Summary
Neste vídeo demonstramos um protocolo de dissecção do músculo transversus abdominis do camundongo e usamos imunofluorescência e microscopia para visualizar junções neuromusculares.
Abstract
A análise da morfologia da junção neuromuscular pode dar uma visão importante do estado fisiológico de um determinado neurônio motor. A análise de músculos planos finos pode oferecer vantagem significativa sobre os músculos mais grossos tradicionalmente utilizados, como os do membro traseiro (por exemplo. gastrocnemius). Os músculos finos permitem uma visão geral abrangente de todo o padrão de inervação para um determinado músculo, o que, por sua vez, permite a identificação de piscinas seletivamente vulneráveis de neurônios motores. Esses músculos também permitem a análise de parâmetros como tamanho da unidade motora, ramificação axonal e broto terminal/nodal. Um obstáculo comum no uso desses músculos é ganhar a expertise técnica para dissecá-los. Neste vídeo, detalhamos o protocolo de dissecação do músculo transversus abdominis (TVA) de camundongos jovens e a realização de imunofluorescência para visualizar axônios e junções neuromusculares (NMJs). Demonstramos que essa técnica dá uma visão completa do padrão de inervação do músculo TVA e pode ser usada para investigar a patologia do NMJ em um modelo de camundongo da doença do neurônio motor infantil, atrofia muscular espinhal.
Introduction
As junções neuromusculares (NMJs) são a conexão sináptica entre um neurônio motor inferior e uma fibra muscular esquelética. São tradicionalmente consideradas uma sinapse tripartite, composta por um neurônio (terminal pré-sináptico), fibra muscular (terminal pós-sináptico) e célula schwann terminal1. Os NMJs parecem ser alvos precoces e significativos na patologia em uma gama de doenças de neurônios motores e modelos de camundongos2,3. Os sintomas típicos incluem a denervação, onde a placa final do motor torna-se desprovida de uma inervação pré-sináptica, inchaço do terminal pré-sináptico e redução da complexidade da morfologia NMJ4-11. Também podem ser observadas respostas compensatórias, que incluem brotação terminal e nodal, onde os processos axonais se estendem desde terminais sinápticos remanescentes ou internos até placas endervadas reinnervadas12,13. Devido à correlação apertada entre a atividade sináptica e a morfologia do NMJ, uma grande quantidade de informações pode ser obtida sobre o estado funcional dos neurônios motores a partir da análise da morfologia NMJ. Como a perda de NMJs representa frequentemente um dos primeiros aspectos da patologia neuromuscular4,10, a quantificação ao nível da inervação pode dar informações importantes sobre a progressão da patologia e o efeito potencial de uma intervenção terapêutica. Além disso, como a perda do NMJ representa um passo significativo na progressão patológica, o desenvolvimento de terapêuticas que possam estabilizar as conexões e incentivar a regeneração pode gerar benefícios significativos.
Ao analisar a morfologia do NMJ, a escolha muscular é de grande importância. Algumas das considerações primárias podem incluir tipo de fibra muscular, posição corporal e análise comparativa às condições humanas. Além disso, quando são necessárias manipulações como injeção de substâncias ou lesão nervosa traumática, a acessibilidade experimental também é importante a considerar. Em geral, é preferível analisar uma gama de músculos posicionados em todo o corpo refletindo uma gama de subtipos de unidade motora. Muitas vezes, no entanto, a escolha muscular é influenciada pela facilidade de dissecção. Consequentemente, a análise do NMJ é frequentemente realizada exclusivamente em grandes músculos appendiculares, como gastrocnemius. Para obter uma boa coloração de NMJ nesses músculos, seccional ou interrupção mecânica das fibras musculares é frequentemente necessário. Como resultado, o padrão de inervação pode se tornar interrompido e uma análise abrangente e de alta qualidade dos padrões de inervação, brotando e denervação é frequentemente comprometida. Uma abordagem alternativa é usar músculos planos finos que não requerem secção e podem ser manchados e montados intactos, permitindo uma visão geral abrangente de toda a inervação do músculo. Há uma série de músculos que podem ser usados para tal análise, incluindo um grupo de músculos cranianos, (englobando levator auris longus, auricularis superior, e adutor auris longus)14, músculos torácicos (por exemplo. triangularis sterni) 15, e músculos abdominais(por exemplo, transversus abdominis (TVA)). O maior obstáculo no uso desses músculos é a perícia técnica necessária para dissecá-los sem danos.
Neste vídeo, fornecemos um protocolo para dissecar e realizar rotulagem imunofluorescente do músculo TVA do camundongo para permitir uma análise abrangente do padrão de inervação e morfologia NMJ. O músculo TVA é um músculo de contração predominantemente lento que compreende a camada mais profunda de musculatura abdominal e é inervatado pelos nervos intercostais inferiores. Trabalhos anteriores mostraram ser consistentemente altamente vulnerável à patologia em uma série de modelos de camundongos da doença do neurônio motor infantil atrofia muscular espinhal (SMA) e em outros modelos de camundongos de degeneração de neurônio motor de início precoce4,16. Por conseguinte, sugerimos que o TVA é um músculo útil para a realização da análise de NMJ em neuropatias periféricas.
Protocol
Todos os procedimentos devem ser realizados nos padrões de cuidado animal estabelecidos pela instituição.
1. Dissecção da Musculatura Abdominal do Rato
- Antes de começar, compõem 4% de paraformaldeído (PFA). Atenção: Mantenha sempre a PFA dentro de um capô de fumaça e use equipamentos de proteção adequados.
- Eutanize o rato por um método aprovado. Nota: O rato mostrado no vídeo foi eutanizado por overdose de CO2 e luxação cervical. Este mouse é um mouse de 4 semanas de idade em um fundo híbrido CD1/C57Bl6. Este rato foi criado nas instalações de animais da Universidade de Ottawa a partir de ratos que foram originalmente comprados.
- Faça uma incisão inicial através da pele ao nível do quadril e corte através da pele todo o caminho ao redor do rato.
- Retire a pele, puxando para cima até atingir o nível do membro dianteiro.
- Corte a musculatura abdominal ao nível do quadril e continue a incisão até chegar à coluna vertebral.
- Neste ponto, comece a cortar para cima através da musculatura e das costelas até chegar ao membro superior.
- Corte em linha reta até chegar à coluna vertebral do outro lado.
- Corte para baixo até chegar ao ponto em que começou.
- Libere o diafragma por baixo (tomando cuidado para não danificar o músculo TVA) e coloque-o em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) em um prato de dissecção revestido de SYLGARD com pinos de dissecção de 0,2 mm.
- Fixar a caixa torácica e a musculatura associada no prato, lado superficial para cima, certificando-se de que o músculo está totalmente esticado.
- Despeje o PBS 1x e substitua por 4% de PFA.
- Cubra e deixe em uma plataforma de balanço em temperatura ambiente por 15 minutos.
- Lave 3x em 1x PBS em temperatura ambiente por 10 minutos.
* Neste ponto, os músculos fixos podem ser deixados em uma geladeira durante a noite antes da dissecação subsequente.
2. Isolamento do Músculo TVA
- Para proceder com o isolamento do músculo TVA, sob um microscópio de dissecção, comece cortando o músculo oblíquo externo ao nível das últimas costelas (Ver Figura 1 para um guia anotado).
- Corte direto para baixo ao lado da linhaa alba (tomando cuidado para não cortar através do TVA abaixo) até chegar ao início do músculo oblíquo interno.
- Em seguida, corte para liberar o reto abdominis sobreposto e os músculos oblíquos externos da parte superior do TVA abaixo.
- Remova o vaso sanguíneo e qualquer gordura excessiva do músculo TVA.
- Solte o músculo da última costela.
- Corte em torno das margens do músculo e remova para uma placa de 24 poços contendo PBS.
3. Rotulagem imunofluorescente e microscopia do músculo TVA
Para todas as etapas subsequentes, remova o líquido usando uma pipeta fina e deixe a placa em uma plataforma de balanço. Salvo previsão em contrário, todas as etapas subsequentes são realizadas à temperatura ambiente.
- Incubar em PBS contendo 1:1.000 bungarotoxina fluorescente marcada por 30 minutos para rotular os NMJs. Isso pode ser feito em uma sala escura ou sob papel alumínio.
- Músculo permeabilize adicionando 300 μl por poço de 2% Triton X-100 em PBS e deixe em uma plataforma de balanço por 30 minutos.
- Incubar no reagente de bloqueio (4% BSA, 1% Triton na PBS) por 30 min.
- Incubar no bloqueio de reagente contendo anticorpos primários (neurofilamento 1:100; proteína de vesícula sináptica 2, 1:250) a 4 °C durante a noite.
- Lave 3x em 1x PBS.
- Incubar em PBS contendo 1:250 anticorpo secundário por 2-4 horas.
- Lave 3x em 1x PBS.
- Monte os músculos em lâminas de vidro usando mídia de montagem fluorescente suficiente e deslizamento de cobertura.
- Slides são melhor visualizados usando um filtro de passe de banda dupla em um microscópio epifluorescente padrão.
- Os NMJs são melhor imagens usando uma projeção da série Z em um microscópio confocal equipado com pelo menos um objetivo de 40X.
Representative Results
O protocolo acima direciona o isolamento e a coloração do músculo TVA para análise de NMJ. Isso permite a análise completa dos padrões de inervação muscular, bem como a análise de alta resolução da morfologia NMJ(Figura 2). Essa técnica pode ser aplicada com sucesso para revelar a patologia do NMJ em modelos de camundongos da doença do neurônio motor, como a SMA4,17(Figura 3). Nos modelos de camundongos de SMA há variabilidade intramuscular significativa na patologia, porém o músculo TVA é consistentemente altamente afetado. Isso é evidenciado pela denervação de placas finais motoras, acúmulo de neurofilamentos no terminal pré-sináptico e broto terminal(Figura 3). Os resultados aqui apresentados demonstram que a técnica descrita acima pode ser um método poderoso para fornecer uma visão geral abrangente da inervação e análise da patologia NMJ em modelos de camundongos.
Figura 1. Visão geral da musculatura abdominal do rato. (A) A imagem mostra a gaiola torácica com musculatura abdominal anexada, que foi removida de um rato recentemente eutanizado e presa em um prato de dissecção superficial para cima(A). (B) A dissecação em A foi anotada para marcar os limites aproximados dos músculos abdominais. Os músculos abdominais superficiais podem ser vistos no lado esquerdo da dissecção, e incluem oblíquo externo (delineado em azul) e reto abdominis (delineado em vermelho). No lado direito da dissecção, os músculos superficiais foram removidos permitido visualização do músculo transverso abdominis (delineado em verde) e do músculo oblíquo interno (delineado em amarelo). O objetivo deste protocolo é direcionar a dissecação da parte superior do músculo TVA, mostrada aqui como um triângulo verde sólido. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 2. Visão geral total das junções neuromusculares no músculo TVA. Imagens que mostram exemplos de NMJs do músculo TVA visualizados com coloração imunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína de vesícula sináptica 2 (SV2; verde) e bungarotoxina (BTX; vermelho). As imagens são micrografias fluorescentes em montagem que mostram todo o músculo (A) ou imagens confocal mostrando grupos (B) ou individuais(C)NMJs. Barra de escala = 800 μm(A),70 μm(B),25 μm(C). Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 3. Patologia da junção neuromuscular no músculo TVA de um modelo de camundongos de SMA. Micrografias confocal mostrando NMJs do músculo TVA visualizados com coloração imunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína vesícula sináptica 2 (SV2; verde) e bungarotoxina (BTX; vermelho) de ambos os controles(Smn2B/+) ou modelo de rato SMA(Smn2B/-). Observe que, embora a morfologia NMJ normal possa ser observada em camundongos de controle, nos músculos TVA de Smn2B/- ratos há evidências de denervação total (ponta de flecha branca), denervação parcial (ponta de flecha roxa) brotando terminal (ponta de flecha azul) e inchaço pré-sináptico (ponta de flecha amarela). As placas finais pós-sinápticas também são menos complexas refletindo um fenótipo aparentemente menos maduro. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver imagem maior.
Discussion
Neste vídeo, detalhamos um protocolo para a dissecção do músculo TVA do camundongo e para a rotulagem imunofluorescente de montagem total de NMJs dentro do músculo. Também apresentamos dados que mostram que este músculo pode ser usado para analisar a patologia da junção neuromuscular em um modelo de camundongos de SMA.
O sucesso nesta técnica depende de uma série de fatores. Alguns dos problemas mais comuns estão descritos abaixo. Em primeiro lugar: má coloração imunohistoquímica. Pode haver uma série de razões para isso, uma das mais comuns sendo o uso de diferentes reagentes para os listados neste protocolo. Um PFA de alto grau de microscopia eletrônica é muito importante para garantir uma boa coloração, assim como a escolha de anticorpos listados neste protocolo. Além disso, em animais mais velhos (ou seja,> 3 meses), obter uma boa qualidade de coloração pode ser mais difícil. Isso se deve ao aumento da espessura da fáscia em torno do músculo e ao aumento do acúmulo de gordura entre o oblíquo externo e o tranversus abdominis. É importante retirar a gordura, antes de proceder à imunofluorescência. Também pode ser necessário tirar parte da fáscia cobrindo o músculo, que pode ficar engrossado. Às vezes é difícil tirar a fáscia e a gordura do músculo sem incorrer em algum dano à fibra muscular e uma interrupção do padrão de inervação. No entanto, se essa técnica for realizada com cuidado, a coloração de boa qualidade pode ser adquirida de camundongos até pelo menos 1 ano de idade. Em camundongos mais jovens (ouseja, menos de 3 meses de idade) não deve ser necessário realizar qualquer provocação ou separação de fibras musculares. Em segundo lugar: difícil encontrar NMJs após dissecação e coloração. Isso ocorre muitas vezes porque a dissecção não se estendeu por baixo da última costela. A maioria dos NMJs estão localizados logo abaixo da última costela e, portanto, devem ser tomados cuidados para garantir que esta parte do músculo seja incluída na dissecação. Em terceiro lugar: a adesão do músculo EO ao músculo TVA. Esta é frequentemente uma queixa quando os indivíduos tentam estender a dissecção abaixo do nível do músculo oblíquo interno (IO). A área do músculo TVA onde o IO também está presente é mais difícil de analisar, pois pode ser difícil distinguir qual músculo é qual. Por essa razão, nós rotineiramente apenas dissecamos a parte mais superior do músculo TVA. Neste nível, não há adesão entre os músculos EO e TVA e, portanto, este não deve ser um problema significativo.
Um obstáculo significativo para o uso do músculo TVA, comparado aos músculos appendiculares, é a acessibilidade para manipulações cirúrgicas ou injeção de substâncias. Esses tipos de experimentos podem ser cruciais para investigar a fisiologia do NMJ em um determinado músculo. Embora o TVA seja certamente menos facilmente acessível do que os músculos mais comumente utilizados, como tibialis anterior ou gastrocnemius,trabalhos anteriores mostraram que é possível denervar o TVA por lesão cirúrgica dos nervos intercostais18. Recentemente também usamos este músculo para a administração local de substâncias sob anestesia geral (dados inéditos). Embora esses experimentos possam representar um desafio técnico moderado, este trabalho mostra que eles são viáveis e, portanto, estendem a utilidade desse músculo para análise de NMJs sob manipulação patológica e fisiológica.
O músculo TVA é um dos vários músculos planos finos situados em todo o corpo que podem ser usados para análise completa dos padrões de inervação. Outros músculos incluem um grupo de músculos cranianos inervados por neurônios motores originários do núcleo facial do tronco cerebral, abrangendo levator auris longus, auricularis superiore adutor auris longus, as dissecções para as quais foram descritas anteriormente14,19. Além disso, a musculatura em torno do músculo TVA, incluindo EO, IO e reto abdominis,também pode ser rotulada e usada para análise de NMJ. Para uma análise abrangente da patologia NMJ em um modelo de camundongo, é importante considerar uma série de músculos situados em todo o corpo e não restringir a análise a um único músculo. Isso é exemplificado em modelos de camundongos de doenças do neurônio motor onde há heterogeneidade significativa nos níveis de patologia do NMJ entre diferentes músculos20. Essa variabilidade intermuscular é uma ferramenta extremamente valiosa ao investigar o mecanismo de vulnerabilidade do neurônio motor e, portanto, restringir a análise a um único músculo poderia diminuir significativamente o potencial da pesquisa.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (número de subvenção MOP 38040) para R.K., Associação de Distrofia Muscular (EUA) para R.K., Famílias de SMA para R.K. e L.M.M, The SMA Trust to T.H.G., e The Muscle Dystrophy Campaign to T.H.G.. L.M.M é um beneficiário de uma Sociedade de Pós-Doutorado da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá, e R.K. é um beneficiário de uma Cadeira de Pesquisa em Saúde universitária da Universidade de Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
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