Summary
По сравнению с традиционной хроматографией сродства с использованием белка агароза бисероубитарные колонки, мембранные адсорберы белка A могут значительно ускорить лабораторно-масштабную изоляцию антител и других фрагмент-экспрессионных белков Fc. Надлежащие методы анализа и количественной оценки могут еще больше ускорить обработку белка, что позволит завершить изоляцию/характеристику за один рабочий день, а не за 20 часов работы.
Abstract
Лабораторный масштаб до промышленной очистки биомолекул от супернатантов клеточной культуры и лизированных клеточных растворов может быть выполнен с помощью хроматографии сродства. Хотя сродство хроматографии с использованием пористого белка Агароза бисер упакованы в колонки, возможно, наиболее распространенным методом лабораторного масштаба изоляции антител и рекомбинантных белков, выражают Fc фрагменты IgG, это может быть трудоемким и дорогостоящим процессом. Время и финансовые ограничения особенно огромны в небольших базовых научных лабораториях, которые должны восстановить сотни микрограммов до миллиграммовых количеств белка из разбавленных растворов, но не имеют доступа к системам доставки жидкостей высокого давления и/или персоналу, опыту в биоразделение. Кроме того, количественная оценка и характеристика продукции могут также чрезмерно удлинять время обработки в течение нескольких рабочих дней и завышать расходы (расходные расходы, заработная плата и т.д.). Таким образом, быстрый, недорогой, но эффективный протокол необходим для лабораторной изоляции масштаба и характеристики антител и других белков, обладающих фрагментом Fc. С этой целью мы разработали протокол, который может быть завершен ограниченным опытом технического персонала менее чем за 9 часов (примерно один рабочий день) и так же быстро, как 4 часа, в отличие от традиционных методов, которые требуют 20 часов работы. Большинство необходимого оборудования легкодоступно в стандартных биомедицинских науках, биохимии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Чтобы продемонстрировать этот протокол, репрезентативные результаты представлены, в которых химерин галектин-1 сливается с человеком Fc (Gal-1hFc) из клеточной культуры супернатант был изолирован с помощью белка мембраны AdSorber. Очищенный Gal-1hFc был количественно оценен с помощью ускоренной процедуры анализа западного blotting и характеризовался использованием цитометрии потока. Оптимизированный рабочий процесс может быть изменен для других белков, выражаюющих Fc, таких как антитела, и/или изменен для включения альтернативных методов количественной оценки и характеристики.
Introduction
Изоляция антител и рекомбинантных белков, выражаюющих иммуноглобулин G (IgG) Fc фрагменты из клеточной культуры supernatants и разбавления облизатических клеточных растворов может быть достигнуто с помощью белка сродство хроматографии. В фундаментальных научно-технических лабораториях и промышленности, колонны упакованы с пористым белком Агароза, стекло, или полимерные бусы чаще всего используются для сродства хроматографии, несмотря на высокие финансовые затраты и длительноевремя обработки 1-3. Это хорошо оценили, что сродство хроматографии представляет собой крупнейший счет и обработка узкое место в лабораторных ипромышленных условиях 2,4. В результате, многочисленные улучшения были разработаны для снижения затрат и времени обработки без ущерба для общего восстановления продуктаот процесса поезд 1,2,5-7. Особенно перспективным для изоляции антител и других белков, выражаюющих Fc, является сродство хроматографии с использованием белка мембраны А adorber2,5,7-10. В то время как fc захвата в колонке хроматографии диффузии ограничено(т.е. Fc-экспрессии белка должны диффузии в и через внутренние поры, чтобы достичь большинства белка А) с высоким давлением падение по всей колонке, массовый транспорт в мембранных адсорберов приводит к массовой конвекции, в результатечего избежать диффузии ограничения 8,9,11,12. Кроме того, падение давления через мембрану adorber является низким, что позволяет быстрее перфузии скорости потока по сравнению с бисером упакованыколонны 8,9,11,12. Таким образом, для изоляции лабораторных масштабах, мембранная хроматография, по прогнозам, сократит время изоляции на несколько часов и увеличит улавливание продукта по сравнению с колонкой хроматографии. Кроме того, математические модели для IgG adorption в мембранных адсорбенахбыли предложены 8,9,11,12, что позволяет конечных пользователей прогнозировать производительность в лаборатории.
Еще одним узким местом в фундаментальных научно-технических лабораториях является характеристика белка Fc-expressing. Тем не менее, выбор соответствующих методов для завершения анализа характеристик, таких западных помарки, может значительно сократить время, затученные на тестирование продукта. Например, полудровый переход в прерывистой буферной системе может выполнить электрофоретический перенос белков из геля SDS-PAGE в мембрану поливинила дифторидина (PVDF) в считанные минуты, в отличие от 1-2 часов в баке (мокрый) передачи в непрерывной буфернойсистеме 13.
Быстрый, недорогой и эффективный протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать химерный синтез белка, выражаюго Fc фрагмент человека IgG описывается здесь. Большинство оборудования легкодоступно в стандартных базовых биомедицинских науках, биологии, химии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Хотя репрезентативные результаты были получены в результате изоляции и характеристики murine galectin-1/human Fc химерного белка синтеза (Gal-1hFc), обтекаемый протокол может быть применен к изоляции других молекул, обладающих фрагментом Fc, таких как антитела, сами фрагменты Fc или другие белки синтеза Fc. Наши улучшения значительно сократили время обработки (всего за 4 часа, но, как правило, на 9 часов, по сравнению с 20 часами работы) при одновременном достижении аналогичного или улучшенного восстановления продукта по сравнению со стандартными методами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проверить сродство к белку А
- Убедитесь, что белок Fc-экспрессии (рекомбинантный синтез белка или IgG антитела, до сих пор называют "белок") имеет приемлемоесродство к белку 14-17 до использования белка мембраны AdSorber, и тест на наличие белка в фондовом растворе(например, клеточной культуры супернатант, уточненный центрифугации на 1000 х г гранул для гранул). Использование цитометрии потока, западной blotting, ELISA и т.д.. для обнаружения белковой функции и/или присутствия Fc, на основе лабораторных предпочтений. В идеале, количественно белка в клеточной культуре супернатант (шаг 6), чтобы избежать превышения белка мембраны adorber потенциала. Продолжайте, если обнаружен белок.
2. Подготовка белка Membrane Adsorber и клеточной культуры Supernatant
- Следуйте инструкциям производителя по подготовке мембранного асорбера. Никогда не позволяйте воздуху проникать в мембранный асорбер. Все растворы, пронизанные мембранным асорбером, должны быть при комнатной температуре и предварительно профильтрованы с помощью фильтра 0,22 мкм. Заполните 10 мл шприца с 0,22 мкм фильтрованных фосфатов Dulbecco буфера солевого раствора (DPBS) или буфер выбора и разряда пузырьков воздуха. Perfuse DPBS, чтобы удалить решение для хранения и уравночные мембраны adorber непосредственно перед использованием.
- Фильтровать супернатант клеточной культуры непосредственно перед перфузией через мембранный асорбер, используя вакуумный блок стерильной фильтрации на 0,22 мкм.
3. Загрузите белок мембранный асорбер
- Аспират клеточной культуры супернатант в шприц Luer Lock (30 мл или больше), и разрядить любые пузырьки воздуха.
- Сборка материалов и оборудования, как показано на рисунке 1. Подключите шприц к входу мембранного асорбера. Прикрепите гибкую трубу к мембранной розетке adorber. При желании поместите фильтр шприца 0,22 мкм между шприцем и мембранным асорбером. Используйте колбу или бутылку, чтобы поймать поток через (также известный как фильтрат), от adsorber.
- Установите шприц-насос до нужной скорости потока, но не превышает рекомендуемую производителем скорость потока(например, 10 мл/мин). Perfuse клеточной культуры супернатант через мембрану adorber, собирая поток через в стакане или другом контейнере. Перезагрузить шприц с необходимыми супернатантами.
- При желании проверьте поток на наличие белка с использованием цитометрии потока, западного blotting, ELISA и т.д.. на основе лабораторных предпочтений. Как правило, нет необходимости повторно использовать поток до конца.
4. Белок Элюта из Мембраны Адсорбер
- Вымойте мембранный асорбер 10 мл DPBS, чтобы удалить любой несырь белка.
- Белок элюта из мембранного асорбера при желаемой скорости потока (например, 1 мл/мин) с использованием 10-15 мл буфера элюции (например, буфер на основе амина (рН 2,8)). Поймать элуат в трубке, содержащей нейтрализующий буфер (например, 1 М Трис (рН 9,4)) при 10% объема элюции (1,0-1,5 мл).
- Кроме того, элютовый белок в одном мл шагом в трубки, содержащие 100 мкл буфера нейтрализации, используя общий объем 10-15 мл элюционного буфера. Используйте предпочтительный метод характеристики, чтобы проверить каждую фракцию на наличие белка.
- Регенерировать мембранный асорбер в соответствии с инструкциями производителя. Перелить 10 мл 0,22 мкм фильтрованных DPBS или буфер выбора, то 10 мл 0,22 мкм фильтруется 50 мм NaOH в 1 N NaCl, и, наконец, 10 мл 0,22 мкм фильтруется DPBS. Заполните мембранный асорбер 20% этанола в DPBS для длительного хранения при 4 oC.
5. Концентрат и диализ белка
- Депозит все элуат (или элюционные фракции, содержащие белок, определяемый в шаге 4.3) в 10 kDa молекулярного веса отрезанных центробежных фильтров единицы. Следуйте инструкциям производителя по центрифугации.
- Диализировать ретентат в небольшом блоке диализа объема (10 kDa молекулярного веса отрезания) против буфера выбора, следуя инструкциям производителя. Буфер, возможно, потребуется добавить в обезличеный материал, если белковые осадки вызывают озабоченность. При желании диализный материал можно хранить в холодильнике до 6-го шага, но длительное хранение без консервантов не рекомендуется.
6. Количественная оценка и характеристика очищенного продукта в ускоренной западной процедуре Blotting
- Разрешить очищенный белок и Fc стандартов на гель выбора SDS-PAGE, в условиях сокращения или необразования пожеланию 18-20. Используйте мини-гель, а не миди гель, чтобы свести к минимуму время работать.
- Если еще не известно, определите диапазон стандартов Fc, по которому сигнал диапазона изменяется линейно по отношению к количеству загруженных(например, 0,1-1 мг). Используйте тот же гель, условия работы, условия передачи и реагенты, которые будут использоваться для количественной оценки и характеристики очищенного белка.
- Загрузите несколько образцов очищенного белка, включая образцы, разбавленные DPBS, чтобы убедиться, что сигналы очищенной белковой полосы находятся в линейном диапазоне сигналов стандартов Fc при анализе изображений.
- Передача белков из геля в мембрану поливинилидена фтора (PVDF) в прерывистой буферной системе с использованием полудрого пятна13, следуя инструкциям производителя блоттера. Время передачи обычно 5-10 мин. При желании, Coomassie пятно гель после передачи для проверки эффективности передачи21.
- Выполните иммуноблотинг с анти-Fc или анти-IgG конъюгированных щелочной фосфатазы (AP) или хрена пероксидаза (HRP), на основе лабораторных предпочтений, используя вакуумную систему обнаружения белка. Иммуноблоттинг время, как правило, менее 1 часа.
- Разработка иммуноблот с использованием субстрата и метода выбора(например, субстрат AP и повышенная химилюминесценция).
- Количественная оценка очищенного белка с помощью анализа изображений. Выполните линейную регрессию на сигналах полосы от стандартов Fc. Если R2>0,90, используйте уравнение для линии для расчета количества белка из сигнала полосы (ы). При необходимости учитывать разбавление образца. Так как количественная оценка белка выполняется на основе Fc, корректировать значение молекулярных различий в весе между белком и Fc. Если R2<0.90, повторите шаг 6 в полном объеме.
- Проверка белка с использованием функциональных анализов или методов для обнаружения Fc через поток цитометрии, западной blotting, ELISA и т.д.. на основе лабораторных предпочтений.
- Разбавить белок до нужной концентрации и/или добавить любые желаемые консерванты или стабилизаторы в очищенный белковый раствор перед алицитированием для длительного хранения, замороженных или иных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оптимизированный протокол для изоляции и характеристики Fc-экспрессирующих белков обычно используется для обработки химерин-галектин-1, слитый с человеческим Fc (Gal-1hFc) из разбавленных супернатантов клеточной культуры. Диаграмма потока на рисунке 2 иллюстрирует рабочий процесс и время для каждого шага в протоколе. Для типичной партии 300 мл супернатанта, общее время обработки составляет около 9 часов, когда проводится дополнительное цитометрия потока фракций elution. Если весь анализ цитометрии потока опущен, из-за отсутствия цитометра потока или индивидуальных лабораторных предпочтений, общее время обработки может быть как кратким, так и 4 часа. Как правило, время обработки зависит от опыта оператора, количества обработки супернатанта и методов количественной оценки и характеристики.
Цитометрия потока была использована для проверки на наличие функционального Gal-1hFc(т.е. Gal-1, способного обнаруживать свои лиганды на раковых клетках молочной железы) в стартовом клеточном супернатанте; свежая среда культуры клетки служила какотрицательный контроль 18.22 . После того, как Gal-1hFc в клеточной культуре супернатант был проверен (Рисунок 3A), загрузка белка мембраны AdSorber была выполнена супернатантной перфузии на 10 мл/мин (в результате поверхностной скорости или объемного потока 0,5 см/мин в 2 мл мембраны adorber) с помощью шприц насоса (Рисунок 1). Мембранный асорбер эффективно захватил и сохранил Gal-1hFc, оставив поток через существенно истощены Гал-1hFc (отсутствие прорыва, рисунок 3A). Gal-1hFc был eluted от мембраны adorber в одном миллилитр шагом на 1 мл/мин (объемный поток 0,05 см/мин) с использованием амина основе кислого буфера (рН 2,8), и нейтрализованные фракции элюции впоследствии были протестированы на наличие функциональных Gal-1hFc с использованием цитометрии потока (рисунок 3B). Сигнал Gal-1hFc последовательно увеличивался с elution 1 (приблизительно равного отрицательному контролю) до максимума при элюции 3, затем снижался до почти постоянного уровня при элюциях 9 и 10(цифры 3B и 3C). Окончательный elution 10 не достиг эквивалентности отрицательному сигналу контроля из-за некоторого удержания AdSorber Gal-1hFc(рисунки 3B и 3C). Однако эта потеря была сочтена приемлемой. В качестве альтернативного метода для проверки на наличие, но не функции, Gal-1hFc в различных решениях, поток цитометрии анализа способности Gal-1hFc связываться с белком полистирол бисер (через признание области hFc) могут быть использованы(рисунок 3D).
После тестирования фракции elution, Gal-1hFc-положительные elutions 2 до 10 были сконцентрированы, а затем dialyzed против DPBS для получения очищенных Gal-1hFc в нужном буфере. Количественная оценка и характеристика очищенного Gal-1hFc была выполнена в западной процедуре blotting ускоренной semidry переходом и вакуум-помощью immunoblotting. Сравнивая сигнал Gal-1hFc со стандартами количественной оценки hFc, определялись как количество, так и качество очищенного материала(рисунки 4A-C). Интенсивности сигнала стандартных полос hFc (одна полоса по 25 кДа каждая на рисунке 4A, полосы 1-5) были линейно связаны с количеством hFc настоящее время (Рисунок 4C). Gal-1hFc (одна полоса на 40 кДа на рисунке 4A, переулок 6) и деградировали Gal-1hFc (одна полоса на 40 кДа и одна полоса на й 25 kDa на рисунке 4A, переулок 7) сигналы были в пределах диапазона стандартов(рисунок 4A, полосы 1-5). Концентрация очищенного Gal-1hFc(рисунок 4A, переулок 6) на основе hFc была определена как 450 мкг/мл при обработке изображений(рисунок 4C). С поправкой на молекулярный вес Gal-1hFc концентрация очищенного материала составила 720 г/мл. В отличие от этого, слишком много очищенных Gal-1hFc был загружен в полосах 6 и 7 Западного на рисунке 4B, который генерирует сигналы, которые насыщают или превысили диапазон стандартов hFc, тем самым предотвращая количественную оценку. Альтернатива западной blotting, Кумасси гель окрашивания21 может служить в качестве быстрого контроля качества проверки и / или метод количественной оценки (Рисунок 4D). Обратите внимание, что полоса No 10 kDa, в дополнение к полосам 25 кДа и 40 кДа, присутствовала в деградированном образце Gal-1hFc(рисунок 4D, переулок 2). Эта полоса деградировала Gal-1hFc, который был нереактивным с антителами обнаружения, используемыми в западных помарках(рисунки 4A и 4B).
После количественной оценки и окончательной характеристики очищенного Gal-1hFc, стерильный BSA был добавлен для достижения окончательной концентрации BSA 0,5%. Очищенный материал затем aliquoted и хранится при -20 oC. В дополнение к Gal-1hFc, мы использовали этот обтекаемый протокол, чтобы изолировать двойного мутанта Gal-1hFc и Gal-7hFc. Она также может быть распространена практически на любую молекулу, которая обладает фрагментом Fc (антитела, fc фрагменты себя, другие белки fc слияния ит.д. видов и изотипов, которые имеют сродство к белку14-17).
Рисунок 1. Схема экспериментального аппарата. Антитела и рекомбинантные белки синтеза, выражаюющие фрагменты Fc IgG, могут быть выделены из разбавленных растворов с помощью мембранного адорбера белка А. Мембранный асорбер соединен через замок Luer, приготовив к шприцу 30 мл на шприц-насосе, который перфусирует белково-содержащий раствор через мембранный асорбер с желаемой скоростью объема потока.
Рисунок 2. Процесс рабочего процесса для изоляции Gal-1hFc от супернатанта клеточной культуры. Этот flowchart иллюстрирует протокол для изоляции и характеристики химерин-галектин-1/человек Fc-выражая протеин сплавливания (Gal-1hFc) от супернатанта культуры клетки. Как правило, время обработки будет варьироваться в зависимости от опыта оператора, количества обработки супернатанта и методов количественной оценки и характеристики.
Рисунок 3. Цитометрия потока анализа Гал-1хФК-содержащих решений. Цитометрия потока используется для оценки того, присутствует ли функциональный Gal-1hFc в среде культуры свежих клеток, супернатанте клеточной культуры, мембранном потоке адорбера и фракциях elution. APC-спряженный F(ab')2 анти-человек Fc был использован в качестве вторичного антитела. Все данные были получены с помощью цитометра/сортера потока специальных заказов FACS Aria и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo. Маркеры в каждой гистограмме составляют 2% отрицательной контрольной популяции(т.е. среды свежей клеточной культуры для (A)и hFc изотипа для(B)). (A) Поток цитометрии гистограммы наложения BT-20 раковых клеток молочной железы помечены свежей клеточной культуры среды (красный), клеточной культуры супернатант (синий), или мембраны adorber поток через (зеленый). Супернатант клеточной культуры содержал низкий уровень функционального Gal-1hFc, который успешно связан с галектин-1 лигандами на клетках BT-20, в то время как свежие клеточные культуры среднего и мембранного потока асорбера через не хватало Gal-1hFc, как и ожидалось. (B) Поток цитометрии гистограммы клеток BT-20 помечены элюционных фракций из мембраны adorber. Сигнал Gal-1hFc на ячейках BT-20 последовательно увеличивается до максимума при элюции 4, затем уменьшается, хотя и не до фонового уровня(т.е. сигнала, эквивалентного свежей среде культуры клеток). (C) Средняя сотысясть флуоресценции образцов в (B) также может быть построена как функция числа фракции elution для создания кривой элюции. Средняя интенсивность флуоресценции клеток, помеченных контролем изотипа hFc, показана в качестве эталонной линии. (D) Кроме того, цитометрия потока анализ Gal-1hFc связаны с белком полистирол шарики могут быть использованы для проверки на наличие белка, но не функции, в различных решениях. APC-спряженный F(ab')2 анти-человек Fc был использован в качестве вторичного антитела. Слева: Гистограмма потока цитометрии наложения среды свежей клеточной культуры (красный), супернатантов клеточной культуры (синий) и пустой образец буфера (зеленый). Середина: Гистограмма управления изотипом hFc. Инкубация с 10 мг/мл hFc является положительным контролем для захвата белка А. Правая панель: Гистограмма белка А бисера, инкубированная очищенным Gal-1hFc, на основе 10 мг hFc/ml. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 4. Количественная оценка и характеристика Gal-1hFc с использованием западного blotting и анализа изображений. (A) Полосы 1-5 являются стандартами hFc 0,1-0,5 мкг с шагом 0,1 мкг, а полосы 6 и 7 очищаются Gal-1hFc от двух различных производственных лотов. Образцы были решены на 4-15% TGX гель SDS-PAGE в условиях сокращения, а затем переданы в мембрану PVDF с использованием прерывистых условий передачи. Мембрана была заблокирована и инкубирована анти-hIgG-AP с помощью вакуумной техники иммуноблоттинга. Сигналы были разработаны с помощью реагента ECL и визуализированы на изображении Bio-Rad ChemiDoc XRS. Сигналы для стандартов hFc в полосах 1-5 менялись линейно (в пределах(C)),а сигналы для двух очищенных образцов Gal-1hFc в полосах 6 и 7 находились в пределах линейного диапазона измерений. Лейн 7 показывает две полосы, Gal-1hFc и, предположительно, фрагмент hFc, что указывает на деградацию белка. (B) При загрузке слишком большого количестве очищенных Gal-1hFc сигнал может насытить или превышать линейный диапазон сигнала, предотвращая количественную оценку (полосы 6 и 7). Переулки, гель и условия работы такие же, как и в (A). (C) программное обеспечение для анализа изображений Lab позволяет вводить известные абсолютные количества стандартов hFc от иммуноблота, а затем определяет количество неизвестной полосы (ы) через ее сигнал относительно линейной регрессии стандартов (y 1.36 x 10-7х 0.105; R2 и 0,95). Данные показаны из анализа иммуноблота в (A). (D) Качество очищенных Gal-1hFc можно оценить с помощью окрашивания Кумасси. Переулок M является молекулярным маркером веса, полоса 1 очищается Gal-1hFc (тот же образец, как полоса 6 в (A) и(B)), полоса 2 деградирует Gal-1hFc (тот же образец, как полоса 7 в (A) и (B)), и переулок 3 составляет 0,2 мг hFc стандарта. Гель и условия работы были такими же, как в( A) и (B). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный в этом, был разработан для быстрой изоляции и характеристики химерного синтеза белка, выражаюго человека Fc (Gal-1hFc), без существенного ущерба для восстановления продукта или завышения стоимости. Ключевыми компонентами обтекаемого рабочего процесса являются белок мембранный асорбер для изоляции, а также полудрый перенос и вакуумный иммуноблотирование для характеристики западными блоттингами.
Резкое сокращение времени обработки для изоляции и характеристики Gal-1hFc с 300 мл супернатанта клеточной культуры (примерно 9 часов в обтекаемом протоколе по сравнению с 20 часами в традиционном протоколе) в значительной степени связано с включением вышеупомянутых ключевых компонентов, в частности мембранного асорбера. При максимальной рекомендуемой скорости потока 10 мл супернатанта/мин мембранная загрузка асорбера может быть завершена за 30 минут. Gal-1hFc восстановления от белка мембраны адсорсеры обычно варьируются от 10-30% в наших лабораториях, с 30% восстановления обычно достигается опытным персоналом лаборатории, когдаGal-1hFc концентрации в клеточной культуре супернатант 5-10 мг/мл. В крайнем случае, восстановление на 50% было достигнуто. Полное восстановление продукта практически невозможно из-за врожденных потерь из-за (а) специфического удержания белка Fc-экспрессирования белком А на мембранном асорбере(рисунки 3B и 3C)и b) неспецифической поверхности асторпции белка на протяжении всей изоляции. Важно, чтобы отдельные лаборатории определить, если восстановление продукта с мембраной adorber является приемлемым на основе их потребностей; при изменении скорости загрузки потока илисодержания сырья (например, желаемой концентрации белковых клеток культуры супернатанта, что может быть особенно трудно)может улучшить восстановление продукта 8, или если изменение протокола элюции (шаг 4) для получения более высокого восстановления стоит увеличенное время, расходы и усилия, или возможный вред для белка или мембраны адсорбер себя (прежде всего elution буфер рН, концентрация соли и т.д.). В отличие от использования мембраны adorber, это занимает около 10 часов для выполнения двух циклов перфузии через 1 мл белка бисером упакованыколонки 18при максимальной допустимой скорости потока 1 мл/ мин, и только 10-20% Gal-1hFc, как правило, восстановлены. В качестве конечной проблемы, анализ затрат на белок бисера от различных производителей может повлиять на решение использовать стандартный бисер упакованы колонки по сравнению с одной мембраны adorber. Принимая во внимание все эти факторы, использование мембранного асорбера для лабораторной изоляции белков, выражаюющих Fc, может предложить небольшим лабораториям значительные преимущества передколонкой хроматографии 2,5,8,10.
Использование мини-геля для SDS-PAGE, полудройной разрыв электрофоретической передачи белков из геля в мембрану PVDF, а также вакуумная иммуноблоттинг обеспечивают значительную экономию времени по сравнению с миди гелями, передачей бака (мокрым) и иммуностелением на основе диффузии для количественной оценки и характеристики Gal-1hFc (2 часа против 8 часов). Отдельные лаборатории должны определить, подходит ли ускоренный западный протокол для количественной оценки и характеристики их белка. Преимущества включают в себя а) короткое время до завершения даже неопытных сотрудников лаборатории, b) способность определить, является ли белок нетронутым или деградировал из-за обработки или загрязнения (Рисунок 4B), и (с) относительная легкость количественной оценки программами обработки изображений (Рисунок 4C). Тем не менее, а) увеличение реагентов и расходных материалов расходные расходы могут быть неприемлемыми, несмотря на время компенсации заработной платы, (б) традиционные протеиновые количественные A280, ELISA, Брэдфорд анализ, или BCA анализможет быть предпочтительным 23-27, или (с) лаборатории не могут иметь доступ к полудройной blotter или вакуумной системы обнаружения белка для иммуноблотения. В таких случаях, Coomassie окрашивание SDS-PAGEрешены белки 21(Рисунок 4D) или точка или слот blotting28 являются хорошими альтернативами.
Цитометрия потока была использована в трех отдельных 90-минутных тестах для обнаружения функционального Gal-1hFc в этом обтекаемомпротоколе (рисунок 2),который такой же, как и втрадиционной обработке 18,22. Любой другой метод характеристики, такой как западный blotting или ELISA также будет приемлемым. Функциональные анализы являются оптимальными(например, обнаружение лигандов галектина-1 на раковых клетках молочной железы, цифры 3A-C). Кроме того, обнаружение блока Fc было бы приемлемым (по аналогии с рисунком 3D),но сохранение конкретной функции белка не может быть определено таким образом, что является потенциально значительным недостатком.
Методы, описанные в настоящем, были использованы для быстрой изоляции лабораторных масштабах и характеристики химерики фьюжн белка, выражаюго человека Fc (Gal-1hFc). Этот обтекаемый рабочий процесс может быть применен к изоляции практически любой молекулы, которая обладает фрагментом Fc (антитела IgG, другие белки fc fusion, fc фрагменты сами и т.д.)и может быть легко изменена на основе индивидуальных предпочтений лаборатории. Кроме того, этот протокол является относительно быстрым и легким, даже для ограниченного опыта или совершенно неопытного персонала лаборатории, что делает его пригодным для использования в средней школе или колледже биологии, химии и (био)химической инженерии курсы, которые охватывают принципы белковой изоляции и характеристики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Раскрывать нечего.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить г-на Луиса Ф. Дельгадильо (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо), г-на Мэтью Х. Уильямса (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо) и д-ра Филиберто Седено-Лорана (Brigham and Women's Hospital и Harvard Medical School) за экспертную техническую помощь. Авторы также хотели бы поблагодарить Зимой 2011 CHE 404/BME 504 и осень 2012 CHE 4830/BME 5830 студентов (Департамент химической и биомолекулярной инженерии и биомедицинской инженерной программы, Университет Огайо) за технические консультации и обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Основные исследования инструментов грант CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Дерматология Фонд исследований Грант A050422 (SRB), Национальные институты здравоохранения (NIH) NCI грант 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Постдокторская стипендий F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD), и NIH NCCAM грант R01AT004628 (CJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Use 15 ml volume if needed |
| Sterile vacuum filter unit, 0.22 µm, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 301604 | |
| 30 ml Syringes with Luer Lock tips | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. antibody collection tray | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. single well blot holder | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pure | Fisher Scientific | 819623 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Alkaline phosphatase substrate | Promega | S3841 | |
| Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene) | BD | 352054 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | A peristaltic pump is also acceptable |
| Protein gel electrophoresis system | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest |
| Semidry blotter | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest |
| SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system | EMD Millipore | WBAVDBASE | An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well |
References
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
- Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
- Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
- Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
- Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
- Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
- Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
- van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
- Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
- Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
- Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
- Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).
