Summary
I denne video demonstrerer vi en protokol for dissektion af musens tværgående abdominismuskel og bruger immunfluorescens og mikroskopi til at visualisere neuromuskulære kryds.
Abstract
Analyse af neuromuskulære junction morfologi kan give vigtig indsigt i den fysiologiske status af en given motor neuron. Analyse af tynde flade muskler kan give betydelige fordele i forhold til traditionelt anvendte tykkere muskler, såsom dem fra bagbenet(f.eks. gastrocnemius). Tynde muskler giver mulighed for omfattende overblik over hele innervation mønster for en given muskel, hvilket igen tillader identifikation af selektivt sårbare puljer af motoriske neuroner. Disse muskler tillader også analyse af parametre som motorisk enhedsstørrelse, axonal forgrening og terminal / nodal spiring. En almindelig hindring i at bruge sådanne muskler er at få den tekniske ekspertise til at dissekere dem. I denne video beskriver vi protokollen til dissekering af tværgående abdominis (TVA) muskel fra unge mus og udfører immunfluorescens for at visualisere axoner og neuromuskulære kryds (NMJs). Vi demonstrerer, at denne teknik giver et komplet overblik over TVA-musklens innerveringsmønster og kan bruges til at undersøge NMJ-patologi i en musemodel af barndommens motoriske neuronsygdom, spinal muskelatrofi.
Introduction
Neuromuskulære vejkryds (NMJs) er den synaptiske forbindelse mellem en lavere motor neuron og en skeletmuskel fiber. De betragtes traditionelt som en trepartssynapse, der består af en neuron (præsynaptisk terminal), muskelfiber (postsynaptisk terminal) og terminal Schwann celle1. NMJs synes at være tidlige og betydelige mål i patologi i en række motoriske neuron sygdomme og mus modeller2,3. Typiske symptomer omfatter denervation, hvor motorens endplate bliver blottet for en præsynaptisk innervation, hævelse af den præsynaptiske terminal og en reduktion i kompleksiteten af NMJ morfologi4-11. Der kan også noteres kompenserende reaktioner, som omfatter terminal- og knudepunktspiring, hvor axonale processer strækker sig fra resterende synaptiske terminaler eller internoder til rekonserverede denerverede endeplader12,13. På grund af den tætte sammenhæng mellem synaptisk aktivitet og NMJ morfologi kan der opnås en masse information om motorneuronernes funktionelle status fra analyse af NMJ morfologi. Da tab af NMJs ofte repræsenterer et af de første aspekter af neuromuskulær patologi4,10, kan kvantificering på innervationsniveau give vigtige oplysninger om patologiens progression og den potentielle effekt af en terapeutisk intervention. Da NMJ-tab desuden udgør et betydeligt skridt i patologisk progression, kan udviklingen af terapeutiske, der kan stabilisere forbindelser og tilskynde til regenerering, give betydelige fordele.
Når man analyserer NMJ morfologi, er muskelvalg af stor betydning. Nogle af de primære overvejelser kan omfatte muskel fiber type, kropsstilling, og sammenlignende analyse til menneskelige forhold. Hertil kommer, at hvor manipulationer såsom injektion af stoffer eller traumatisk nerveskade er påkrævet, eksperimentel tilgængelighed er også vigtigt at overveje. Generelt er det at foretrække at analysere en række muskler placeret i hele kroppen afspejler en række motoriske enhed subtyper. Ofte er muskelvalg imidlertid påvirket af let dissektion. Derfor udføres NMJ-analyse ofte udelukkende på store blindtarmsmuskler som gastrocnemius. For at opnå god NMJ farvning i sådanne muskler, sektionsafbrydelse eller mekanisk forstyrrelse af muskelfibre er ofte påkrævet. Som følge heraf kan innervation mønster blive forstyrret og en omfattende og høj kvalitet analyse af innervation mønstre, spiring og denervation er ofte kompromitteret. En alternativ tilgang er at bruge tynde flade muskler, som ikke kræver sektionsopdeling og kan farves og monteres intakt, hvilket giver et omfattende overblik over hele innervation af musklen. Der er en række muskler, der kan bruges til en sådan analyse, herunder en gruppe af kraniale muskler, (omfatter levator auris longus, auricularis overlegen, og adductor auris longus)14, thorax muskler (f.eks. trekantede sterni) 15og mavemuskler(f.eks. tværgående abdominis (TVA)). Den største hindring i at bruge sådanne muskler er den tekniske ekspertise, der kræves for at dissekere dem uden skader.
I denne video giver vi en protokol til at dissekere og udføre immunfluorescerende mærkning af TVA-musklen fra musen for at muliggøre en omfattende analyse af innervation mønster og NMJ morfologi. TVA-musklen er en overvejende langsom rykmuskel, der består af det dybeste lag af abdominal muskulatur og er innerveret af de nedre intercostalnerver. Tidligere arbejde har vist, at det er konsekvent meget sårbar over for patologi i en række musemodeller af barndommen motor neuron sygdom spinal muskelatrofi (SMA) og i andre musemodeller af tidlig debut motor neuron degeneration4,16. Vi foreslår derfor, at TVA er en nyttig muskel til at foretage NMJ-analyse i perifere neuropatier.
Protocol
Alle procedurer bør udføres efter de standarder for dyrepleje, som institutionen har fastsat.
1. Dissektion af abdominal muskulatur fra musen
- Før du starter, udgør 4% paraformaldehyd (PFA). Forsigtig: Hold altid PFA inden for en røghætte og brug passende beskyttelsesudstyr.
- Aflive musen ved en godkendt metode. Bemærk: Musen vist i videoen blev aflivet ved overdosis af CO2 og livmoderhalskræft dislokation. Denne mus er en 4 uger gammel mus af vild type på en CD1/C57Bl6 hybrid baggrund. Denne mus blev opdrættet i dyrefaciliteterne ved University of Ottawa fra mus, der oprindeligt blev købt.
- Lav et indledende snit gennem huden på hofteniveau og skær gennem huden hele vejen rundt om musen.
- Skræl huden af, træk opad, indtil du når niveauet af forbenene.
- Skær gennem abdominal muskulatur på niveau med hoften og fortsætte snittet, indtil du når rygsøjlen.
- På dette tidspunkt begynder du at skære opad gennem muskulaturen og ribbenene, indtil du når overekstremiteterne.
- Skær lige over, indtil du når rygsøjlen på den anden side.
- Skær nedad, indtil du når det punkt, hvor du startede.
- Udløsning af mellemgulvet nedenunder (pas på ikke at beskadige TVA-musklen) og læg det i fosfatbufferet saltvand (PBS) i en SYLGARD-belagt dissektionsskål med 0,2 mm dissektionsstifter.
- Pin ud brystkassen og tilhørende muskulatur i fadet, overfladisk side op, og sørg for musklen er fuldt strakt ud.
- Hæld 1x PBS og erstatte med 4% PFA.
- Dæk og lad på en gyngeplatform ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask 3x i 1x PBS ved stuetemperatur i 10 min.
* På dette tidspunkt de faste muskler kan efterlades i et køleskab natten før efterfølgende dissektion.
2. Isolering af TVA Muscle
- For at fortsætte med isolering af TVA-musklen, under et dissektionsmikroskop, skal du begynde med at skære gennem den eksterne skrå muskel på niveau med de sidste par ribben (Se figur 1 for en kommenteret guide).
- Skær lige ned ved siden af linea alba (pas på ikke at skære gennem TVA nedenfor), indtil du når starten af den interne skrå muskel.
- Derefter skæres over for at frigive den overliggende rectus abdominis og eksterne skrå muskler fra den øverste del af TVA nedenfor.
- Fjern blodkarret og eventuelt overliggende fedt fra TVA-musklen.
- Slip musklen fra det overliggende sidste ribben.
- Skær rundt om kanten af musklen og fjern til en 24-brønds plade, der indeholder PBS.
3. Immunfluorescerende mærkning og mikroskopi af TVA Muscle
For alle efterfølgende trin skal du fjerne væske ved hjælp af en fin spids pipette og lade pladen stå på en gyngeplatform. Medmindre andet er angivet, udføres alle efterfølgende trin ved stuetemperatur.
- Inkuber i PBS indeholder 1:1,000 fluorescerende mærkede bungarotoxin i 30 min at mærke NMJs. Dette kan gøres i et mørkt rum eller under folie.
- Gennemtrænge muskler ved at tilføje 300 μl per brønd på 2% Triton X-100 i PBS og lad på en gyngeplatform i 30 min.
- Inkuber i blokering reagens (4% BSA, 1% Triton i PBS) i 30 min.
- Inkuberes i blokering af reagenser, der indeholder primære antistoffer (neurofilament 1:100; synaptisk vesikelprotein 2, 1:250) ved 4 °C natten over.
- Vask 3x i 1x PBS.
- Inkuber i PBS indeholdende 1:250 sekundært antistof i 2-4 timer.
- Vask 3x i 1x PBS.
- Monter musklerne på glasrutsjebaner ved hjælp af tilstrækkelige lysstofrør og coverlip.
- Dias ses bedst ved hjælp af et dobbeltbåndspasfilter på et standard epifluorescerende mikroskop.
- NMJs er bedst afbildet ved hjælp af en z-serie projektion på en confocal mikroskop udstyret med mindst en 40X mål.
Representative Results
Ovenstående protokol leder isolering og farvning af TVA muskel til NMJ analyse. Dette giver mulighed for helmontering analyse af muskel innervation mønstre samt høj opløsning analyse af NMJ morfologi (Figur 2). Denne teknik kan med succes anvendes til at afsløre NMJ patologi i musemodeller af motorisk neuronsygdom, såsom SMA4,17(Figur 3). I musemodeller af SMA er der betydelig intramuskulær variation i patologi, men TVA-musklen er konsekvent stærkt påvirket. Dette fremgår af denervation af motoriske endplates, akkumulering af neurofilamenter ved den præsynaptiske terminal og terminalspiring (figur 3). De resultater, der præsenteres her, viser således, at den ovenfor beskrevne teknik kan være en effektiv metode til at give et omfattende overblik over innervation og analyse af NMJ patologi i musemodeller.
Figur 1. Oversigt over musens abdominale muskulatur. (A) Billedet viser brystburet med tilhørende abdominal muskulatur, som er blevet fjernet fra en nyligt aflivet mus og fastgjort i en dissektionsskål overfladisk side op (A). (B) Dissektion i A er blevet kommenteret for at markere de omtrentlige grænser for mavemusklerne. De overfladiske mavemuskler kan ses på venstre side af dissektionen, og omfatter ekstern skrå (skitseret i blå) og rectus abdominis (skitseret med rødt). På højre side af dissektionen er de overfladiske muskler blevet fjernet tillod visualisering af tværgående abdominismuskel (skitseret i grøn) og den interne skrå muskel (skitseret i gult). Formålet med denne protokol er at lede dissektion af den overlegne del af TVA muskel, vist her som en solid grøn trekant. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Helmontering oversigt over neuromuskulære vejkryds i TVA muskel. Billeder, der viser eksempel NMJs fra TVA muskel visualiseret med immunofluorescent farvning for neurofilament (NF; grøn), synaptisk vesikel protein 2 (SV2; grøn) og bungarotoxin (BTX; rød). Billederne er fluorescerende mikrografer, der viser hele musklen (A) eller konfokale billeder, der viser grupper (B) eller individuelle (C) NMJs. Skala bar = 800 μm (A), 70 μm (B), 25 μm (C). Klik her for at se større billede.
Figur 3. Neuromuskulære krydset patologi i TVA muskel fra en mus model af SMA. Konfokale mikrografer, der viser NMJs fra TVA-musklen, der visualiseres med immunfluorescerende farvning til neurofilament (NF; grøn), synaptisk vesikelprotein 2 (SV2; grøn) og bungarotoxin (BTX; rød) fra enten kontrol (Smn2B /+) eller SMA-musemodel (Smn2B /-). Bemærk, at mens normal NMJ morfologi kan observeres i kontrol mus, i TVA muskler fra Smn2B / - mus er der tegn på fuld denervation (hvid pilespids), delvis denervation (lilla pilespids) terminal spirende (blå pilespids) og præsynaptisk hævelse (gul pilespids). De postsynaptiske endeplader er også mindre komplekse, hvilket afspejler en tilsyneladende mindre moden fænotype. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se større billede.
Discussion
I denne video har vi detaljeret en protokol for dissektion af TVA-musklen fra musen og for hele monteringen immunfluorescerende mærkning af NMJs i musklen. Vi præsenterer også data, der viser, at denne muskel kan bruges til at analysere neuromuskulær krydspatologi i en musemodel af SMA.
Succes i denne teknik er afhængig af en række faktorer. Nogle af de mest almindelige problemer er skitseret nedenfor. For det første: dårlig immunokemisk farvning. Der kan være en række årsager til dette, hvor en af de mest almindelige er brugen af forskellige reagenser end dem, der er anført i denne protokol. En høj kvalitet elektronmikroskopi kvalitet PFA er meget vigtigt at sikre god farvning, som er valget af antistoffer, der er anført i denne protokol. Derudover kan det være vanskeligere at få farvning af god kvalitet hos ældre dyr(dvs.> 3 måneder). Dette skyldes øget tykkelse af fascia omkring musklen og stigningen i fedtakkumulering mellem den eksterne skrå og tranversus abdominis. Det er vigtigt at fjerne fedtet, før du fortsætter til immunfluorescens. Det kan også være nødvendigt at fratage nogle af de fascia, der dækker musklen, som kan blive fortykket. Det er nogle gange svært at fratage fascia og fedt fra musklen uden at pådrage sig nogle skader på muskelfibre og en forstyrrelse af innervation mønster. Men hvis denne teknik udføres omhyggeligt, kan farvning af god kvalitet erhverves fra mus op til mindst 1 år. Hos yngre mus (dvs.mindre end 3 måneder) bør det ikke være nødvendigt at udføre nogen drilleri eller adskillelse af muskelfibre. For det andet: vanskeligt at finde NMJs efter dissektion og farvning. Dette skyldes ofte, at dissektionen ikke har strakt sig under det sidste ribben. Størstedelen af NMJs er placeret lige under det sidste ribben, og derfor skal man sørge for at sikre, at denne del af musklen er inkluderet i dissektionen. For det tredje: overholdelse af EO muskel til TVA muskel. Dette er ofte en klage, når enkeltpersoner forsøger at udvide dissektion under niveauet for den interne skrå (IO) muskel. Det område af TVA muskel, hvor IO er også til stede, er vanskeligere at analysere, da det kan være svært at skelne, hvilken muskel er der. Af denne grund dissekerer vi rutinemæssigt bare den mest overlegne del af TVA-musklen. På dette niveau er der ingen tilslutning mellem EO- og TVA-musklerne, og dette bør derfor ikke være et væsentligt problem.
En væsentlig hindring for at bruge TVA muskel, i forhold til blindtarmsmuskler, er tilgængelighed for enten kirurgiske manipulationer eller injektion af stoffer. Disse typer af eksperimenter kan være afgørende for at undersøge NMJ fysiologi i en given muskel. Selv om TVA er helt sikkert mindre let tilgængelige end mere almindeligt anvendte muskler såsom tibialis forreste eller gastrocnemius, tidligere arbejde har vist, at det er muligt at denervate TVA ved kirurgisk skade af intercostal nerver18. Vi har for nylig også brugt denne muskel til lokal administration af stoffer under fuld bedøvelse (ikke-offentliggjorte data). Selvom disse eksperimenter kan udgøre en moderat teknisk udfordring, viser dette arbejde, at de er mulige og dermed udvider nytten af denne muskel til analyse af NMJs under både patologisk og fysiologisk manipulation.
TVA muskel er en af en række tynde flade muskler placeret i hele kroppen, der kan bruges til hele mount analyse af innervation mønstre. Andre muskler omfatter en gruppe af kraniemuskler innerveret af motoriske neuroner stammer fra ansigtet kernen i hjernestammen, der omfatter levator auris longus, auricularis overlegen, og adductor auris longus, de dissektioner, som er blevet beskrevet tidligere14,19. Desuden kan muskulaturen omkring TVA-musklen, herunder EO, IO og rectus abdominis, også mærkes og bruges til NMJ-analyse. For omfattende analyse af NMJ patologi i en musemodel er det vigtigt at overveje en række muskler beliggende i hele kroppen og ikke at begrænse analysen til en enkelt muskel. Dette er eksemplificeret i musemodeller af motoriske neuronsygdomme, hvor der er betydelig heterogenitet i niveauer af NMJ patologi mellem forskellige muskler20. En sådan intermuskulær variation er et yderst værdifuldt værktøj, når man undersøger mekanismen for motorisk neuron sårbarhed og derfor begrænser analyse til en enkelt muskel kan betydeligt mindske potentialet i forskningen.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra canadian Institutes of Health Research (grant number MOP 38040) til R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) til R.K., Families of SMA to R.K. and L.M.M, The SMA Trust to T.H.G., and The Muscular Dystrophy Campaign to T.H.G.. L.M.M er modtager af en multipel sklerose Society of Canada Postdoctoral Fellowship, og RK er modtager af en University Health Research Chair fra University of Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
