BT-20 augmente séquentiellement jusqu’à un maximum à l’élution 4 puis diminue, mais pas au niveau de fond(c’est-à-dire un signal équivalent au milieu de culture cellulaire frais). (C) Les intensités de fluorescence moyennes des échantillons en(B)peuvent également être tracées en fonction du nombre de fractions d’élution pour générer une courbe d’élution. L’intensité de fluorescence moyenne des cellules étiquetées avec le contrôle d’isotype hFc est indiquée comme une ligne de référence. (D) Alternativement, l’analyse cytométrique en flux de Gal-1hFc lié à des billes de polystyrène de la protéine A peut être utilisée pour tester la présence de protéines, mais non la fonction, dans diverses solutions. le fc anti-humain APC-conjugué de F (ab') 2 a été employé comme anticorps secondaire. À gauche : Superposition d’histogramme de cytométrie en flux du milieu de culture cellulaire frais (rouge), du surnageant de culture cellulaire (bleu) et de l’échantillon tampon vierge (vert). Milieu : Histogramme du contrôle d’isotype hFc. L’incubation avec 10 mg/ml de hFc est un témoin positif pour la capture de la protéine A. Panneau de droite : Histogramme de perles de protéine A incubées avec du Gal-1hFc purifié, sur la base de 10 mg hFc/ml. Cliquez ici pour voir l’image plus grande.
Figure 4. Quantification et caractérisation de Gal-1hFc à l’aide du western blotting et de l’analyse d’image. (A) Les voies 1 à 5 sont des normes hFc de 0,1 à 0,5 μg par incréments de 0,1 μg, et les voies 6 et 7 sont purifiées Gal-1hFc à partir de deux lots de production différents. Les échantillons ont été résolus sur un gel de TGX de 4-15% par SDS-PAGE dans des conditions réductrices, puis transférés à la membrane de PVDF utilisant des conditions de transfert discontinues. La membrane a été bloquée et incubée avec anti-hIgG-AP utilisant une technique immunoblotting assistée par vide. Les signaux ont été développés avec un réactif ECL et visualisés sur un imageur Bio-Rad ChemiDoc XRS. Les signaux pour les étalons hFc dans les voies 1 à 5 variaient linéairement (tracés en (C)), et les signaux pour les deux échantillons gal-1hFc purifiés dans les voies 6 et 7 étaient dans la plage de mesure linéaire. La voie 7 montre deux bandes, Gal-1hFc et vraisemblablement fragment hFc, indiquant la dégradation de la protéine. (B) Si trop de Gal-1hFc purifié est chargé, le signal peut saturer ou dépasser la plage de signaux linéaires, empêchant la quantification (voies 6 et 7). Les voies, le gel et les conditions de fonctionnement sont les mêmes que dans (A). (C) Le logiciel d’analyse Image Lab permet d’entrer des quantités absolues connues d’étalons hFc à partir d’un immunoblot, puis détermine la quantité de la ou des bandes inconnues grâce à son signal par rapport à la régression linéaire des étalons (y = 1,36 x10 -7*x + 0,105; R2 = 0,95). Les données montrées proviennent de l’analyse de l’immunoblot dans (A). (D) La qualité du Gal-1hFc purifié peut être évaluée à l’aide de la coloration coomassie. La voie M est un marqueur de poids moléculaire, la voie 1 est purifiée Gal-1hFc (même échantillon que la voie 6 en (A) et (B)), la voie 2 est dégradée Gal-1hFc (même échantillon que la voie 7 en (A) et (B)), et la voie 3 est de 0,2 mg hFc standard. Le gel et les conditions de fonctionnement étaient les mêmes que dans(A)et(B). Cliquez ici pour agrandir l’image.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus a été développé pour isoler et caractériser rapidement une protéine de fusion chimérique exprimant fc humain (Gal-1hFc), sans compromettre de manière significative la récupération de produit ou gonfler le coût. Les composants clés du flux de travail rationalisé sont un adsorbeur à membrane de protéine A pour l’isolement, et le transfert semi-à-papier et l’immunoblotting assisté par vide pour la caractérisation par western blotting.
La diminution spectaculaire du temps de traitement pour l’isolement et la caractérisation de Gal-1hFc à partir de 300 ml de surnageant de culture cellulaire (environ 9 heures dans le protocole simplifié par rapport à 20+ heures dans un protocole traditionnel) est en grande partie attribuable à l’incorporation des composants clés susmentionnés, en particulier l’adsorbeur membranaire. Au débit maximal recommandé de 10 ml de surnageant/min, la charge de l’adsorbeur membranaire peut être complétée en 30 min. La récupération gal-1hFc des adsorbeurs à membrane de protéine A varie généralement de 10 à 30% dans nos laboratoires, avec une récupération d’environ 30% systématiquement obtenue par du personnel de laboratoire expérimenté lorsque les concentrations deGal-1hFc dans le surnageant de culture cellulaire sont de 5 à 10 mg / ml. Tout au plus, environ 50% de récupération a été atteint. La récupération complète du produit est pratiquement impossible en raison des pertes inhérentes dues (a) à la rétention spécifique de la protéine exprimant fc par la protéine A sur l’adsorbeur membranaire(figures 3B et 3C)et (b) à l’adsorption de surface non spécifique de la protéine tout au long de l’isolement. Il est important que chaque laboratoire détermine si la récupération du produit avec un adsorbeur membranaire est acceptable en fonction de ses besoins; si la modification du débit de charge ou de la teneur en matière première(par exemple, le surnageant de culture de concentration de cellules protéiques souhaitée, ce qui peut être particulièrement difficile) peut améliorer la récupération du produit8,ou si la modification du protocole d’élution (étape 4) pour obtenir une récupération plus élevée vaut l’augmentation du temps, des dépenses et des efforts, ou les dommages possibles à la protéine ou à l’adsorbeur membranaire lui-même (principalement par le pH du tampon d’élution, la concentration en sel, etc.). Contrairement à l’utilisation de l’adsorbeur membranaire, il faut environ 10 heures pour effectuer deux cycles de perfusion à travers une colonne18bourrée de perles de protéine A de 1 ml au débit maximal tolérable de 1 ml/min, et seulement 10-20% Gal-1hFc est généralement récupéré. Comme dernière préoccupation, une analyse des coûts des perles de protéine A de différents fabricants peut influer sur la décision d’utiliser une colonne standard remplie de perles par rapport à un adsorbeur à membrane unique. Compte tenu de l’ensemble de ces facteurs, l’utilisation d’un adsorbeur membranaire pour l’isolement à l’échelle du laboratoire des protéines exprimant fc peut offrir aux petits laboratoires des avantages significatifs par rapport à la chromatographie sur colonne2,5,8,10.
L’utilisation d’un mini gel pour SDS-PAGE, le transfert électrophorétique discontinu semi-dentaire des protéines du gel vers la membrane PVDF et l’immunoblotting assisté par vide offrent un gain de temps significatif par rapport aux gels midi, au transfert en réservoir (humide) et à l’immunomarquage basé sur la diffusion pour la quantification et la caractérisation de Gal-1hFc (2 heures contre 8 heures). Chaque laboratoire doit déterminer si le protocole occidental accéléré est approprié pour la quantification et la caractérisation de sa protéine. Les avantages comprennent (a) un court délai d’exécution même par du personnel de laboratoire inexpérimenté, (b) la capacité de déterminer si la protéine est intacte ou s’est dégradée en raison du traitement ou de la contamination(figure 4B),et (c) une relative facilité de quantification par les programmes de traitement d’images(figure 4C). Cependant, (a) l’augmentation des coûts des réactifs et des consommables peut être inacceptable malgré le temps compensé pour les salaires, (b) la quantification traditionnelle des protéines par A280, ELISA, test de Bradford ou dosage BCA peut être préférée23-27,ou (c) les laboratoires peuvent ne pas avoir accès à un buvard semi-ary ou à un système de détection de protéines assistées par vide pour l’immunoblotting. Dans de tels cas, la coloration de Coomassie des protéines résolues SDS-PAGE21(figure 4D)ou le buvard à points ou fentes28 sont de bonnes alternatives.
La cytométrie de flux a été utilisée dans trois tests distincts de 90 minutes pour la détection de Gal-1hFc fonctionnel dans ce protocole simplifié(Figure 2),qui est le même que dans le traitement traditionnel18,22. Toute autre méthode de caractérisation telle que western blotting ou ELISA serait également acceptable. Les essais fonctionnels sont optimaux(p. ex. détection de ligands à la galectine-1 sur les cellules cancéreuses du sein, figures 3A-C). Alternativement, la détection de l’unité Fc serait acceptable (similaire à la figure 3D),mais la rétention de la fonction spécifique de la protéine ne peut pas être déterminée de cette manière, ce qui est un inconvénient potentiellement important.
Les méthodes décrites ici ont été utilisées pour l’isolement rapide à l’échelle de laboratoire et la caractérisation d’une protéine de fusion chimérique exprimant fc humain (Gal-1hFc). Ce flux de travail rationalisé peut être appliqué à l’isolement de pratiquement n’importe quelle molécule qui possède un fragment Fc (anticorps IgG, autres protéines de fusion Fc, fragments Fc eux-mêmes, etc.)et peut être facilement modifié en fonction des préférences individuelles du laboratoire. En outre, ce protocole est relativement rapide et facile, même pour le personnel de laboratoire à expérience limitée ou complètement inexpérimenté, ce qui le rend adapté à une utilisation dans les cours de biologie, de chimie et de génie (bio)chimique du secondaire ou du collège qui couvrent les principes d’isolation et de caractérisation des protéines.
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Disclosures
Il n’y a rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier M. Luis F. Delgadillo (Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de l’Ohio), M. Matthew H. Williams (Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de l’Ohio) et M. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women’s Hospital et Harvard Medical School) pour leur assistance technique d’experts. Les auteurs souhaitent également remercier les étudiants che 404/BME 504 de l’hiver 2011 et de l’automne 2012 CHE 4830/BME 5830 (département de génie chimique et biomoléculaire et de génie biomédical, Université de l’Ohio) pour leurs conseils techniques et leurs discussions. Ce travail a été soutenu par la subvention d’instrumentation de recherche majeure CBET-1039869 (MMB) de la National Science Foundation (NSF), la subvention de recherche CBET-1106118 (MMB), la subvention de recherche A050422 de la Fondation de la dermatologie (SRB), la subvention NCI des National Institutes of Health (NIH) 1R15CA161830-01 (MMB), la bourse postdoctorale NIH Kirschstein-NRSA F32CA144219-01A1 (SRB), la subvention NIH/NCI R01CA173610 (CJD) et la subvention R01AT004628 (CJD) des NIH NCCAM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
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