Summary
단백질 A 아가로즈 비드가 포장된 컬럼을 이용한 전통적인 친화성 크로마토그래피와 비교하여, 단백질 A 멤브레인 흡착제는 항체 및 기타 Fc 단편 발현 단백질의 실험실 규모 절연을 크게 가속화할 수 있습니다. 적절한 분석 및 정량화 방법은 단백질 처리를 더욱 가속화할 수 있으므로 20시간 이상의 근무 시간이 아닌 한 작업 시간에 격리/특성을 완료할 수 있습니다.
Abstract
세포 배양 체와 용세포 용액으로부터 생체 분자의 산업 규모의 정제에 대한 실험실 규모는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 달성 될 수있다. 다공성 단백질A아가로즈 구슬을 사용하여 열에 포장된 친화성 크로마토그래피는 틀림없이 IgG의 Fc 단편을 발현하는 항체 및 재조합 단백질의 실험실 스케일 절연의 가장 일반적인 방법이지만, 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 드는 과정이 될 수 있다. 희석 솔루션에서 수백 마이크로그램의 단백질을 밀리그램으로 회수해야 하지만 고압 액체 전달 시스템 및/또는 생체 분리 에 대한 전문 지식을 갖춘 인력에 대한 접근이 부족한 소규모 기초 과학 실험실에서는 시간과 재정적 제약이 특히 어렵습니다. 또한, 제품 정량화 및 특성화는 또한 여러 근무일에 걸쳐 처리 시간을 과도하게 연장하고 비용(소모품, 임금 등)을부풀릴 수 있습니다. 따라서, 실험실 규모 격리 및 항체 및 Fc 단편을 소유한 다른 단백질의 특성화를 위해서는 빠르고 저렴하면서도 효과적인 프로토콜이 필요합니다. 이를 위해 20시간 이상의 근무 시간을 요구하는 기존의 방법과는 달리 9시간 미만(약 1일 근무)과 4시간 이내에 제한된 경험의 기술 직원이 완료할 수 있는 프로토콜을 고안했습니다. 대부분의 필수 장비는 표준 생의학 과학, 생화학 및 (바이오) 화학 공학 실험실에서 쉽게 사용할 수 있으며 모든 시약은 시판됩니다. 이러한 프로토콜을 입증하기 위해, 대표적인 결과는 키메라 뮤린 갈렉틴-1이 세포 배양 상수로부터 인간 Fc(Gal-1hFc)에 융합되어 단백질 A막 흡착기를 사용하여 분리되었다는 것을 제시한다. 정제 된 Gal-1hFc는 신속한 서양 블로팅 분석 절차를 사용하여 정량화되었으며 유동 세포 측정을 사용하여 특징지어졌습니다. 간소화된 워크플로우는 항체와 같은 다른 Fc 발현 단백질을 위해 수정하거나 대체 정량화 및 특성화 방법을 통합하도록 변경할 수 있습니다.
Introduction
세포 배양 초월제로부터 면역글로불린 G(IgG) Fc 단편을 발현하는 항체 및 재조합 단백질의 분리및 희석 된 세포 용액은 단백질 A 친화 크롬 토그래피를 사용하여 달성 될 수있다. 기초 과학 및 공학 실험실 및 산업에서다공성 단백질 A-코팅 아가로즈, 유리 또는 폴리머 비드로 포장 된 컬럼은 높은 재정적 비용과 긴 처리 시간1-3에도불구하고 친화성 크로마토그래피에 가장 일반적으로 사용됩니다. 친화성 크로마토그래피는 실험실 및 산업 설정2,4모두에서 가장 큰 비용과 처리 병목 현상을 나타낸다는 것이 좋습니다. 그 결과, 공정열차1,2,5-7에서전체적인 제품 회수를 희생하지 않고 비용 및 처리 시간을 줄이기 위해 수많은 개선이 개발되었다. 특히 항체 및 기타 Fc-발현 단백질의 분리에 대한 유망한 단백질A막흡착제 2,5,7-10을이용한 친화성 크로마토그래피이다. 컬럼 크로마토그래피에서 의Fc 포획은확산제한(즉, Fc-표현 단백질은 내부 모공을 통해 확산되어 단백질 A의 대부분에 도달해야 한다)와 고압 강하량, 멤브레인 흡착제의 질량 수송은 대량 대류에 의해 구동되어 확산한계를 8,9,11,12로방지한다. 또한 멤브레인 흡착기를 가로지르는 압력 강하가 낮기 때문에 구슬이 가득한 컬럼8,9,11,12에비해 관류 유량이 더 빨라집니다. 따라서, 실험실 스케일 절연을 위해 막 크로마토그래피는 절연 시간을 몇 시간 단축하고 컬럼 크로마토그래피에 비해 제품 캡처를 증가시킬 것으로 예상된다. 또한 멤브레인 흡착제에서 IgG 흡착에 대한 수학적 모델이제안되어최종 사용자가 실험실에서 성능을 예측할 수 있도록 합니다.
기초 과학 및 공학 실험실의 또 다른 병목 현상은 Fc 표현 단백질의 특성입니다. 그러나 서양 얼룩과 같은 특성화 를 완료하는 적절한 방법을 선택하면 제품 테스트에 소요되는 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 불연속 완충 시스템에서 반건조 전달은 연속 완충계통(13)에서탱크(젖은) 이송에서 1-2시간 반대로 SDS-PAGE 젤에서 폴리비닐 디플루오리딘(PVDF) 멤브레인으로 단백질의 전기전도 전달을 달성할 수 있다.
인간 IgG의 Fc 단편을 발현하는 키메라 융합 단백질을 분리하고 특성화하는 신속하고 저렴하며 효과적인 프로토콜은 본원에 기재된다. 대부분의 장비는 표준 기본 생체 의학, 생물학, 화학 및 (바이오) 화학 공학 실험실에서 쉽게 사용할 수 있으며 모든 시약은 시판됩니다. 대표적인 결과는 뮤린 갈렉틴-1/인간 Fc 키메라 융합 단백질(Gal-1hFc)의 격리 및 특성화로부터 생성되었지만, 유선형 프로토콜은 항체, Fc 단편 자체 또는 다른 융합 Fc 단백질과 같은 Fc 단편을 소유한 다른 분자의 격리에 적용될 수 있다. 우리의 개선은 표준 방법에 비해 유사하거나 개선 된 제품 복구를 달성하는 동안 (4 시간 이상 일반적으로 ~ 9 시간) 처리 시간을 극적으로 감소.
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Protocol
1. 단백질 A의 선호도 확인
- Fc-expressing 단백질(재조합 융합 단백질 또는 IgG 항체, 본선 "단백질"이라고 불리는 IgG 항체)이 단백질 A14-17을 사용하기 전에 단백질A에 대한 허용 가능한 친화력을 가지고 있는지 확인하고, 주식 용액에 단백질의 존재를 테스트한다(예를들어, 세포 배양 과민제는 1,00분에서 원심분리에 의해 정제됨). 유동 세포측정, 서양 블로팅, ELISA 등을 사용하십시오. 실험실 선호도에 따라 Fc의 단백질 기능 및/또는 존재를 감지합니다. 이상적으로, 단백질을 초과하는 것을 피하기 위해 세포 배양 상수(step 6)에서 단백질을 정량화하여 단백질A 막 흡착 용량을 초과하지 않도록 한다. 단백질이 검출되면 진행합니다.
2. 단백질 A 막 흡착및 세포 배양 상수 준비
- 멤브레인 흡착기를 준비하기위한 제조업체의 지침을 따르십시오. 공기가 멤브레인 흡착제에 들어가지 마십시오. 멤브레인 흡착을 통해 퍼진 모든 솔루션은 실온에서 0.22 μm 필터를 사용하여 사전 필터링되어야 합니다. 0.22 μm 여과 Dulbecco의 인산완충식염(DPBS) 또는 선택 및 방전 기포버퍼로 10ml 주사기를 채웁니다. DPBS를 퍼퓨즈하여 저장 용액을 제거하고 사용 직전에 멤브레인 흡착기를 평형화합니다.
- 진공 구동 0.22 μm 멸균 여과 장치를 사용하여 멤브레인 흡착장치를 통해 관류 직전에 세포 배양 상류제를 필터링합니다.
3. 단백질 A 멤브레인 애드버로드
- 흡인 세포 배양은 루어 록 주사기 (30ml 이상)로 상류하고 기포를 배출합니다.
- 그림 1에표시된 바와 같이 재료와 장비를 조립합니다. 주사기를 멤브레인 흡착기의 입구에 연결합니다. 멤브레인 흡착 콘센트에 유연한 튜브를 부착합니다. 원하는 경우 주사기와 멤브레인 흡착기 사이에 0.22 μm 주사기 필터를 놓습니다. 플라스크 나 병을 사용하여 흡착기에서 (여과라고도 함)을 통해 흐름을 잡습니다.
- 주사기 펌프를 원하는 체피흐름으로 설정하지만 제조업체의 권장유량(예: 10ml/min)을 초과하지 는 않습니다. 멤브레인 흡착을 통해 세포 배양 상류체를 퍼퓨징하여 비커 또는 기타 용기에서 흐름을 수집합니다. 필요한 슈퍼나티로 주사기를 다시 로드합니다.
- 원하는 경우, 유동 세포측정, 서양 블로팅, ELISA 등을사용하여 단백질의 존재를 통해 흐름을 테스트한다. 랩 기본 설정에 따라. 일반적으로 흐름을 다시 활성화하는 것은 필요하지 않습니다.
4. 멤브레인 흡착기의 엘루트 단백질
- 10ml DPBS로 멤브레인 흡착기를 세척하여 비바운드 단백질을 제거합니다.
- 10-15 ml의 용출 완충액(예: 아민 계 용출 완충제(예: 아민 계 용출 완충제(pH 2.8)을 사용하여 원하는유량(예: 1 ml/min)에서 멤브레인 흡착으로부터의 엘루트 단백질. 용출 부피(1.0-1.5 ml)의 10%에서 중성 화완충(예: 1M Tris(pH 9.4)을 함유한 튜브에서 용출을 잡으세요.
- 또는, 1ml 단위로 엘루트 단백질은 10-15ml용출 버퍼의 총 부피를 사용하여 중화 버퍼 100 μl을 포함하는 튜브로 증가한다. 선호하는 특성화 방법을 사용하여 단백질의 존재에 대해 각 분획을 테스트합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 멤브레인 흡착기를 재생합니다. 0.22 μm 여과DPBS 또는 선택의 버퍼의 10ml, 다음 1 N NaCl에서 0.22 μm 필터링 50 mM NaOH의 10 ml, 그리고 마지막으로 0.22 μm 필터링 DPBS의 10 ml. 4ºC에서 장기 저장을 위해 DPBS에 20 %의 에탄올로 멤브레인 흡착을 채웁니다.
5. 단백질을 농축하고 투석합니다.
- 10kDa 분자량 컷오프 원심 필터 유닛에 모든 용출(또는 4.3단계에서 결정된 단백질을 함유한 용출 분수)을 증착한다. 원심분리에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 제조업체의 지시에 따라 소량 투석 장치(10kDa 분자량 컷오프)로 재텐테이트를 선택한 버퍼에 대해 투석합니다. 단백질 강수량이 우려되는 경우 완충제는 투석 된 물질에 첨가해야 할 수도 있습니다. 원하는 경우, 투석된 물질은 6단계까지 냉장보관할 수 있지만 방부제 없이 장기간 보관하는 것은 권장되지 않는다.
6. 신속한 서부 블로팅 절차에서 정제 된 제품을 정량화하고 특성화하십시오.
- 원하는18-20으로감소 또는 비감소 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 선택된 젤에 대한 정제 단백질 및 Fc 표준을 해결한다. 미디 젤이 아닌 미니 젤을 사용하여 런타임을 최소화하십시오.
- 아직 알려지지 않은 경우로드량(예: 0.1-1 mg)에 대해 역역 신호가 선형으로 달라지는 Fc 표준 범위를 결정합니다. 정제 된 단백질을 정량화하고 특성화하는 데 사용되는 동일한 젤, 실행 조건, 이송 조건 및 시약을 사용합니다.
- 정제된 단백질 밴드 신호가 이미지 분석에서 Fc 표준의 선형 신호 범위 내에 있는지 확인하기 위해 DPBS로 희석된 샘플을 포함하여 다량의 정제된 단백질을 적재합니다.
- 블로터 제조업체의 지시에 따라 반건조블로터(13)를이용하여 불연속 완충 시스템에서 젤에서 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 전달한다. 전송 시간은 일반적으로 5-10 분입니다. 원하는 경우, 쿠마시는 전송효율(21)을확인하기 위해 이송 후 젤을 염색한다.
- 진공 보조 단백질 검출 시스템을 사용하여 실험실 선호도에 따라 알칼리인스파타제(AP) 또는 말 무 과산화제(HRP)에 공주된 안티-Fc 또는 안티-IgG로 면역블로팅을 수행한다. 면역 블로팅 시간은 전형적으로 1시간 미만이다.
- 기판 및 선택방법(예: AP 기질 및 향상된 케미발광)을 사용하여 면역블롯을 개발한다.
- 이미지 분석에 의한 정제 단백질을 정량화합니다. Fc 표준에서 밴드 신호에 선형 회귀를 수행합니다. R2>0.90인 경우, 선의 방정식을 사용하여 대역 신호에서 단백질 양을 계산합니다. 필요한 경우 샘플 희석을 고려합니다. 단백질의 정량화는 Fc에 기초하여 수행되기 때문에, 단백질과 Fc 사이의 분자량 차이에 대한 값을 조정합니다<.
- 기능적 분석이나 방법을 사용하여 단백질을 검증하여 유동 세포측정, 서양 블로팅, ELISA 등을통해 Fc를 검출한다. 랩 기본 설정에 따라.
- 단백질을 원하는 농도로 희석및/또는 장기간 보관, 냉동 또는 기타 용액을 알리쿼팅하기 전에 정제된 단백질 용액에 원하는 방부제 또는 안정제를 추가하십시오.
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Representative Results
Fc 발현 단백질의 격리 및 특성화를 위한 간소화된 프로토콜은 희석세포 배양 초나티로부터 인간 Fc(Gal-1hFc)에 융합된 키메라 뮤린 갈렉틴-1을 처리하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그림 2의 순서도는 프로토콜의 각 단계에 대한 워크플로우와 시간을 보여 줍니다. 300ml의 전형적인 미퍼나탄의 경우, 용출 분획의 선택적 유동 세포측정 시험이 수행될 때 총 처리 시간은 약 9시간입니다. 모든 유동 세포측정 분석이 생략되면, 유동 세포계 또는 개별 실험실 선호도의 부족으로 인해 총 처리 시간은 4시간으로 짧을 수 있다. 일반적으로 처리 시간은 작업자 경험, 처리된 상주 처리량 및 정량화 및 특성화 방법에 따라 달라집니다.
유동 세포측정은 개시 세포 배양 상신체에서 기능성 Gal-1hFc(즉, 유방암 세포에 대한 리간드를 검출할 수 있는 Gal-1)의 존재를 테스트하기 위해 사용되었다. 신선한 세포 배양 배지는 음의대조군(18,22)으로 작용하였다. 일단 상기 세포배양상체에 있는 Gal-1hFc가 확인되면(도3A),단백질 A 멤브레인 흡착제는 10ml/min에서 10ml/min(피상속도 또는 2ml 멤브레인 흡착물에서 0.5cm/min의 체피 성 속도 또는 체적 플럭스를 초래함)에 의해 달성되었다(그림1). 멤브레인 흡착제는 효과적으로 캡처하고 Gal-1hFc를 유지, 본질적으로 갈 -1hFc의 고갈을 통해 흐름을 떠나 (돌파구의 부족, 그림 3A). Gal-1hFc는 아민 계 산성 완충(pH 2.8)을 이용하여 1ml/min(체적 플럭스 = 0.05cm/min)에서 멤브레인 흡착제로부터 출루되었고, 이후 유량 시토메트리(그림3B)를사용하여 기능성 Gal-1hfc의 존재를 테스트하였다. Gal-1hFc 신호는 용출 1(음수 대조군과 거의 동일)에서 용출 3에서 최대로 순차적으로 증가한 다음, elutions 9 및 10(그림3B 및 3C)에서거의 일정한 수준으로 감소하였다. 최종 용출(10)은 Gal-1hFc(그림3B 및 3C)의일부 흡착 유지로 인해 음의 제어 신호와 동등하지 않았다. 그러나, 이 손실은 허용 된 것으로 간주 되었다. 다양한 솔루션에서 Gal-1hFc의 존재를 테스트하는 대안으로, 다양한 솔루션에서 Gal-1hFc의 유동 세포측정 분석은 단백질A 폴리스티렌 구슬(hFc 영역의 인식을 통해)에 결합하는 G-1hFc의 능력의 유동 세포측정 분석을 사용할 수있다(도 3D).
용출 분수 테스트 에 이어, Gal-1hFc 양성 elutions 2~10은 농축된 다음 DPBS에 투석하여 원하는 버퍼에서 정제된 Gal-1hFc를 얻었다. 정제된 Gal-1hFc의 정량화 및 특성화는 반건조 전달 및 진공 보조 면역 블로팅에 의해 신속한 서양 블로팅 절차에서 수행되었다. hFc 정량화 표준에 Gal-1hFc 신호를 비교하여 정제 된 재료의 수량과 품질이 모두 결정되었습니다(그림 4A-C). hFc 표준 대역의 신호 강도(도 4A,레인 1-5에서 각각 ~25kDa에서 각각 1대역) hFc의 수량(도4C)과선형적으로 관련이 있었다. Gal-1hFc(도 4A,레인 6에서 ~40kDa에서 1대역) 및 저하된 Gal-1hFc(도 4A에서 ~40kDa1대1대1대역, 도 4A,레인 7의 ~25kDa에서 1대역) 신호가 표준 범위 내에 있었다(그림4A,차선 1-5). hFc에 기초하여 정제된 Gal-1hFc(도4A,차선 6)의 농도는 이미지처리(도 4C)에의해 450 μg/ml로 결정되었다. Gal-1hFc의 분자량을 조절하여 정제된 물질의 농도는 720g/ml였습니다. 대조적으로, 너무 많은 정제 된 Gal-1hFc는 도 4B에서서부의 차선 6과 7에로드되어 hFc 표준 범위를 포화또는 초과하는 신호를 생성하여 정량화를 방지했습니다. 서양 블로팅에 대한 대안, 쿠마시 젤염색(21)은 신속한 품질 관리 검사 및/또는 정량화방법(도 4D)의역할을 할 수 있다. 밴드 ~10 kDa, 밴드 ~25 kDa 및 ~40 kDa 이외에, 저하된 Gal-1hFc샘플(도 4D,레인 2)에 존재하였다. 이 밴드는 서양 블롯(그림4A 및 4B)에사용되는 검출 항체로 불반응성이 없는 Gal-1hFc를 저하시다.
정제된 Gal-1hFc의 정량화 및 최종 특성화 후, 멸균 BSA가 첨가되어 최종 BSA 농도를 0.5%로 달성하였다. 정제된 물질은 다음 알리인용 및 -20 ºC에 저장되었다. Gal-1hFc 외에도 이중 돌연변이 Gal-1hFc와 Gal-7hFc를 격리하기 위해 이 간소화된 프로토콜을 사용했습니다. 그것은 또한 Fc 단편을 소유하는 실질적으로 모든 분자로 확장 될 수있다 (항체, Fc 단편 자체, 다른 Fc 융합 단백질, 기타. . .
그림 1. 실험 장치의 회로도. IgG의 Fc 단편을 발현하는 항체 및 재조합 융합 단백질은 단백질 A 멤브레인 흡착제를 사용하여 희석용으로부터 분리될 수 있다. 멤브레인 흡착제는 루어 잠금 장치를 통해 주사기 펌프의 30ml 주사기에 끼워 연결되며, 이는 원하는 체적 유량으로 멤브레인 흡착기를 통해 단백질 함유 용액을 퍼포게 합니다.
그림 2. 세포 배양 상수로부터 Gal-1hFc의 격리를 위한 공정 워크플로우. 이 순서도는 세포 배양 상류체로부터 키메황 뮤린 갈렉틴-1/인간 Fc 발현 융합 단백질(Gal-1hFc)의 격리 및 특성화를 위한 프로토콜을 도시한다. 일반적으로 처리 시간은 작업자 경험, 처리된 상량 및 정량화 및 특성화 방법에 따라 달라집니다.
그림 3. Gal-1hFc 함유 용액의 유동 세포측정 분석. 유동 세포측정은 기능성 Gal-1hFc가 신선한 세포 배양 배지, 세포 배양 상류제, 멤브레인 흡착체 흐름 및 용출 분획에 존재하는지 여부를 평가하는 데 사용됩니다. APC-컨쥬게이드 F(ab')2 항인간 Fc는 이차 항체로 사용되었다. 모든 데이터는 FACS 아리아 특수 주문 연구 제품 흐름 세포계/선별기를 사용하여 획득하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 각 히스토그램의 마커는 음의 대조군집단(즉, 신선한 세포 배양 배지)의 2%를나타내며(B)에대한 hFc 동소형이다. (A) 신선한 세포 배양 배지(red), 세포 배양 상수(blue), 또는 멤브레인 흡착체(green)로 표지된 BT-20 유방암 세포의 흐름 세포형 히스토그램 오버레이. 세포 배양 상체는 BT-20 세포에 게린틴-1 리간드에 성공적으로 바인딩 기능 Gal-1hFc의 낮은 수준을 포함, 신선한 세포 배양 배지 및 멤브레인 흡착 흐름을 통해 흐르는 동안, 예상대로. (B) 멤브레인 흡착물으로부터 용출 분수로 표지된 BT-20 세포의 투량 세포 분석. BT-20 셀에 대한 Gal-1hFc 신호는 백그라운드수준(즉, 신선한 세포 배양 배지에 상응하는 신호)이 아니더라도 용출 4에서 최대로 순차적으로 증가합니다. (C) (B)에서샘플의 평균 형광 강도는 또한 용출 분수 수의 함수로서 용출 곡선을 생성할 수 있다. hFc 동종형 대조군으로 표지된 세포의 평균 형광 강도는 기준선으로 도시된다. (D) 대안적으로, 단백질A 폴리스티렌 구슬에 결합된 Gal-1hFc의 유량 세포측정 분석은 다양한 솔루션에서 단백질 존재를 테스트하는 데 사용될 수 있지만 기능하지 는 않습니다. APC-컨쥬게이드 F(ab')2 항인간 Fc는 이차 항체로 사용되었다. 왼쪽: 신선한 세포 배양 배지(적색), 세포 배양 상수(blue), 빈 완충시(녹색)의 흐름 세포측정 히스토그램 오버레이. 중간: hFc 이소형 제어의 히스토그램. 10 mg/ml hFc를 가진 배큐베이션은 단백질 A 포획을 위한 긍정적인 대조군입니다. 오른쪽 패널: 10 mg hFc/ml를 기준으로 정제 된 Gal-1hFc로 배양 된 단백질 A 구슬의 히스토그램은 여기에 클릭하여 더 큰 이미지를 볼 수 있습니다.
그림 4. 서양 블로팅 및 이미지 분석을 사용하여 Gal-1hFc의 정량화 및 특성화. (A) 차선 1-5는 0.1 μg 단위로 0.1-0.5 μg의 hFc 표준이며, 차선 6과 7은 두 개의 다른 생산 로트에서 Gal-1hFc를 정제한다. 샘플은 감소 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 4-15% TGX 젤로 해결된 다음 불연속 전달 조건을 사용하여 PVDF 멤브레인으로 이송되었습니다. 멤브레인은 진공 보조 면역 blotting 기술을 사용하여 항 hIgG-AP로 차단및 배양되었습니다. 신호는 ECL 시약으로 개발되었으며 바이오 라드 케미독 XRS 이미저에 시각화되었습니다. 차선 1-5의 hFc 표준에 대한 신호는 선형측정 범위 내에 있었고(플롯된(C)), 2개의 정제된 Gal-1hFc 샘플에 대한 신호는 선형 측정 범위 내에 있었다. 레인 7은 단백질의 저하를 나타내는 두 개의 밴드, Gal-1hFc 및 아마도 hFc 조각을 보여줍니다. (B) 너무 많은 정제 된 Gal-1hFc가로드되는 경우, 신호는 정량화를 방지, 선형 신호 범위를 포화 또는 초과 할 수있다 (차선 6 및 7). 차선, 젤 및 실행 조건은(A)와동일합니다. (C) 이미지 랩 분석 소프트웨어는 면역 blot에서 hFc 표준의 알려진 절대 수량의 입력을 허용한 다음, 표준의 선형 회귀에 대한 신호를 통해 알 수 없는 대역의 양을 결정합니다(y= 1.36 x 10-7*x + 0.105; R2 = 0.95). 표시된 데이터는 (A)에서 면역블롯의 분석에서 나온 것이다. (D) 정제 된 Gal-1hFc의 품질은 쿠마시 염색을 사용하여 평가 될 수있다. 레인 M은 분자량 마커, 차선 1은 정제된 Gal-1hFc(레인 6in(A)와(B)와동일한 샘플이며, 레인 2는 Gal-1hFc(차선 7인치(A)와(B)와동일한 샘플) 및 레인 3이 0.2 mghFc 표준이다. 겔 및 실행 조건은(A)및(B)와동일하였다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 명세서에 기재된 프로토콜은 제품 회수 또는 팽창 비용을 크게 손상시키지 않으면서 인간 Fc(Gal-1hFc)를 발현하는 키메라 융합 단백질을 신속하게 분리하고 특성화하기 위해 개발되었다. 간소화된 워크플로우의 주요 구성 요소는 절연을 위한 단백질 A 멤브레인 흡착제, 서양 블로팅에 의한 특성화를 위한 반건조 전달 및 진공 보조 면역블로팅입니다.
세포 배양 상류체 300ml에서 Gal-1hFc의 격리 및 특성화를 위한 처리 시간이 급격히 감소(기존 프로토콜에서 20시간 이상에 비해 유선형 프로토콜에서 약 9시간)은 전술한 주요 성분, 특히 멤브레인 흡착제의 통합에 크게 기인한다. 최대 권장 유량10ml 의 수퍼나탄트/분에서 멤브레인 흡착제 적재는 30분 안에 완료할 수 있습니다. 단백질 A 멤브레인 흡착제에서 Gal-1hFc 회복은 일반적으로 실험실에서 10-30%까지 다양하며, 세포 배양 슈퍼나탄의 Gal-1hFc 농도가 5-10 mg/ml일 때 숙련된 실험실 인력에 의해 정기적으로 달성된 ~30%의 회복이 이루어지고 있습니다. 대부분 ~ 50 % 회복이 달성되었습니다. 완전한 제품 회수는 (a) 막 흡착제(그림3B 및 3C)에단백질 A에 의한 Fc 발현 단백질의 특정 보존및 (b) 절연 전반에 걸쳐 단백질의 비특이적 표면 흡착으로 인해 내재된 손실로 인해 사실상 불가능합니다. 개별 실험실에서 멤브레인 흡착기를 사용하여 제품 회수가 요구 사항에 따라 허용되는지 확인하는 것이 중요합니다. 로딩 유량 또는 공급원료함량(예를 들어, 특히 어려울 수 있는 원하는 단백질 세포 농도 배양 상류체)를 변경하면 제품회수를향상시킬 수 있거나, 또는 용출 프로토콜(Step 4)의 수정이 더 높은 회수를 얻을 수 있는 경우, 단백질 또는 멤브레인 흡기 자체에 대한 가능한 해가 될 만한 가치가 있다(주로 용출 완충액, 소금 농도 등에 의한). 멤브레인 흡착기를 사용하는 것과 는 달리, 1ml 단백질 A 비드 포장컬럼(18)을통해 2개의 관류 주기를 수행하는 데 약 10시간이 걸리며, 1ml/min의 최대 허용 유량으로, 10-20%의 Gal-1hFc만이 전형적으로 회복된다. 최종 관심사로서, 다른 제조 업체에서 단백질 A 구슬에 대한 비용 분석은 단일 멤브레인 흡착제 대 표준 비드 포장 컬럼을 사용하는 결정에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 모든 요소를 고려하여, Fc-expressing 단백질의 실험실 스케일 절연을 위한 멤브레인 흡착제의 사용은 컬럼 크로마토그래피2,5,8,10에비해 작은 실험실에게 상당한 이점을 제공할 수 있다.
SDS-PAGE용 미니 젤, 젤에서 PVDF 멤브레인으로 단백질의 반건조 불연속 전기전광 전달, 진공 보조 면역 블로팅은 미디 젤, 탱크(젖은) 전이, 확산 계 면역스테인팅에 비해 상당한 시간 절감 효과를 제공한다.[2시간 대 8]. 개별 실험실은 신속한 서양 프로토콜이 단백질의 정량화 및 특성화에 적합한지 여부를 결정해야 합니다. 이점은 (a) 미숙한 실험실 인력에 의해도 완료할 짧은 시간, (b) 단백질이 가공 또는오염(도 4B)으로인해 손상되지 않았는지 또는 저하되었는지 여부를 판단하는 능력( 도 4B) 및 (c) 이미지 처리 프로그램(그림4C)에의한 정량화의 상대적 용이성을 포함한다. 그러나, (a) 증가된 시약 및 소모품 비용은 임금에 대한 시간 상쇄에도 불구하고 받아들일 수 없으며, (b) A280, ELISA, 브래드포드 분석 또는 BCA 분석에 의한 전통적인 단백질 정량화는23-27,또는 (c) 실험실은 면역제팅을 위한 반단형 또는 진공 보조 단백질 검출 시스템에 접근할 수 없을 수 있다. 이러한 경우, SDS-PAGE 의 쿠마시 염색단백질(21)(도4D)또는 점 또는 슬롯 블로팅(28)은 좋은 대안이다.
유동 세포측정은 기존의 프로세싱18,22와동일한 이 능률적인프로토콜(그림 2)에서기능성 Gal-1hFc의 검출을 위한 3개의 별도 90분 테스트에서 사용되었다. 서양 블로팅 이나 ELISA와 같은 다른 특성화 방법도 허용 될 것 이다. 기능적 작용체는최적(예: 유방암 세포에 게렉틴-1 리간드의 검출, 수치 3A-C). 대안적으로, Fc 유닛의 검출은 허용될 것입니다 (도 3D와유사), 그러나 단백질의 특정 기능의 보존은 잠재적으로 중요한 단점인 이 방식으로 결정될 수 없습니다.
본 명세서에 기재된 방법은 인간 Fc(Gal-1hFc)를 발현하는 키메라 융합 단백질의 신속한 실험실 스케일 절연 및 특성화를 위해 사용되어 왔다. 이 간소화된 워크플로우는 Fc 단편(IgG 항체, 다른 Fc 융합 단백질, Fc 단편 등)을가진 거의 모든 분자의 격리에 적용될 수 있으며 개별 실험실 선호도에 따라 쉽게 변형될 수 있다. 또한, 이 프로토콜은 상대적으로 빠르고 쉽고, 제한된 경험이나 완전히 경험이 부족한 실험실 인력에게도 적합하며, 단백질 분리 및 특성화의 원리를 다루는 고등학교 또는 대학 생물학, 화학 및 (bio) 화학 공학 과정에 사용하기에 적합합니다.
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Disclosures
공개할 것은 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 루이스 F. 델가딜로(오하이오 대학교 화학 분자 공학부), 매튜 H. 윌리엄스(오하이오 대학교 화학 분자 공학부), 필리베르토 세데노 로랑 박사(브리검 여성 병원 및 하버드 의과 대학)에게 전문적인 기술 지원을 부탁드립니다. 저자는 또한 겨울 감사 를 원한다 2011 CHE 404/BME 504 그리고 가을 2012 CHE 4830/BME 5830 학생 (화학 및 생물 분자 공학 및 생물 의학 공학 프로그램 학과, 오하이오 대학) 기술 조언 및 토론에 대 한. 이 작품은 국립 과학 재단 (NSF) 주요 연구 계측 보조금 CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), 피부과 재단 연구 보조금 A050422 (SRB), 국립 보건원 (NIH) NCI 보조금 1R15CA1611에 의해 지원되었다 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA 박사 후 펠로우십 F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD), NIH NCCAM 보조금 R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
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