Summary
In deze video demonstreren we een protocol voor dissectie van de transversus abdominis spier van de muis en gebruiken we immunofluorescentie en microscopie om neuromusculaire verbindingen te visualiseren.
Abstract
Analyse van neuromusculaire junction morfologie kan belangrijk inzicht geven in de fysiologische status van een bepaald motorneuron. Analyse van dunne platte spieren kan een aanzienlijk voordeel bieden ten opzichte van traditioneel gebruikte dikkere spieren, zoals die van de achterpoot (bijv.. gastrocnemius). Dunne spieren zorgen voor een uitgebreid overzicht van het hele innervatiepatroon voor een bepaalde spier, wat op zijn beurt identificatie van selectief kwetsbare pools van motorneuronen mogelijk maakt. Deze spieren maken ook analyse van parameters mogelijk, zoals de grootte van de motorische eenheid, axonale vertakking en terminale / nodale kieming. Een veel voorkomend obstakel bij het gebruik van dergelijke spieren is het verkrijgen van de technische expertise om ze te ontleden. In deze video beschrijven we het protocol voor het ontleden van de transversus abdominis (TVA) spier van jonge muizen en het uitvoeren van immunofluorescentie om axonen en neuromusculaire verbindingen (NMJ's) te visualiseren. We tonen aan dat deze techniek een volledig overzicht geeft van het innervatiepatroon van de TVA-spier en kan worden gebruikt om NMJ-pathologie te onderzoeken in een muismodel van de motorneuronziekte bij kinderen, spinale musculaire atrofie.
Introduction
Neuromusculaire verbindingen (NMJ's) zijn de synaptische verbinding tussen een lager motorneuron en een skeletspiervezel. Ze worden traditioneel beschouwd als een tripartiete synaps, bestaande uit een neuron (presynaptische terminal), spiervezel (post synaptische terminale) en terminale Schwann cel1. NMJ's lijken vroege en significante doelwitten in pathologie te zijn in een reeks motorneuronziekten en muismodellen2,3. Typische symptomen zijn denervatie, waarbij de motorische eindplaat verstoken raakt van een presynaptische innervatie, zwelling van de presynaptische terminal en een vermindering van de complexiteit van de NMJ-morfologie4-11. Compenserende reacties kunnen ook worden opgemerkt, waaronder terminale en nodale kieming, waarbij axonale processen zich uitstrekken van resterende synaptische terminals of internodes tot gerenervateerde gedenervateerde eindplaten12,13. Door de nauwe correlatie tussen synaptische activiteit en NMJ-morfologie kan veel informatie worden verkregen over de functionele status van motorneuronen uit analyse van NMJ-morfologie. Aangezien verlies van NMJ's vaak een van de eerste aspecten van neuromusculaire pathologie4,10vertegenwoordigt, kan kwantificering op het niveau van innervatie belangrijke informatie geven over de progressie van pathologie en het potentiële effect van een therapeutische interventie. Bovendien, aangezien NMJ-verlies een belangrijke stap in pathologische progressie betekent, kan de ontwikkeling van therapieën die verbindingen kunnen stabiliseren en regeneratie kunnen aanmoedigen, aanzienlijke voordelen opleveren.
Bij het analyseren van NMJ morfologie is spierkeuze van groot belang. Enkele van de belangrijkste overwegingen kunnen spiervezeltype, lichaamspositie en vergelijkende analyse van menselijke omstandigheden zijn. Bovendien, waar manipulaties zoals injectie van stoffen of traumatisch zenuwletsel nodig zijn, is experimentele toegankelijkheid ook belangrijk om te overwegen. Over het algemeen verdient het de voorkeur om een reeks spieren te analyseren die door het hele lichaam zijn geplaatst en een reeks subtypen van de motorische eenheid weerspiegelen. Vaak wordt de spierkeuze echter beïnvloed door het gemak van dissectie. Bijgevolg wordt NMJ-analyse vaak uitsluitend uitgevoerd op grote appendiculaire spieren zoals gastrocnemius. Om een goede NMJ-kleuring in dergelijke spieren te verkrijgen, is vaak sectioning of mechanische verstoring van spiervezels vereist. Als gevolg hiervan kan het innervatiepatroon worden verstoord en wordt een uitgebreide en hoogwaardige analyse van innervatiepatronen, ontkiemen en denervatie vaak aangetast. Een alternatieve aanpak is om dunne platte spieren te gebruiken die geen doorsnede vereisen en intact kunnen worden gekleurd en gemonteerd, waardoor een uitgebreid overzicht van de volledige innervatie van de spier mogelijk is. Er zijn een aantal spieren die voor een dergelijke analyse kunnen worden gebruikt, waaronder een groep schedelspieren ( triangularis sterni) enbuikspieren(bijv. transversus abdominis (TVA)). De grootste belemmering bij het gebruik van dergelijke spieren is de technische expertise die nodig is om ze zonder schade te ontleden.
In deze video bieden we een protocol om immunofluorescente etikettering van de TVA-spier van de muis te ontleden en uit te voeren om een uitgebreide analyse van het innervatiepatroon en nmj-morfologie mogelijk te maken. De TVA-spier is een overwegend langzame twitch-spier die de diepste laag buikspieren omvat en wordt geïntensierd door de onderste intercostale zenuwen. Eerder werk heeft aangetoond dat het consistent zeer kwetsbaar is voor pathologie in een aantal muismodellen van de kindermotorneuronziekte spinale musculaire atrofie (SMA) en in andere muismodellen van vroege beginnende motorneurondegeneratie4,16. We stellen daarom voor dat de TVA een nuttige spier is voor het uitvoeren van NMJ-analyse bij perifere neuropathieën.
Protocol
Alle procedures moeten worden uitgevoerd volgens de door de instelling vastgestelde normen voor dierverzorging.
1. Dissectie van de abdominale spiermassa van de muis
- Voordat u begint, moet u 4% paraformaldehyde (PFA) maken. Let op: Houd PFA altijd in een zuurkast en draag de juiste beschermingsmiddelen.
- Euthanaseer de muis volgens een goedgekeurde methode. Opmerking: De muis in de video werd geëuthanaseerd door een overdosis CO2 en cervicale dislocatie. Deze muis is een 4 weken oude wilde muis op een CD1/C57Bl6 hybride achtergrond. Deze muis werd gefokt in de dierenfaciliteiten van de Universiteit van Ottawa van muizen die oorspronkelijk werden gekocht.
- Maak een eerste incisie door de huid ter hoogte van de heup en snijd door de huid helemaal rond de muis.
- Pel de huid af en trek naar boven tot je het niveau van de voorpoten bereikt.
- Snijd door de buikspier ter hoogte van de heup en ga door met de incisie totdat u de wervelkolom bereikt.
- Begin op dit punt omhoog te snijden door het spierstelsel en de ribben totdat je de bovenste ledemaat bereikt.
- Snijd rechtdoor tot u de wervelkolom aan de andere kant bereikt.
- Snijd naar beneden tot je het punt bereikt waarop je bent begonnen.
- Laat het membraan van onderen los (zorg ervoor dat de TVA-spier niet wordt beschadigd) en plaats het in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een sylgard-gecoate dissectieschaal met dissectiepennen van 0,2 mm.
- Speld de ribbenkast en het bijbehorende spierstelsel in de schaal, oppervlakkige kant naar boven, om ervoor te zorgen dat de spier volledig is uitgerekt.
- Giet de 1x PBS eraf en vervang door 4% PFA.
- Dek af en laat 15 minuten op kamertemperatuur op een schommelplatform staan.
- Was 3x in 1x PBS op kamertemperatuur gedurende 10 min.
* Op dit punt kunnen de vaste spieren 's nachts in de koelkast worden achtergelaten voordat ze worden ontleed.
2. Isolatie van de TVA-spier
- Om verder te gaan met de isolatie van de TVA-spier, onder een dissectiemicroscoop, begint u met het doorsnijden van de uitwendige schuine spier ter hoogte van de laatste paar ribben (zie figuur 1 voor een geannoteerde gids).
- Snijd recht naar beneden naast de linea alba (zorg ervoor dat u de TVA hieronder niet doorsnijdt) totdat u het begin van de interne schuine spier bereikt.
- Snijd vervolgens over om de overdreven rectus abdominis en externe schuine spieren los te maken van het bovenste deel van de TVA hieronder.
- Verwijder het bloedvat en eventueel oververmoeid vet uit de TVA-spier.
- Laat de spier los van de oververmoeid laatste rib.
- Snijd rond de spierranden en verwijder deze tot een plaat met 24 putjes pbs.
3. Immunofluorescente etikettering en microscopie van de TVA-spier
Voor alle volgende stappen verwijdert u vloeistof met behulp van een fijne pipet en laat u de plaat op een schommelplatform staan. Tenzij anders vermeld, worden alle volgende stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- Incubeer in PBS met 1:1.000 fluorescerend gelabeld bungarotoxine gedurende 30 minuten om de NMJ's te labelen. Dit kan in een donkere kamer of onder folie.
- Permeabiliseer de spier door 300 μl per put van 2% Triton X-100 in PBS toe te voegen en laat 30 minuten op een schommelplatform staan.
- Incubeer in blokkerend reagens (4% BSA, 1% Triton in PBS) gedurende 30 min.
- Incubeer in het blokkeren van reagens dat primaire antilichamen bevat (neurofilament 1:100; synaptisch blaasje eiwit 2, 1:250) bij 4 °C 's nachts.
- Was 3x in 1x PBS.
- Incubeer in PBS met 1:250 secundair antilichaam gedurende 2-4 uur.
- Was 3x in 1x PBS.
- Monteer spieren op glazen dia's met voldoende fluorescerende montagemedia en coverslip.
- Dia's kunnen het beste worden bekeken met behulp van een dubbelbanddoorlaatfilter op een standaard epifluorescente microscoop.
- NMJ's kunnen het beste worden afgebeeld met behulp van een projectie uit de z-serie op een confocale microscoop die is uitgerust met ten minste een 40X-objectief.
Representative Results
Het bovenstaande protocol stuurt de isolatie en kleuring van de TVA-spier voor NMJ-analyse. Dit maakt een whole-mount analyse van spier innervatie patronen en hoge resolutie analyse van NMJ morfologie mogelijk (Figuur 2). Deze techniek kan met succes worden toegepast om NMJ-pathologie te onthullen in muismodellen van motorneuronziekte, zoals SMA4,17(figuur 3). In muismodellen van SMA is er significante intramusculaire variabiliteit in pathologie, maar de TVA-spier wordt consequent sterk beïnvloed. Dit blijkt uit denervatie van motorische eindplaten, accumulatie van neurofilamenten aan de presynaptische terminal en terminale kieming (figuur 3). De hier gepresenteerde resultaten tonen dus aan dat de hierboven beschreven techniek een krachtige methode kan zijn om een uitgebreid overzicht te geven van innerlijke en analyse van NMJ-pathologie in muismodellen.
Figuur 1. Overzicht van abdominale musculatuur van de muis. (A) Afbeelding toont de borstkas met aange gehechte buikspieren, die is verwijderd van een onlangs geëuthanaseerde muis en is vastgepind in een dissectieschaal oppervlakkige kant naar boven (A). (B) Dissectie in A is geannoteerd om de geschatte grenzen van de buikspieren te markeren. De oppervlakkige buikspieren zijn te zien aan de linkerkant van de dissectie en omvatten externe schuine (in blauw omlijnde) en rectus abdominis (rood geschetst). Aan de rechterkant van de dissectie zijn de oppervlakkige spieren verwijderd, waardoor de transversus abdominis-spier (groen geschetst) en de interne schuine spier (geel geschetst) kunnen worden gevisualiseerd. Het doel van dit protocol is om de dissectie van het superieure deel van de TVA-spier te sturen, hier weergegeven als een effen groene driehoek. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Geheel-mount overzicht van neuromusculaire verbindingen in TVA spier. Afbeeldingen met voorbeeld NMJ's uit de TVA-spier gevisualiseerd met immunofluorescente kleuring voor neurofilament (NF; groen), synaptisch blaasje eiwit 2 (SV2; groen) en bungarotoxine (BTX; rood). Afbeeldingen zijn gemonteerde fluorescerende micrografen die de hele spier (A) of confocale afbeeldingen tonen die groepen (B) of individuele (C) NMJ's tonen. Schaalbalk = 800 μm (A), 70 μm (B), 25 μm (C). Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Neuromusculaire junction pathologie in TVA spier van een muis model van SMA. Confocale micrografen met NMJ's uit de TVA-spier gevisualiseerd met immunofluorescente kleuring voor neurofilament (NF; groen), synaptisch blaasje eiwit 2 (SV2; groen) en bungarotoxine (BTX; rood) van ofwel controle (Smn2B/+) of SMA muismodel (Smn2B/-). Merk op dat hoewel normale NMJ-morfologie kan worden waargenomen bij controlemuizen, er in TVA-spieren van Smn2B/- muizen aanwijzingen zijn voor volledige denervatie (witte pijlpunt), gedeeltelijke denervatie (paarse pijlpunt) terminale kieming (blauwe pijlpunt) en presynaptische zwelling (gele pijlpunt). De post-synaptische eindplaten zijn ook minder complex en weerspiegelen een ogenschijnlijk minder volwassen fenotype. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Discussion
In deze video hebben we een protocol beschreven voor de dissectie van de TVA-spier van de muis en voor de immunofluorescente etikettering van NMJ's in de spier. We presenteren ook gegevens waaruit blijkt dat deze spier kan worden gebruikt om neuromusculaire junction pathologie te analyseren in een muismodel van SMA.
Succes in deze techniek is afhankelijk van een aantal factoren. Enkele van de meest voorkomende problemen worden hieronder beschreven. Ten eerste: slechte immunohistochemische kleuring. Er kunnen een aantal redenen voor zijn, een van de meest voorkomende is het gebruik van verschillende reagentia dan die vermeld in dit protocol. Een hoogwaardige elektronenmicroscopiekwaliteit PFA is erg belangrijk om een goede kleuring te garanderen, net als de keuze van antilichamen die in dit protocol worden vermeld. Bovendien kan het bij oudere dieren(d.w.z.> 3 maanden) moeilijker zijn om vlekken van goede kwaliteit te krijgen. Dit komt door de toegenomen dikte van de fascia rond de spier en de toename van vetophoping tussen de uitwendige schuine en tranversus abdominis. Het is belangrijk om het vet af te verwijderen, voordat u doorgaat met immunofluorescentie. Het kan ook nodig zijn om een deel van de fascia die de spier bedekt, die verdikt kan raken, af te kleden. Het is soms moeilijk om de fascia en het vet uit de spier te verwijderen zonder enige schade aan de spiervezel en een verstoring van het innervatiepatroon op te lopen. Als deze techniek echter zorgvuldig wordt uitgevoerd, kan kleuring van goede kwaliteit worden verkregen bij muizen tot ten minste 1 jaar oud. Bij jongere muizen(d.w.z.jonger dan 3 maanden) hoeft het niet nodig te zijn om spiervezels te plagen of te scheiden. Ten tweede: moeilijk bij het vinden van NMJ's na dissectie en kleuring. Dit komt vaak omdat de dissectie zich niet heeft uitgebreid onder de laatste rib. De meeste NMJ's bevinden zich net onder de laatste rib en daarom moet ervoor worden gezorgd dat dit deel van de spier in de dissectie wordt opgenomen. Ten derde: aanhankelijkheid van de EO-spier aan de TVA-spier. Dit is vaak een klacht wanneer individuen proberen de dissectie uit te breiden tot onder het niveau van de interne schuine (IO) spier. Het gebied van de TVA-spier waar de IO ook aanwezig is, is moeilijker te analyseren omdat het moeilijk kan zijn om te onderscheiden welke spier welke is. Om deze reden ontleden we routinematig gewoon het meest superieure deel van de TVA-spier. Op dit niveau is er geen aanhankelijkheid tussen de EO- en TVA-spieren, en daarom zou dit geen significant probleem moeten zijn.
Een belangrijke belemmering voor het gebruik van de TVA-spier, in vergelijking met appendiculaire spieren, is toegankelijkheid voor chirurgische manipulaties of injectie van stoffen. Dit soort experimenten kunnen cruciaal zijn om nmj fysiologie in een bepaalde spier te onderzoeken. Hoewel de TVA zeker minder gemakkelijk toegankelijk is dan meer gebruikte spieren zoals tibialis anterior of gastrocnemius, heeft eerder werk aangetoond dat het mogelijk is om de TVA te denerveren door chirurgisch letsel van de intercostale zenuwen18. We hebben deze spier onlangs ook gebruikt voor lokale toediening van stoffen onder algemene verdoving (niet-gepubliceerde gegevens). Hoewel deze experimenten een matige technische uitdaging kunnen vormen, toont dit werk aan dat ze haalbaar zijn en zo het nut van deze spier uitbreiden voor analyse van NMJ's onder zowel pathologische als fysiologische manipulatie.
De TVA-spier is een van een aantal dunne platte spieren in het hele lichaam die kunnen worden gebruikt voor de analyse van innervatiepatronen. Andere spieren omvatten een groep schedelspieren die zijn geïntenseerd door motorneuronen afkomstig van de gezichtskern van de hersenstam, waaronder levator auris longus, auricularis superior, en adductor auris longus, waarvan de dissecties eerder zijn beschreven14,19. Bovendien kan het spierstelsel rond de TVA-spier, inclusief EO, IO en rectus abdominis,ook worden gelabeld en gebruikt voor NMJ-analyse. Voor een uitgebreide analyse van NMJ-pathologie in een muismodel is het belangrijk om een aantal spieren in het hele lichaam te overwegen en de analyse niet te beperken tot één spier. Dit wordt geïllustreerd in muismodellen van motorneuronziekten waarbij er een significante heterogeniteit is in niveaus van NMJ-pathologie tussen verschillende spieren20. Een dergelijke intermusculaire variabiliteit is een uiterst waardevol hulpmiddel bij het onderzoeken van het mechanisme van de kwetsbaarheid van motorneuronen en daarom kan het beperken van de analyse tot een enkele spier het potentieel van het onderzoek aanzienlijk verminderen.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadian Institutes of Health Research (subsidienummer MOP 38040) aan R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) aan R.K., Families of SMA aan R.K. en L.M.M, The SMA Trust aan T.H.G., en The Muscular Dystrophy Campaign aan T.H.G.. L.M.M is een ontvanger van een Multiple Sclerose Society of Canada Postdoctoral Fellowship, en R.K. is een ontvanger van een University Health Research Chair van de Universiteit van Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
