Summary
I denna video visar vi ett protokoll för dissekering av tvärgående bukfångstmuskeln i musen och använda immunofluorescens och mikroskopi för att visualisera neuromuskulära korsningar.
Abstract
Analys av neuromuskulär junction morfologi kan ge viktig inblick i den fysiologiska statusen för en given motor neuron. Analys av tunna platta muskler kan ge betydande fördelar jämfört med traditionellt använda tjockare muskler, såsom de från bakbenet (t.ex. gastrocnemius). Tunna muskler möjliggör omfattande översikt över hela innervationsmönstret för en viss muskel, vilket i sin tur tillåter identifiering av selektivt sårbara pooler av motoriska nervceller. Dessa muskler tillåter också analys av parametrar som motorenhetsstorlek, axonal förgrening och terminal / nodal grodd. Ett vanligt hinder för att använda sådana muskler är att få den tekniska expertisen för att dissekera dem. I den här videon beskriver vi protokollet för dissekering av transversus abdominis (TVA) muskel från unga möss och utför immunofluorescens för att visualisera axoner och neuromuskulära korsningar (NMJs). Vi visar att denna teknik ger en fullständig översikt över innervation mönstret i TVA muskeln och kan användas för att undersöka NMJ patologi i en mus modell av barndomen motor neuron sjukdom, spinal muskel atrofi.
Introduction
Neuromuskulära korsningar (NMJs) är den synaptiska anslutningen mellan en lägre motorisk neuron och en skelettmuskelfiber. De anses traditionellt vara en trepartssynaps, som består av en neuron (presynaptisk terminal), muskelfiber (postsynaptisk terminal) och terminal Schwann cell1. NMJs verkar vara tidiga och betydande mål i patologi i en rad motoriska neuron sjukdomar och mus modeller2,3. Typiska symtom inkluderar denervation, där motor endplate blir utan en presynaptic innervation, svullnad av presynaptic terminalen och en minskning av komplexiteten i NMJ morfologi4-11. Kompensatoriska svar kan också noteras, som inkluderar terminal och nodal grodd, där axonal processer sträcker sig från återstående synaptiska terminaler eller internoder till reinnervated denervated endplates12,13. På grund av det snäva sambandet mellan synaptisk aktivitet och NMJ morfologi, en hel del information kan vinnas om funktionell status för motoriska nervceller från analys av NMJ morfologi. Eftersom förlust av NMJs ofta representerar en av de första aspekterna av neuromuskulär patologi4,10, kvantifiering på nivån för innervation kan ge viktig information om utvecklingen av patologi och den potentiella effekten av en terapeutisk intervention. Dessutom, som NMJ förlust representerar ett betydande steg i patologiska progression, utvecklingen av terapier som kan stabilisera anslutningar och uppmuntra regenerering kan ge betydande nytta.
Vid analys av NMJ morfologi är muskelval av stor betydelse. Några av de primära övervägandena kan inkludera muskelfibertyp, kroppsposition och jämförande analys till mänskliga förhållanden. Dessutom, där manipuleringar som injektion av ämnen eller traumatisk nervskada krävs, är experimentell tillgänglighet också viktig att överväga. I allmänhet är det att föredra att analysera en rad muskler placerade i hela kroppen som återspeglar en rad motorenhetsundertyper. Ofta påverkas dock muskelvalet av enkel dissekering. Följaktligen utförs NMJ-analys ofta uteslutande på stora appendicular muskler såsom gastrocnemius. För att få bra NMJ färgning i sådana muskler krävs ofta sektionering eller mekanisk störning av muskelfibrer. Som ett resultat kan innervationsmönstret störas och en omfattande och högkvalitativ analys av innervationsmönster, grodd och denervation äventyras ofta. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda tunna platta muskler som inte kräver sektionering och kan färgas och monteras intakt, vilket möjliggör en omfattande översikt över hela muskeln. Det finns ett antal muskler som kan användas för en sådan analys, inklusive en grupp hjärnskålen muskler, (omfattar levator auris longus, auricularis överlägsen, och adductor auris longus)14, bröstmuskler (t.ex. trianguläris sterni) 15, och bukmuskler(t.ex. tvärgående abdominis (TVA)). Det största hindret för att använda sådana muskler är den tekniska expertis som krävs för att dissekera dem utan skador.
I den här videon tillhandahåller vi ett protokoll för att dissekera och utföra immunofluorescerande märkning av TVA-muskeln från musen för att möjliggöra en omfattande analys av innervationsmönster och NMJ morfologi. TVA muskeln är en övervägande långsam ryck muskel som består av det djupaste lagret av buken muskulatur och är innervated av de nedre interkostala nerverna. Tidigare arbete har visat att det är genomgående mycket sårbart för patologi i ett antal musmodeller av barndomen motor neuron sjukdom spinal muskelatrofi (SMA) och i andra musmodeller av tidig infälld motor neuron degeneration4,16. Vi föreslår därför att TVA är en användbar muskel för att genomföra NMJ analys i perifera neuropathies.
Protocol
Alla förfaranden bör utföras enligt de djurskyddsstandarder som fastställts av institutionen.
1. Dissekering av bukmuskulaturen från musen
- Innan du börjar, utgör 4% paraformaldehyd (PFA). Varning: Förvara alltid PFA i en rökhuv och använd lämplig skyddsutrustning.
- Avliva musen med en godkänd metod. Anmärkning: Musen som visas i videon avlivades genom överdosering av CO2 och massundersökning förskjutning. Den här musen är en 4 veckor gammal vild mus på en CD1 / C57Bl6 hybridbakgrund. Denna mus föddes i djuranläggningarna vid University of Ottawa från möss som ursprungligen köptes.
- Gör ett första snitt genom huden på höftnivå och skär genom huden hela vägen runt musen.
- Skala av huden och dra uppåt tills du når förbensnivån.
- Skär genom bukmuskulaturen i höftnivå och fortsätt snittet tills du når ryggraden.
- Börja vid denna tidpunkt skära uppåt genom muskulaturen och revbenen tills du når övre delen.
- Skär rakt över tills du når kotkolonnen på andra sidan.
- Skär nedåt tills du når den punkt där du började.
- Släpp membranet underifrån (var försiktig så att det inte skadar TVA-muskeln) och placera det i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en SYLGARD-belagd dissekeringsform med 0,2 mm dissektionsstift.
- Fäst ut revbenskorgen och tillhörande muskulatur i skålen, ytlig sida upp, se till att muskeln är helt utsträckt.
- Häll av 1x PBS och ersätt med 4% PFA.
- Täck och lämna på en gungplattform vid rumstemperatur i 15 min.
- Tvätta 3x i 1x PBS vid rumstemperatur i 10 min.
* Vid denna tidpunkt kan de fasta musklerna lämnas i ett kylskåp över natten före efterföljande dissekering.
2. Isolering av TVA-muskeln
- För att fortsätta med isolering av TVA-muskeln, under ett dissektionsmikroskop, börja med att skära igenom den yttre sneda muskeln på nivån för de sista revbenen (Se figur 1 för en kommenterad guide).
- Skär rakt ner bredvid linea alba (var noga med att inte skära igenom TVA nedan) tills du når början av den inre snedmuskeln.
- Skär sedan över för att frigöra den överliggande rectus abdominis och yttre sneda musklerna från den övre delen av TVA nedan.
- Ta bort blodkärlet och eventuellt överanvänt fett från TVA-muskeln.
- Släpp muskeln från det överbjälkliga sista revbenet.
- Skär runt muskelmarginalerna och ta bort till en 24-brunnsplatta som innehåller PBS.
3. Immunofluorescerande märkning och mikroskopi av TVA-muskeln
För alla efterföljande steg, ta bort vätska med en finspetsad pipett och lämna plattan på en gungplattform. Om inget annat anges utförs alla efterföljande steg vid rumstemperatur.
- Inkubera i PBS som innehåller 1:1 000 fluorescerande märkt bungarotoxin i 30 minuter för att märka NMJs. Detta kan göras i ett mörkt rum eller under folie.
- Permeabilisera muskler genom att lägga till 300 μl per brunn på 2% Triton X-100 i PBS och lämna på en gungplattform i 30 min.
- Inkubera i blockerande reagens (4% BSA, 1% Triton i PBS) i 30 min.
- Inkubera vid blockering av reagens som innehåller primära antikroppar (neurofilament 1:100; synaptiskt vesikelprotein 2, 1:250) vid 4 °C över natten.
- Tvätta 3x i 1x PBS.
- Inkubera i PBS som innehåller 1:250 sekundär antikropp i 2-4 timmar.
- Tvätta 3x i 1x PBS.
- Montera musklerna på glasrutschbanorna med tillräckligt fluorescerande monteringsmedier och täckslip.
- Bilder visas bäst med hjälp av ett dubbelbandspassfilter på ett vanligt epifluorescerande mikroskop.
- NMJs är bäst avbildade med hjälp av en z-serieprojektion på ett konfokalt mikroskop utrustat med minst ett 40X-mål.
Representative Results
Ovanstående protokoll styr isoleringen och färgningen av TVA-muskeln för NMJ-analys. Detta möjliggör helmonteringsanalys av muskelns innervationsmönster samt högupplöst analys av NMJ-morfologi (figur 2). Denna teknik kan framgångsrikt tillämpas för att avslöja NMJ patologi i mus modeller av motor neuron sjukdom, såsom SMA4,17(Figur 3). I musmodeller av SMA finns betydande intramuskulär variabilitet i patologi, men TVA muskeln påverkas konsekvent högt. Detta framgår av denervation av motoriska ändplattor, ackumulering av neurofilament vid den presynaptiska terminalen och terminalgrodd (figur 3). Resultaten som presenteras här visar således att tekniken som beskrivs ovan kan vara en kraftfull metod för att ge en omfattande översikt över innervation och analys av NMJ patologi i musmodeller.
Figur 1. Översikt över muskulaturen i buken. (A)Bilden visar bröstkorgen med fäst bukmuskulatur, som har tagits bort från en nyligen avlivad mus och fästs ut i en dissekeringsfat ytlig sida upp (A). B)Dissekering i A har kommenterats för att markera bukmusklernas ungefärliga gränser. De ytliga bukmusklerna kan ses på vänster sida av dissekeringen och inkluderar yttre sned (skisserad i blått) och rectus abdominis (skisserad i rött). På höger sida av dissekeringen har de ytliga musklerna tagits bort tillåten visualisering av tvärgående abdominis muskel (skisserad i grönt) och den inre sneda muskeln (skisserad i gult). Syftet med detta protokoll är att styra dissekeringen av den överlägsna delen av TVA-muskeln, som här visas som en solid grön triangel. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Helhet översikt över neuromuskulära korsningar i TVA muskel. Bilder som visar exempel NMJs från TVA muskel visualiseras med immunofluorescerande färgning för neurofilament (NF; grön), synaptiskt vesikelprotein 2 (SV2; grönt) och bungarotoxin (BTX; röd). Bilder är montaged fluorescerande mikrografer som visar hela muskeln (A) eller konfokala bilder som visar grupper (B) eller enskilda (C) NMJs. Skalstång = 800 μm (A), 70 μm (B), 25 μm (C). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Neuromuskulär junction patologi i TVA muskel från en mus modell av SMA. Konfokala mikrografer som visar NMJs från TVA-muskeln visualiserade med immunofluorescerande färgning för neurofilament (NF; grön), synaptiskt vesikelprotein 2 (SV2; grönt) och bungarotoxin (BTX; rött) från antingen kontroll (Smn2B / +) eller SMA-musmodell (Smn2B / -). Observera att medan normal NMJ-morfologi kan observeras hos kontrollmöss, finns det i TVA-muskler från Smn2B/- möss tecken på full denervation (vit pilspets), partiell denervation (lila pilspets) terminal sprouting (blå pilspets) och presynaptisk svullnad (gul pilspets). De postsynaptiska endplatesna är också mindre komplexa återspeglar en uppenbarligen mindre mogen fenotyp. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se större bild.
Discussion
I den här videon har vi detaljerat ett protokoll för dissekering av TVA-muskeln från musen och för hela berget immunofluorescerande märkning av NMJs i muskeln. Vi presenterar också data som visar att denna muskel kan användas för att analysera neuromuskulära korsning patologi i en mus modell av SMA.
Framgång i denna teknik är beroende av ett antal faktorer. Några av de vanligaste problemen beskrivs nedan. För det första: dålig immunohistokemisk färgning. Det kan finnas ett antal skäl till detta, en av de vanligaste är användning av olika reagenser till de som anges i detta protokoll. En högkvalitativ elektronmikroskopi kvalitet PFA är mycket viktigt för att säkerställa god färgning, liksom valet av antikroppar som anges i detta protokoll. Dessutom kan det vara svårare attfå färgning avgod kvalitet hos äldre djur ( dvs. > 3 månader). Detta beror på ökad tjocklek på fascian som omger muskeln och ökningen av fettackumulering mellan den yttre sneda och tranversus abdominis. Det är viktigt att ta bort fettet innan du fortsätter till immunofluorescens. Det kan också vara nödvändigt att ta bort en del av fascian som täcker muskeln, som kan bli förtjockad. Det är ibland svårt att ta bort fascian och fettet från muskeln utan att ådra sig någon skada på muskelfibern och en störning i innervationsmönstret. Men om denna teknik utförs noggrant kan färgning av god kvalitet förvärvas från möss upp till minst 1 års ålder. Hos yngre möss(dvs.yngre än 3 månaders ålder) bör det inte vara nödvändigt att utföra någon retning eller separation av muskelfibrer. För det andra: svårt att hitta NMJs efter dissekering och färgning. Detta beror ofta på att dissekeringen inte har sträckt sig under det sista revbenet. Majoriteten av NMJs ligger precis under det sista revbenet och därför måste man se till att denna del av muskeln ingår i dissekeringen. För det tredje: anslutning av EO-muskeln till TVA-muskeln. Detta är ofta ett klagomål när individer försöker förlänga dissekeringen under nivån av den inre sneda (IO) muskeln. Området i TVA-muskeln där IO också finns är svårare att analysera eftersom det kan vara svårt att skilja vilken muskel som är vilken. Av denna anledning dissekerar vi rutinmässigt den mest överlägsna delen av TVA-muskeln. På denna nivå finns det ingen efterlevnad mellan EO- och TVA-musklerna, och därför bör detta inte vara ett betydande problem.
Ett betydande hinder för att använda TVA muskeln, jämfört med appendicular muskler, är tillgänglighet för antingen kirurgiska manipuleringar eller injektion av ämnen. Dessa typer av experiment kan vara avgörande för att undersöka NMJ-fysiologi i en given muskel. Även om TVA är säkert mindre lättillgänglig än vanligare använda muskler som tibialis främre eller gastrocnemius,har tidigare arbete visat att det är möjligt att denervate TVA genom kirurgisk skada av interkostala nerver18. Vi har nyligen också använt denna muskel för lokal administrering av ämnen under narkos (opublicerade data). Även om dessa experiment kan utgöra en måttlig teknisk utmaning, visar detta arbete att de är genomförbara och därmed utöka nyttan av denna muskel för analys av NMJs under både patologisk och fysiologisk manipulation.
TVA-muskeln är en av ett antal tunna platta muskler som ligger i hela kroppen och som kan användas för helmonteringsanalys av innervationsmönster. Andra muskler inkluderar en grupp hjärnskålen muskler innervated av motoriska nervceller som härrör från ansiktskärnan i hjärnstammen, omfattar levator auris longus, auricularis överlägsen, och adductor auris longus, vars dissekeringar har beskrivits tidigare14,19. Dessutom kan muskulaturen kring TVA-muskeln, inklusive EO, IO och rectus abdominis, också märkas och användas för NMJ-analys. För omfattande analys av NMJ patologi i en mus modell, Det är viktigt att överväga ett antal muskler som ligger i hela kroppen och inte begränsa analysen till en enda muskel. Detta exemplifieras i musmodeller av motoriska neuronsjukdomar där det finns betydande heterogenitet i nivåerna av NMJ patologi mellan olika muskler20. Sådan intermuskulär variabilitet är ett extremt värdefullt verktyg när man undersöker mekanismen för motorisk neuron sårbarhet och därför begränsa analys till en enda muskel kan avsevärt minska forskningens potential.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Canadian Institutes of Health Research (bidragsnummer MOP 38040) till R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) till R.K., Families of SMA till R.K. och L.M.M, The SMA Trust to T.H.G., och The Muscular Dystrophy Campaign till T.H.G.. L.M.M är mottagare av en multipel sklerosförening i Kanada postdoktorala stipendie, och R.K. är mottagare av en universitetshälsoforskningsstol från University of Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
