Summary
이 비디오에서 우리는 마우스의 트랜스 대 복부 근육의 해부에 대한 프로토콜을 시연하고 신경 근육 접합을 시각화하기 위해 면역 형광 및 현미경 검사를 사용합니다.
Abstract
신경 근육 접합 형태학의 분석은 주어진 운동 신경의 생리 상태에 중요한 통찰력을 줄 수 있습니다. 얇은 평평한 근육의 분석은 일반적으로 뒷사지에서 와 같은 두꺼운 근육에 비해 상당한 이점을 제공 할 수 있습니다(예를 들어. 위장혈증). 얇은 근육은 주어진 근육에 대한 전체 내적 패턴의 포괄적 인 개요를 허용, 이는 차례로 모터 뉴런의 선택적으로 취약한 풀의 식별을 허용. 이 근육은 또한 모터 단위 크기, 축상 분기 및 말단/무달 발아와 같은 매개 변수의 분석을 허용합니다. 이러한 근육을 사용 하 여 일반적인 장애물 그들을 해부 하는 기술 전문 지식을 얻고 있다. 이 비디오에서는 젊은 쥐의 트랜스대 아도미니(TVA) 근육을 해부하고 축산및 신경근육 접합부(NMJs)를 시각화하기 위한 면역불광을 수행하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 우리는이 기술은 TVA 근육의 내면 패턴의 완전한 개요를 제공하고 어린 시절 운동 신경 질환, 척추 근육 위축의 마우스 모델에서 NMJ 병리학을 조사하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
신경 근육 접합부 (NMJs)는 낮은 운동 뉴런과 골격 근육 섬유 사이의 시냅스 연결입니다. 그들은 전통적으로 뉴런 (사전 시냅스 말기), 근육 섬유 (시냅스 후 말기), 및 말단 슈완 세포1로구성된 삼자 시냅스로 간주됩니다. NMJs는 모터 뉴런 질환 및 마우스 모델 의 범위에서 병리학에서 초기 및 중요한 표적으로 나타납니다2,3. 대표적인 증상으로는 모터 엔드플레이트가 사전 시냅스 이너밴션이 없는 데너밴션, 사전 시냅스 단자의 붓기, NMJ 형태4-11의복잡성 감소 등이 있다. 축전 공정이 남은 시냅스 단자 또는 인터노드에서 재입하 덴어바틱 엔드플레이트12,13으로확장되는 터미널 및 노달 발아를 포함하는 보상 응답도 주목할 수 있다. 시냅스 활동과 NMJ 형태 사이의 긴밀한 상관 관계로 인해 NMJ 형태 분석에서 모터 뉴런의 기능 적 상태에 대해 많은 정보를 얻을 수 있습니다. NMJs의 손실은 신경 근육 병리학의 첫 번째 측면 중 하나를 자주 나타내기 때문에4,10,내면의 수준에서 정량화는 병리학의 진행과 치료 개입의 잠재적 인 효과에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 더욱이, NMJ 손실은 병리학적 진행에 있는 중요한 단계를 나타내기 때문에, 연결을 안정시키고 재생을 격려할 수 있는 치료의 발달은 중요한 이득을 산출할 수 있습니다.
NMJ 형태를 분석 할 때, 근육 선택은 매우 중요합니다. 주요 고려 사항 중 일부는 근육 섬유 유형을 포함 할 수 있습니다,본문 위치, 인간의 조건에 비교 분석. 또한, 물질의 주입이나 외상성 신경 상해와 같은 조작이 필요한 경우 실험적 접근성도 고려해야 합니다. 일반적으로, 다양한 모터 유닛 아형을 반사하는 신체 전체에 위치되는 근육의 범위를 분석하는 것이 바람직하다. 종종, 그러나, 근육 선택은 해부의 용이성에 의해 영향을 받습니다. 따라서, NMJ 분석은 종종 위트로네미와같은 큰 부관 근육에 독점적으로 수행됩니다. 이러한 근육에 좋은 NMJ 염색을 얻으려면 근육 섬유의 단면 또는 기계적 중단이 종종 필요합니다. 그 결과, 내부 배양 패턴이 중단되고 내면패턴, 발아 및 기질에 대한 포괄적이고 고품질의 분석이 종종 손상될 수 있다. 다른 방법은 단면이 필요하지 않고 그대로 염색하고 장착 할 수있는 얇은 평평한 근육을 사용하는 것입니다, 근육의 전체 내부의 포괄적 인 개요를 허용. 이러한 분석에 사용할 수 있는 근육의 수가 있다, 두개골 근육의 그룹을 포함 하 여, (레 바 토르 오리스 롱온을포함 하 여, 유리 혈관 우수한,및 adductor auris longus)14,흉부 근육(예를 들어. 삼각형 흉골) 15,및 복부(예를 들어, 트랜스 대 abdominis (TVA)) 근육. 이러한 근육을 사용 하 여 주요 장애물은 손상 없이 그들을 해부 하는 데 필요한 기술 전문 지식.
이 비디오에서는 내발 패턴 및 NMJ 형태에 대한 포괄적 인 분석을 허용하기 위해 마우스에서 TVA 근육의 면역 형광 라벨링을 해부하고 수행하는 프로토콜을 제공합니다. TVA 근육은 주로 복부 근육의 가장 깊은 층을 포함하는 느린 트위치 근육이며 낮은 늑간 신경에 의해 내면화됩니다. 이전 연구는 유년기 운동 신경 질환 척추 근육 위축 (SMA)의 마우스 모델의 수와 초기 발병 운동 뉴런 변성의 다른 마우스 모델에서 병리학에 지속적으로 매우 취약한 것으로 나타났다4,16. 따라서 TVA는 말초 신경병증에서 NMJ 분석을 착수하기위한 유용한 근육이라고 제안합니다.
Protocol
모든 절차는 기관이 정한 동물 관리 기준에 따라 수행되어야 합니다.
1. 마우스에서 복부 근육의 해부
- 시작하기 전에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 구성합니다. 주의: 항상 연기 후드 내에 PFA를 보관하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
- 승인된 방법으로 마우스를 안락사시합니다. 참고: 비디오에 표시된 마우스는 CO2와 자궁 경부 탈구의 과다 복용으로 안락사되었습니다. 이 마우스는 CD1/C57Bl6 하이브리드 배경에 있는 4주 된 야생 형 마우스입니다. 이 마우스는 원래 구입 한 쥐에서 오타와 대학의 동물 시설에서 사육되었다.
- 엉덩이 의 수준에서 피부를 통해 초기 절개를하고 마우스 주위에 모든 방법을 피부를 잘라.
- 껍질을 벗기고 앞다리 수준에 도달할 때까지 위쪽으로 당깁니다.
- 엉덩이의 수준에서 복부 근육을 잘라 척추 기둥에 도달 할 때까지 절개를 계속합니다.
- 이 시점에서, 당신이 상반신에 도달 할 때까지 근육과 갈비뼈를 통해 위쪽으로 잘라 시작합니다.
- 다른 쪽의 척추 기둥에 도달할 때까지 똑바로 잘라냅니다.
- 당신이 시작한 지점에 도달 할 때까지 아래쪽으로 잘라.
- 아래에서 다이어프램을 방출 (TVA 근육을 손상시키지 않도록주의) 0.2mm 해부 핀과 실가드 코팅 해부 접시에 인산 완충 식염수 (PBS)에 배치합니다.
- 갈비뼈와 관련 근육을 접시에 고정, 표면적인 측면 위로, 근육이 완전히 뻗어 있는지 확인.
- 1x PBS를 붓고 4% PFA로 교체하십시오.
- 15분 동안 실온에서 흔들기 플랫폼을 덮고 그대로 둡니다.
- 실온에서 1x PBS로 3배 를 10분 동안 세척합니다.
※ 이 시점에서 고정 된 근육은 후속 해부 전에 하룻밤 냉장고에 남아있을 수 있습니다.
2. TVA 근육의 격리
- TVA 근육의 격리를 진행하려면, 해부 현미경에서, 마지막 몇 갈비뼈의 수준에서 외부 경사 근육을 절단하여 시작합니다 (참조 그림 1 에 대한 부가 가이드).
- 당신이 내부 경사 근육의 시작에 도달 할 때까지 라인타 알바 (아래 TVA를 잘라하지 않도록주의) 옆에 똑바로 잘라.
- 그런 다음 아래 TVA의 상부에서 지나치게 직사각형 복부 및 외부 경사 근육을 해제하기 위해 가로 질러 잘라.
- TVA 근육에서 혈관과 과대 한 지방을 제거 합니다.
- 오버리 마지막 갈비뼈에서 근육을 풀어 놓습니다.
- 근육의 여백 주위를 잘라 PBS를 포함하는 24 웰 플레이트로 제거합니다.
3. TVA 근육의 면역 형광 라벨링 및 현미경 검사
모든 후속 단계의 경우 미세 한 기울어진 파이펫을 사용하여 액체를 제거하고 접시를 흔들 플랫폼에 둡니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 후속 단계는 실온에서 수행됩니다.
- PBS에서 1:1,000개의 형광 태그가 부착된 분가로톡신을 30분 동안 포함하는 인큐베이션을 사용하여 NMJ에 라벨을 부착합니다. 이것은 어두운 방이나 호일 아래에서 수행 할 수 있습니다.
- PBS에서 트리톤 X-100의 2% 트리톤 X-100의 우물당 300 μl을 추가하여 근육을 페메아빌화하고 30분 동안 흔들리는 플랫폼에 남깁니다.
- 30 분 동안 차단 시약 (4 % BSA, PBS의 1 % 트리톤)에서 배양하십시오.
- 1 차적인 항체를 포함하는 시약을 차단하는 배양 (신경 필라멘트 1:100; 시냅스 소포 단백질 2, 1:250) 4 °C 하룻밤.
- PBS 1x에서 3배 세척합니다.
- PBS에서 2-4 시간 동안 1:250 이차 항체를 함유하는 인큐베이트.
- PBS 1x에서 3배 세척합니다.
- 충분한 형광 장착 매체와 커버 슬립을 사용하여 유리 슬라이드에 근육을 마운트합니다.
- 슬라이드는 표준 피형성 현미경에서 이중 대역 패스 필터를 사용하여 가장 잘 볼 수 있습니다.
- NMJ는 적어도 40배 목표를 갖춘 공초점 현미경에서 z 시리즈 프로젝션을 사용하여 가장 잘 이미지됩니다.
Representative Results
위의 프로토콜은 NMJ 분석을 위한 TVA 근육의 격리 및 염색을 지시합니다. 이를 통해 NMJ 형태학의 고해상도 분석뿐만 아니라 근육 내변패턴의 전산해석(도 2)을허용한다. 이러한 기술은 SMA4,17(도3)과같은 운동 신경 질환의 마우스 모델에서 NMJ 병리학을 성공적으로 공개하도록 적용할 수 있다. SMA의 마우스 모형에서는 병리학에 있는 중요한 근육 가변성이 있습니다, 그러나 TVA 근육은 일관되게 높게 영향을 받습니다. 이는 모터 엔드플레이트의 기질, 전시냅틱 말단 및 말단 발아(그림3)에서신경필라멘트의 축적에 의해 입증된다. 따라서 여기에 제시된 결과는 전술한 기술이 마우스 모델에서 NMJ 병리학의 내부 및 분석에 대한 포괄적인 개요를 제공하는 강력한 방법이 될 수 있음을 보여줍니다.
그림 1. 마우스의 복근 의 개요. (A)이미지는 최근 안락사 된 마우스에서 제거되어 해부 접시 피상측 업(A)에고정 된 부복 근육이 부착 된 흉부 케이지를 보여줍니다. (B) A의 해부는 복부 근육의 대략적인 경계를 표시하기 위하여 주석을 음부되었습니다. 피상복부 근육은 해부의 왼쪽에서 볼 수 있으며 외부 경사(파란색으로 윤곽) 및 직류 복부(빨간색으로 윤곽)를 포함합니다. 해부의 오른쪽에, 피상적 인 근육은 트랜스 대 abdominis 근육의 시각화를 허용 제거되었습니다 (녹색으로 설명) 내부 경사 근육 (노란색으로 설명). 이 프로토콜의 목적은 TVA 근육의 우수한 부분의 해부를 지시하는 것입니다, 여기에 단단한 녹색 삼각형으로 표시. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. TVA 근육의 신경 근육 접합에 대한 전체 마운트 개요. 신경필라멘트(NF; 녹색), 시냅스 소포 단백질 2(SV2; 녹색) 및 분가로톡신(BTX; 빨간색)을 위한 면역형광 염색으로 시각화된 TVA 근육의 예제 NMJ를 보여주는 이미지. 이미지는 전체근육(A)또는 공초점 이미지를 나타내는 형광 현미경으로 전체근육(B)또는개별(C)NMJs. 스케일 바 = 800 μm(A), 70 μm(B), 25 μm(C)을 나타낸다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. SMA의 마우스 모델에서 TVA 근육에 신경 근육 접합 병리. 신경필라멘트(NF; green), 시냅스 소포 단백질 2(SV2; 그린) 및 분가로톡신(BTX; 레드)을 위한 면역형과성 염색으로 시각화된 TVA 근육의 NMJ를 보여주는 공초점 현미경 그래프(Smn 2B/+) 또는 SMA 마우스 모델(Smn 2B/+) 또는 SMA 마우스모델(Smn2B/+)에서확인할 수 있습니다. 일반적인 NMJ 형태는 대조군 마우스에서 관찰될 수 있는 반면, Smn2B/-마우스의 TVA 근육에는 전체 기질(흰색 화살촉), 부분 성 서성(보라색 화살촉) 말단 발아(블루 애로우헤드) 및 사전 시냅스 부종(노란색 화살표촉)의 증거가 있다. 시냅스 이후 의 결판은 또한 분명히 덜 성숙한 표현형을 반영하는 덜 복잡합니다. 배율 막대 = 50 μm. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 비디오에서는 마우스에서 TVA 근육의 해부와 근육 내의 NMJ의 전체 마운트 면역 형광 라벨링에 대한 프로토콜을 자세히 설명했습니다. 우리는 또한 이 근이 SMA의 마우스 모형에 있는 신경 근육 접합 병리를 분석하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여주는 데이터를 제시합니다.
이 기술의 성공은 여러 가지 요인에 의존합니다. 가장 일반적인 문제 중 일부는 아래에 설명되어 있습니다. 첫째: 면역 성화학 염색 불량. 이 프로토콜에 나열된 시약에 대해 다른 시약을 사용하는 가장 일반적인 이유 중 하나가 있을 수 있습니다. 고품질 전자 현미경 등급 PFA는 이 프로토콜에 나열된 항체의 선택과 마찬가지로 좋은 염색을 보장하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 오래된동물(즉,3개월 >)에서는 양질의 염색이 더 어려울 수 있습니다. 이것은 근육을 둘러싼 근막의 증가 두께와 외부 경사와 횡포 복부 사이의 지방 축적의 증가 때문입니다. 면역 형광을 진행하기 전에 지방을 제거하는 것이 중요합니다. 그것은 또한 근육을 덮고 근 막의 일부를 제거 해야 할 수 있습니다., 두껍게 될 수 있는. 근육 섬유에 약간의 손상과 내면 패턴에 장애를 발생하지 않고 근육에서 근막과 지방을 제거하는 것은 때때로 어렵습니다. 그러나 이 기술이 신중하게 수행되는 경우, 좋은 품질의 염색은 적어도 1 세까지 마우스에서 취득 할 수 있습니다. 젊은 마우스(즉,3 개월 미만)에서 근육 섬유의 놀리거나 분리를 수행 할 필요가 없습니다. 둘째: 해부와 염색에 따라 NMJ를 찾기가 어렵습니다. 이것은 종종 해부가 마지막 갈비뼈 아래에 확장되지 않았기 때문입니다. NMJs의 대부분은 마지막 갈비뼈 바로 아래에 위치하고 있으므로 근육의이 부분이 해부에 포함되도록주의를 기울여야합니다. 셋째: TVA 근육에 EO 근육의 준수. 이것은 종종 개인이 내부 경사 (IO) 근육의 수준 이하로 해부를 확장하려고 할 때 불만입니다. IO가 존재하는 TVA 근육의 영역은 어떤 근육을 구별하기 어려울 수 있으므로 분석하기가 더 어렵습니다. 이러한 이유로, 우리는 정기적으로 그냥 TVA 근육의 가장 우수한 부분을 해부. 이 수준에서, EO와 TVA 근육 사이 아무 준수, 따라서이 중요 한 문제가 되지 않아야.
TVA 근육을 사용 하 여 한 가지 중요 한 장애물, 부 동 근육에 비해, 외과 조작 또는 물질의 주입에 대 한 접근성. 실험의 이 모형은 주어진 근육에 있는 NMJ 생리학을 조사하기 위하여 중요할 수 있습니다. TVA는 확실히 덜 쉽게 티비알리스 전방 또는 위장혈증과같은 일반적으로 사용되는 근육보다 접근이 덜 하지만, 이전 작품은 늑간 신경의 외과 적 부상으로 TVA를 데너베이트 할 수 있음을 보여 주었다18. 우리는 최근에 또한 일반적인 마취제 (미공개 데이터)에 따라 물질의 지방 관리를 위해이 근육을 사용했습니다. 이러한 실험은 온건한 기술적 도전을 나타낼 수 있더라도, 이 작품은 그(것)들이 실현 가능하다는 것을 보여주고 따라서 병리학및 생리적인 조작에서 NMJ의 분석을 위한 이 근육의 유용성을 확장합니다.
TVA 근육은 내부 변기 패턴의 전체 마운트 분석에 사용할 수있는 몸 전체에 위치한 얇은 평평한 근육의 숫자 중 하나입니다. 그밖 근육은 뇌줄기의 안면 핵에서 유래한 운동 신경에 의해 안쪽으로 부적절근육의 단을 포함하고, 레바토르 오리스 롱우스, 그리고 aurior auris longus,이전에 설명된 해부14,19를포함한다. 또한 EO, IO, 직류 아보미니등 TVA 근육을 둘러싼 근육도 NMJ 분석에 표시되고 사용될 수 있다. 마우스 모형에 있는 NMJ 병리학의 포괄적인 분석을 위해, 바디를 통해 위치한 근육의 수를 고려하고 단 하나 근육으로 분석을 제한하지 않는 것이 중요합니다. 이것은 다른근육(20)사이의 NMJ 병리학 수준에서 중요한 이질성이 있는 운동 신경 질환의 마우스 모델에서 예시된다. 이러한 근육 간 가변성은 운동 신경 취약성의 메커니즘을 조사할 때 매우 귀중한 도구이므로 단일 근육으로 분석을 제한하면 연구의 잠재력을 크게 감소시킬 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 캐나다 보건 연구소 (교부금 MOP 38040)에서 R.K.에 대한 보조금, R.K.에 대한 근이영양증 협회 (미국), R.K.와 L.M.M SMA 가족, T.H.G.에 대한 SMA 신탁 및 T.H.G.에 대한 근육 이영양증 캠페인에 의해 지원되었습니다. L.M.M 캐나다 박사 후 펠로우십의 다발성 경화증 학회의 수혜자이며, R.K.는 오타와 대학에서 대학 건강 연구 위원장의 수령인입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
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