Summary
I denne videoen demonstrerer vi en protokoll for disseksjon av musens transversus abdominismuskel og bruker immunfluorescens og mikroskopi for å visualisere nevromuskulære veikryss.
Abstract
Analyse av nevromuskulær koblingsmorfologi kan gi viktig innsikt i den fysiologiske statusen til en gitt motorisk nevron. Analyse av tynne flate muskler kan gi betydelig fordel i forhold til tradisjonelt brukte tykkere muskler, for eksempel de fra bakre lem (f.eks. gastrocnemius). Tynne muskler gir mulighet for omfattende oversikt over hele innervasjonsmønsteret for en gitt muskel, som igjen tillater identifisering av selektivt sårbare bassenger av motoriske nevroner. Disse musklene tillater også analyse av parametere som motorenhetsstørrelse, axonal forgrening og terminal / nodal spiring. Et vanlig hinder for å bruke slike muskler er å få den tekniske kompetansen til å dissekere dem. I denne videoen beskriver vi protokollen for dissekering av transversus abdominis (TVA) muskelen fra unge mus og utfører immunfluorescence for å visualisere aksoner og nevromuskulære veikryss (NMJs). Vi viser at denne teknikken gir en fullstendig oversikt over TVA-muskelens innerveringsmønster og kan brukes til å undersøke NMJ-patologi i en musemodell av barndomsmotorisk nevronsykdom, spinal muskelatrofi.
Introduction
Nevromuskulære veikryss (NMJs) er den synaptiske forbindelsen mellom en lavere motorisk nevron og en skjelettmuskulaturfiber. De regnes tradisjonelt som en treparts synapse, bestående av en nevron (presynaptisk terminal), muskelfiber (postsynaptisk terminal) og terminal Schwann celle1. NMJs ser ut til å være tidlige og betydelige mål i patologi i en rekke motoriske nevronsykdommer og musemodeller2,3. Typiske symptomer inkluderer denervasjon, hvor motorens endeplate blir blottet for en presynaptisk innervering, hevelse i presynaptisk terminal og en reduksjon i kompleksiteten til NMJ-morfologien4-11. Kompenserende svar kan også bemerkes, som inkluderer terminal og nodal spiring, hvor axonal prosesser strekker seg fra gjenværende synaptiske terminaler eller internoder til reinnervated denervated endeplater12,13. På grunn av den tette sammenhengen mellom synaptisk aktivitet og NMJ-morfologi, kan man få mye informasjon om motoriske nevroners funksjonelle status fra analyse av NMJ morfologi. Som tap av NMJs representerer ofte et av de første aspektene ved nevromuskulær patologi4,10, kvantifisering på nivået av innervering kan gi viktig informasjon om progresjonen av patologi og den potensielle effekten av en terapeutisk inngrep. Videre, ettersom NMJ-tap representerer et betydelig skritt i patologisk progresjon, kan utviklingen av terapeutiske stoffer som kan stabilisere forbindelser og oppmuntre til regenerering gi betydelig fordel.
Når du analyserer NMJ morfologi, er muskelvalg av stor betydning. Noen av de viktigste hensynene kan omfatte muskelfibertype, kroppsposisjon og komparativ analyse av menneskelige forhold. I tillegg, hvor manipulasjoner som injeksjon av stoffer eller traumatisk nerveskade er nødvendig, er eksperimentell tilgjengelighet også viktig å vurdere. Generelt er det å foretrekke å analysere en rekke muskler plassert i hele kroppen som reflekterer en rekke motorenhetsundertyper. Ofte påvirkes imidlertid muskelvalget av enkel disseksjon. Følgelig utføres NMJ-analyse ofte utelukkende på store appendicular muskler som gastrocnemius. For å oppnå god NMJ-farging i slike muskler, er det ofte nødvendig med seksjonering eller mekanisk forstyrrelse av muskelfibre. Som et resultat kan innervasjonsmønsteret bli forstyrret, og en omfattende og høy kvalitet analyse av innervasjonsmønstre, spiring og denervasjon blir ofte kompromittert. En alternativ tilnærming er å bruke tynne flate muskler som ikke krever seksjonering og kan farges og monteres intakt, slik at en omfattende oversikt over hele innervering av muskelen. Det finnes en rekke muskler som kan brukes til en slik analyse, inkludert en gruppe kranialmuskler, (som omfatter levator auris longus, auricularis superior, og adductor auris longus)14, thoracic muskler (f.eks. triangularis sterni) 15og magemuskler(f.eks. transversus abdominis (TVA)). Den største hindringen for å bruke slike muskler er den tekniske kompetansen som kreves for å dissekere dem uten skade.
I denne videoen gir vi en protokoll for å dissekere og utføre immunfluorescerende merking av TVA-muskelen fra musen for å tillate en omfattende analyse av innervasjonsmønster og NMJ-morfologi. TVA-muskelen er en overveiende langsom rykningsmuskel som består av det dypeste laget av abdominal muskulatur og er innervert av de nedre intercostal nervene. Tidligere arbeid har vist at det er konsekvent svært sårbart for patologi i en rekke musemodeller av barndommen motorisk nevronsykdom spinal muskelatrofi (SMA) og i andre musemodeller av tidlig startmotor neuron degenerasjon4,16. Vi foreslår derfor at TVA er en nyttig muskel for å gjennomføre NMJ-analyse i perifere nevropatier.
Protocol
Alle prosedyrer bør utføres i samsvar med dyrepleiestandardene som er fastsatt av institusjonen.
1. Disseksjon av abdominal muskulatur fra musen
- Før du starter, utgjør 4% paraformaldehyd (PFA). Forsiktig: Hold alltid PFA i en avtrekkshette og bruk egnet verneutstyr.
- Euthanize mus med en godkjent metode. Merk: Musen vist i videoen ble euthanized ved overdosering av CO2 og Cervical dislokasjon. Denne musen er en fire uker gammel mus av vill type på en CD1/C57Bl6 hybrid bakgrunn. Denne musen ble oppdrettet i dyrefasilitetene ved Universitetet i Ottawa fra mus som opprinnelig ble kjøpt.
- Lag et innledende snitt gjennom huden på hoftenivået og kutt gjennom huden hele veien rundt musen.
- Skrell av huden, trekk oppover til du når nivået på forbenet.
- Skjær gjennom bukmuskulaturen på hoftenivået og fortsett snittet til du kommer til vertebrale kolonnen.
- På dette tidspunktet begynner du å kutte oppover gjennom muskulaturen og ribbenene til du kommer til øvre lem.
- Klipp rett over til du kommer til vertebrale kolonnen på den andre siden.
- Klipp nedover til du kommer til punktet der du startet.
- Slipp membranen fra undersiden (pass på at du ikke skader TVA-muskelen) og legg den i fosfatbufret saltvann (PBS) i en SYLGARD-belagt disseksjonsfat med 0,2 mm disseksjonspinner.
- Fest ribbeburet og tilhørende muskulatur i parabolen, overfladisk side opp, og sørg for at muskelen er helt strukket ut.
- Hell av 1x PBS og erstatt med 4% PFA.
- Dekk og la på en gyngeplattform ved romtemperatur i 15 min.
- Vask 3x i 1x PBS ved romtemperatur i 10 min.
* På dette tidspunktet kan de faste musklene stå i kjøleskap over natten før etterfølgende disseksjon.
2. Isolering av TVA-muskelen
- For å fortsette med isolering av TVA-muskelen, under et disseksjonsmikroskop, begynn med å skjære gjennom den ytre skråmuskelen på nivået av de siste ribbeina (se figur 1 for en kommentert guide).
- Klipp rett ned ved siden av linea alba (pass på at du ikke skjærer gjennom TVA nedenfor) til du kommer til starten av den indre skrå muskelen.
- Klipp deretter over for å frigjøre den overliggende rectus abdominis og eksterne skrå muskler fra den øvre delen av TVA nedenfor.
- Fjern blodkaret og eventuelt overndekkende fett fra TVA-muskelen.
- Slipp muskelen fra den overlysende siste ribben.
- Klipp rundt muskelens marginer og fjern til en 24-brønns plate som inneholder PBS.
3. Immunfluorescent merking og mikroskopi av TVA Muskelen
For alle etterfølgende trinn, fjern væske ved hjelp av en fin tippet pipette og la platen stå på en gyngeplattform. Med mindre annet er oppgitt, utføres alle påfølgende trinn ved romtemperatur.
- Inkuber i PBS som inneholder 1:1,000 fluorescerende merket bungarotoxin i 30 min for å merke NMJs. Dette kan gjøres i et mørkt rom eller under folie.
- Permeabilize muskel ved å legge 300 μl per brønn på 2% Triton X-100 i PBS og la på en gyngeplattform i 30 min.
- Inkuber i blokkering av reagens (4% BSA, 1% Triton i PBS) i 30 min.
- Inkubere i å blokkere reagens som inneholder primære antistoffer (nevrofilament 1:100; synaptisk vesicleprotein 2, 1:250) ved 4 °C over natten.
- Vask 3x i 1x PBS.
- Inkuber i PBS som inneholder 1:250 sekundært antistoff i 2-4 timer.
- Vask 3x i 1x PBS.
- Monter musklene på glasssklier ved hjelp av tilstrekkelig fluorescerende monteringsmedier og deksler.
- Lysbilder vises best ved hjelp av et dobbeltbåndspassfilter på et standard epifluorescent mikroskop.
- NMJs er best avbildet ved hjelp av en z-serie projeksjon på et konfokalt mikroskop utstyrt med minst 40X mål.
Representative Results
Ovennevnte protokoll styrer isolering og farging av TVA-muskelen for NMJ-analyse. Dette tillater helmontert analyse av muskelinnvandringsmønstre samt høyoppløselig analyse av NMJ-morfologi (figur 2). Denne teknikken kan brukes med hell for å avsløre NMJ-patologi i musemodeller av motorisk nevronsykdom, for eksempel SMA4,17(figur 3). I musemodeller av SMA er det betydelig intramuskulær variasjon i patologi, men TVA-muskelen er konsekvent sterkt påvirket. Dette fremgår av denervasjon av motorendeplater, akkumulering av nevrofilamenter ved presynaptisk terminal og terminalspiring (figur 3). Resultatene som presenteres her viser dermed at teknikken beskrevet ovenfor kan være en kraftig metode for å gi en omfattende oversikt over innervasjon og analyse av NMJ-patologi i musemodeller.
Figur 1. Oversikt over abdominal muskulatur av musen. (A) Bildet viser thoracic buret med festet abdominal muskulatur, som har blitt fjernet fra en nylig euthanized mus og festet ut i en disseksjon parabolen overfladisk side opp (A). (B) Disseksjon i A har blitt kommentert for å markere de omtrentlige grensene til magemusklene. De overfladiske magemusklene kan ses på venstre side av disseksjonen, og inkluderer ekstern skrå (skissert i blått) og rectus abdominis (skissert i rødt). På høyre side av disseksjonen har de overfladiske musklene blitt fjernet tillatt visualisering av transversus abdominis muskelen (skissert i grønt) og den indre skrå muskelen (skissert i gult). Målet med denne protokollen er å lede disseksjonen av den overlegne delen av TVA-muskelen, vist her som en solid grønn trekant. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Helmontert oversikt over nevromuskulære veikryss i TVA-muskel. Bilder som viser eksempel NMJs fra TVA muskel visualisert med immunfluorescent farging for neurofilament (NF; grønn), synaptisk vesicle protein 2 (SV2; grønn) og bungarotoxin (BTX; rød). Bilder er monterte fluorescerende mikrografer som viser hele muskelen (A) eller konfokale bilder som viser grupper (B) eller individuelle (C) NMJs. Skala bar = 800 μm (A), 70 μm (B), 25 μm (C). Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Nevromuskulær krysspatologi i TVA-muskel fra en musemodell av SMA. Konfokale mikrografer som viser NMJs fra TVA-muskelen visualisert med immunfluorescerende farging for nevrofilament (NF; grønn), synaptisk vesicleprotein 2 (SV2; grønn) og bungarotoxin (BTX; rød) fra enten kontroll (Smn2B/+) eller SMA-musemodell (Smn2B/-). Merk at mens normal NMJ morfologi kan observeres i kontrollmus, i TVA muskler fra Smn2B /- mus er det tegn på full denervasjon (hvit pilspiss), delvis denervasjon (lilla pilspiss) terminal spiring (blå pilspiss) og presynaptisk hevelse (gul pilspiss). De postsynaptiske endeplatene er også mindre komplekse, noe som reflekterer en tilsynelatende mindre moden fenotype. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å vise større bilde.
Discussion
I denne videoen har vi detaljert en protokoll for disseksjonen av TVA-muskelen fra musen og for helmontert immunfluorescerende merking av NMJs i muskelen. Vi presenterer også data som viser at denne muskelen kan brukes til å analysere nevromuskulær koblingspatologi i en musemodell av SMA.
Suksess i denne teknikken er avhengig av en rekke faktorer. Noen av de vanligste problemene er skissert nedenfor. For det første: dårlig immunhiistokjemisk farging. Det kan være en rekke årsaker til dette, en av de vanligste er bruk av forskjellige reagenser til de som er oppført i denne protokollen. En høykvalitets elektronmikroskopi klasse PFA er svært viktig for å sikre god farging, som er valget av antistoffer oppført i denne protokollen. I tillegg, hos eldre dyr (dvs.> 3 måneder), kan det være vanskeligere å få farging av god kvalitet. Dette er på grunn av økt tykkelse på fascia rundt muskelen og økningen i fettakkumulering mellom ytre skrå og tranversus abdominis. Det er viktig å fjerne fettet, før du fortsetter til immunfluorescens. Det kan også være nødvendig å fjerne noe av fascia som dekker muskelen, som kan bli tykkere. Det er noen ganger vanskelig å fjerne fascia og fett fra muskelen uten å pådra seg noen skade på muskelfiberen og en forstyrrelse av innervasjonsmønsteret. Men hvis denne teknikken utføres nøye, kan farging av god kvalitet anskaffes fra mus opp til minst 1 år. Hos yngre mus (dvs.mindre enn 3 måneder) bør det ikke være nødvendig å utføre erting eller separasjon av muskelfibre. For det andre: vanskelig å finne NMJs etter disseksjon og farging. Dette skyldes ofte at disseksjonen ikke har strakte seg under den siste ribben. De fleste NMJs ligger like under den siste ribben og derfor må det tas hensyn til at denne delen av muskelen er inkludert i disseksjonen. For det tredje: Overholdelse av EO-muskelen til TVA-muskelen. Dette er ofte en klage når enkeltpersoner forsøker å forlenge disseksjonen under nivået av den indre skrå (IO) muskelen. Området av TVA muskelen der IO er også til stede er vanskeligere å analysere som det kan være vanskelig å skille hvilken muskel er hvilken. Av denne grunn dissekerer vi rutinemessig bare den mest overlegne delen av TVA-muskelen. På dette nivået er det ingen overholdelse mellom EO- og TVA-musklene, og derfor bør dette ikke være et betydelig problem.
En betydelig hindring for å bruke TVA-muskelen, sammenlignet med appendicular muskler, er tilgjengelighet for enten kirurgiske manipulasjoner eller injeksjon av stoffer. Denne typen eksperimenter kan være avgjørende for å undersøke NMJ fysiologi i en gitt muskel. Selv om TVA absolutt er mindre lett tilgjengelig enn mer brukte muskler som tibialis fremre eller gastrocnemius, tidligere arbeid har vist at det er mulig å denervate TVA ved kirurgisk skade på intercostal nerver18. Vi har nylig også brukt denne muskelen for lokal administrering av stoffer under generell bedøvelse (upubliserte data). Selv om disse eksperimentene kan representere en moderat teknisk utfordring, viser dette arbeidet at de er gjennomførbare og dermed utvider nytten av denne muskelen for analyse av NMJs under både patologisk og fysiologisk manipulasjon.
TVA-muskelen er en av en rekke tynne flate muskler som ligger i hele kroppen som kan brukes til helmontert analyse av innervasjonsmønstre. Andre muskler inkluderer en gruppe kraniale muskler innervated av motoriske nevroner som stammer fra ansiktskjernen i hjernestammen, som omfatter levator auris longus, auricularis superior, og adductor auris longus, disseksjonene som har blitt beskrevet tidligere14,19. Videre kan muskulaturen rundt TVA-muskelen, inkludert EO, IO og rectus abdominis, også merkes og brukes til NMJ-analyse. For omfattende analyse av NMJ-patologi i en musemodell, er det viktig å vurdere en rekke muskler som ligger i hele kroppen og ikke å begrense analysen til en enkelt muskel. Dette er eksemplifisert i musemodeller av motoriske nevronsykdommer der det er betydelig heterogenitet i nivåer av NMJ-patologi mellom forskjellige muskler20. Slike intermuskulære variasjoner er et ekstremt verdifullt verktøy når man undersøker mekanismen for motorisk nevronsårbarhet, og derfor kan begrensning av analyse til en enkelt muskel redusere potensialet i forskningen betydelig.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Canadian Institutes of Health Research (tilskuddsnummer MOP 38040) til R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) til R.K., Families of SMA til R.K. og L.M.M, SMA Trust til T.H.G., og The Muscular Dystrophy Campaign til T.H.G.. L.M.M er mottaker av Multiple Sclerosis Society of Canada Postdoctoral Fellowship, og R.K. er mottaker av en universitetshelseforskningsleder fra Universitetet i Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
