This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Urine exosomen zijn kleine interne blaasjes van 100 nm van multivesiculaire lichaampjes (MVB), afkomstig van alle soorten cellen onder normale en pathologische omstandigheden in de urine ruimte, met inbegrip van de glomerulaire podocytes, niertubuli-cellen en epitheelcellen van de urine drainagesystemen die lijken te worden verrijkt voor miRNAs 1 -2. Veel onderzoekers hebben verschillende eiwitten aangetroffen in exosomen geïsoleerd uit urine van gezonde individuen evenals die met nier- en / of systematische ziekten 3-5. Exosomes kan worden geïsoleerd met behulp van verschillende methoden zoals tweestaps differentiële ultracentrifugatie met of zonder sucrose 6-7 combineert nanomembrane filter met ultracentrifugatie 09/08, 11/10 of precipitatie. Recent hebben wij een eenvoudige, snelle, schaalbare en effectieve methode om urine exosomen te isoleren en op te sporen miRNA en eiwit biomarkers 11. Hoewel biomarkers kan worden gedetecteerd in verschillende biologische vloeistoffen, urine is de meest geschikte keuze voor patiënten met nier- en urinewegen omdat het kan worden verkregen in grote hoeveelheden in een relatief niet-invasieve wijze.
Hoewel er verschillende manieren om urine exosomes isoleren 6-11, de meest gebruikte procedure is gebaseerd op differentiële ultracentrifugatie met een 30% sucrose kussen. Hoewel deze methode is efficiënt en de kwaliteit van de resulterende exosomes geïsoleerd met deze werkwijze is hoog, de techniek zelf vereist geschoold personeel en is tijdrovend en vereist verscheidene stappen ultracentrifugatie. Andere werkwijzen, zoals filtratie en precipitatie, zijn ontwikkeld voor de isolatie van exosomes, waaronder een die een eigen precipitatiereagens gebruikt (dwz ExoQuick-TC: System Biosciences, Mountain View, CA). Hoewel precipitatie met dit reagens snel en relatief eenvoudig, de zuiverheid van de geïsoleerde exosomes is laag in vergelijking met de ultracentrifugatie method. We hebben onlangs vergeleken zes voor de isolering van urine exosomes, waaronder een modificatie van de precipitatie methode met ExoQuick-TC dat we in ons laboratorium ontwikkeld 11. We vonden dat deze gewijzigde neerslag methode leverde hogere hoeveelheden eiwit, miRNA, en mRNA's en de procedure zelf sneller en eenvoudiger te implementeren dan ultracentrifugering was. Hier beschrijven we de experimentele protocol van onze gewijzigde neerslag methode stapsgewijs, en onder meer een bespreking van de voor- en nadelen van deze techniek in vergelijking met andere methoden van exosome isolement. De gemodificeerde precipitatie werkwijze omvat een initiële precipitatie van exosome deeltjes, gevolgd door verwijdering van Tamm-Horsfall eiwit, dat wordt gecorreleerd met exosomaal eiwitten en bekende exosome opbrengst van urine te verminderen. We vonden dat deze wijzigingen verhoogde de opbrengst en zuiverheid van de exosomaal preparaat uit urine.
De meeste methoden waarbij het neerslaan van exosomen uit urine niet te pakken verwijdering van de polymere netwerk gevormd door Tamm-Horsfall eiwit (THP). Dit eiwit is aanwezig in grote hoeveelheden in urine, waar het vermoedelijk vallen exosomes tijdens de eerste lage snelheid centrifugatie. In het gewijzigde methode gereduceerd we THP middels DTT vóór exosome precipitatie. Zoals getoond in figuur 2, werd een grotere hoeveelheid THP waargenomen in ongewijzigde urine en pellet, zonder THP in het uite…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
Centrifuge | Sorvall | ||
DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |