Summary
Dans ce vidéo nous démontrons un protocole pour la dissection du muscle d’abdominis de transversus de la souris et employons l’immunofluorescence et la microscopie pour visualiser les jonctions neuromusculaires.
Abstract
L’analyse de la morphologie de jonction neuromusculaire peut donner un aperçu important de l’état physiologique d’un motoneurone donné. L’analyse des muscles plats minces peut offrir un avantage significatif par rapport aux muscles plus épais traditionnellement utilisés, tels que ceux du membre postérieur (par exemple. gastrocnémien ). Les muscles minces permettent une vue d’ensemble complète de l’ensemble du modèle d’innervation pour un muscle donné, qui à son tour permet l’identification des piscines sélectivement vulnérables des motoneurones. Ces muscles permettent également l’analyse de paramètres tels que la taille de l’unité motrice, la ramification axonale et la germination terminale / nodale. Un obstacle commun dans l’utilisation de tels muscles est d’acquérir l’expertise technique pour les disséquer. Dans cette vidéo, nous détaillons le protocole de dissection du muscle transversus abdominis (TVA) des jeunes souris et d’immunofluorescence pour visualiser les axones et les jonctions neuromusculaires (NMJ). Nous démontrons que cette technique donne une vue d’ensemble complète du modèle d’innervation du muscle de TVA et peut être employée pour étudier la pathologie de NMJ dans un modèle murin de la maladie de neurone moteur d’enfance, atrophie musculaire spinale.
Introduction
Les jonctions neuromusculaires (NMJs) sont la connexion synaptique entre un motoneurone inférieur et une fibre musculaire squelettique. Ils sont traditionnellement considérés comme une synapse tripartite, composée d’un neurone (terminal présynaptique), d’une fibre musculaire (terminal post-synaptique) et d’une cellule terminale de Schwann1. Les NMJ semblent être des cibles précoces et significatives en pathologie dans une gamme de maladies des motoneurones et de modèles murins2,3. Les symptômes typiques comprennent la dénervation, où la plaque d’extrémité du moteur devient dépourvue d’une innervation présynaptique, un gonflement du terminal présynaptique et une réduction de la complexité de la morphologie NMJ4-11. Des réponses compensatoires peuvent également être notées, qui incluent la germination terminale et nodale, où les processus axonaux s’étendent des bornes synaptiques restantes ou des entre-nœuds aux plaques d’extrémité énervées réinnervées12,13. En raison de la corrélation étroite entre l’activité synaptique et la morphologie de NMJ, beaucoup d’informations peuvent être gagnées au sujet du statut fonctionnel des neurones moteurs de l’analyse de la morphologie de NMJ. Comme la perte de NMJs représente fréquemment l’un des premiers aspects de la pathologie neuromusculaire4,10,la quantification au niveau de l’innervation peut donner des informations importantes sur la progression de la pathologie et l’effet potentiel d’une intervention thérapeutique. En outre, car la perte de NMJ représente une étape significative dans la progression pathologique, le développement des thérapeutiques qui peuvent stabiliser des connexions et encourager la régénération peut produire l’avantage significatif.
Lors de l’analyse de la morphologie NMJ, le choix musculaire est d’une grande importance. Certaines des considérations primaires pourraient inclure le type de fibre musculaire, position du corps, et l’analyse comparative aux conditions humaines. En outre, lorsque des manipulations telles que l’injection de substances ou des lésions nerveuses traumatiques sont nécessaires, l’accessibilité expérimentale est également importante à considérer. En général, il est préférable d’analyser une gamme de muscles positionnés dans tout le corps reflétant une gamme de sous-types d’unités motrices. Souvent, cependant, le choix de muscle est influencé par la facilité de la dissection. Par conséquent, l’analyse NMJ est souvent effectuée exclusivement sur de gros muscles appendiculaires tels que gastrocnémien. Pour obtenir une bonne coloration NMJ dans ces muscles, une sectionnement ou une perturbation mécanique des fibres musculaires est souvent nécessaire. En conséquence, le modèle d’innervation peut devenir perturbé et une analyse complète et de haute qualité des modèles d’innervation, de germination et d’énervation est souvent compromise. Une autre approche consiste à utiliser des muscles plats minces qui ne nécessitent pas de sectionnement et peuvent être colorés et montés intacts, permettant une vue d’ensemble complète de l’innervation complète du muscle. Il existe un certain nombre de muscles qui peuvent être utilisés pour une telle analyse, y compris un groupe de muscles crâniens, (englobant levator auris longus, auricularis superior, et adducteur auris longus)14, les muscles thoraciques (par exemple. triangularis sterni) 15, et les muscles abdominaux(p. ex. transversus abdominis (TVA)). Le principal obstacle à l’utilisation de tels muscles est l’expertise technique requise pour les disséquer sans dommage.
Dans cette vidéo, nous fournissons un protocole pour disséquer et effectuer un étiquetage immunofluorescent du muscle TVA de la souris pour permettre une analyse complète du modèle d’innervation et de la morphologie NMJ. Le muscle TVA est un muscle à contraction principalement lente comprenant la couche la plus profonde de la musculature abdominale et est innervé par les nerfs intercostaux inférieurs. Des travaux antérieurs ont montré qu’il était constamment très vulnérable à la pathologie dans un certain nombre de modèles murins de l’amyotrophie spinale (AMS) de la maladie des motoneurones infantile et dans d’autres modèles murins de dégénérescence précoce des motoneurones4,16. Nous proposons donc que le TVA soit un muscle utile pour entreprendre l’analyse de NMJ dans des neuropathies périphériques.
Protocol
Toutes les procédures doivent être effectuées selon les normes de soins aux animaux établies par l’établissement.
1. Dissection de la musculature abdominale de la souris
- Avant de commencer, constituer 4 % de paraformaldéhyde (PFA). Attention : Gardez toujours le PFA dans une hotte et portez l’équipement de protection approprié.
- Euthanasier la souris par une méthode approuvée. Remarque : La souris montrée dans la vidéo a été euthanasiée par surdosage de CO2 et luxation cervicale. Cette souris est une souris de type sauvage de 4 semaines sur un fond hybride CD1/C57Bl6. Cette souris a été élevée dans les installations pour animaux de l’Université d’Ottawa à partir de souris achetées à l’origine.
- Faites une incision initiale à travers la peau au niveau de la hanche et coupez à travers la peau tout autour de la souris.
- Décollez la peau, en tirant vers le haut jusqu’à ce que vous atteigniez le niveau des membres antérieurs.
- Coupez la musculature abdominale au niveau de la hanche et continuez l’incision jusqu’à ce que vous atteigniez la colonne vertébrale.
- À ce stade, commencez à couper vers le haut à travers la musculature et les côtes jusqu’à ce que vous atteigniez le membre supérieur.
- Coupez directement jusqu’à ce que vous atteigniez la colonne vertébrale de l’autre côté.
- Coupez vers le bas jusqu’à ce que vous atteigniez le point où vous avez commencé.
- Relâchez le diaphragme par le dessous (en prenant soin de ne pas endommager le muscle TVA) et placez-le dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de dissection recouverte de SYLGARD avec des broches de dissection de 0,2 mm.
- Épinglez la cage thoracique et la musculature associée dans le plat, côté superficiel vers le haut, en vous assurant que le muscle est complètement étiré.
- Versez le PBS 1x et remplacez-le par 4% PFA.
- Couvrir et laisser sur une plate-forme à bascule à température ambiante pendant 15 min.
- Laver 3x en 1x PBS à température ambiante pendant 10 min.
* À ce stade, les muscles fixes peuvent être laissés dans un réfrigérateur pendant la nuit avant la dissection ultérieure.
2. Isolement du muscle TVA
- Pour procéder à l’isolement du muscle TVA, sous un microscope de dissection, commencez par couper à travers le muscle oblique externe au niveau des dernières côtes (voir la figure 1 pour un guide annoté).
- Coupez tout droit à côté de la linea alba (en prenant soin de ne pas couper à travers la TVA ci-dessous) jusqu’à ce que vous atteigniez le début du muscle oblique interne.
- Ensuite, coupez à travers pour libérer les abdominis rectus en cours et les muscles obliques externes de la partie supérieure de la TVA ci-dessous.
- Retirez le vaisseau sanguin et toute graisse qui en est trop du muscle TVA.
- Relâchez le muscle de la dernière côte terrestre.
- Couper autour des marges du muscle et retirer à une plaque de 24 puits contenant pbs.
3. Étiquetage immunofluorescent et microscopie du muscle TVA
Pour toutes les étapes suivantes, retirez le liquide à l’aide d’une pipette à pointe fine et laissez la plaque sur une plate-forme à bascule. Sauf indication contraire, toutes les étapes suivantes sont effectuées à température ambiante.
- Incuber dans du PBS contenant 1:1 000 bungarotoxine marquée par fluorescence pendant 30 min pour étiqueter les NMJ. Cela peut être fait dans une pièce sombre ou sous papier d’aluminium.
- Perméabiliser le muscle en ajoutant 300 μl par puits de Triton X-100 à 2% dans du PBS et laisser sur une plate-forme à bascule pendant 30 min.
- Incuber dans le réactif de blocage (4% BSA, 1% Triton dans PBS) pendant 30 min.
- Incuber dans un réactif bloquant contenant des anticorps primaires (neurofilament 1:100; protéine de vésicule synaptique 2, 1:250) à 4 °C pendant la nuit.
- Laver 3x dans 1x PBS.
- Incuber dans pbs contenant 1:250 anticorps secondaire pendant 2-4 heures.
- Laver 3x dans 1x PBS.
- Montez les muscles sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage fluorescent et d’une lame de couverture suffisants.
- Il est préférable de visualiser les lames à l’aide d’un filtre passe-bande double sur un microscope épifluorescent standard.
- Les NMJ sont mieux entrés à l’aide d’une projection en série z sur un microscope confocal équipé d’au moins un objectif 40X.
Representative Results
Le protocole ci-dessus dirige l’isolement et la coloration du muscle TVA pour l’analyse NMJ. Cela permet une analyse à montage entier des modèles d’innervation musculaire ainsi qu’une analyse à haute résolution de la morphologie NMJ (Figure 2). Cette technique peut être appliquée avec succès pour révéler la pathologie NMJ dans des modèles murins de maladie des motoneurones, tels que SMA4,17(Figure 3). Dans les modèles murins de SMA il y a une variabilité intramusculaire significative dans la pathologie, cependant le muscle TVA est constamment fortement affecté. Ceci est démontré par la dénervation des plaques d’extrémité du moteur, l’accumulation de neurofilaments au terminal présynaptique et la germination terminale (Figure 3). Les résultats présentés ici démontrent ainsi que la technique décrite ci-dessus peut être une méthode puissante pour fournir une vue d’ensemble complète de l’innervation et de l’analyse de la pathologie NMJ dans des modèles murins.
Figure 1. Vue d’ensemble de la musculature abdominale de la souris. (A) L’image montre la cage thoracique avec une musculature abdominale attachée, qui a été retirée d’une souris récemment euthanasiée et épinglée dans un plat de dissection côté superficiel vers le haut (A). (B) La dissection dans A a été annotée pour marquer les limites approximatives des muscles abdominaux. Les muscles abdominaux superficiels peuvent être vus sur le côté gauche de la dissection, et comprennent oblique externe (souligné en bleu) et rectus abdominis (décrit en rouge). Sur le côté droit de la dissection, les muscles superficiels ont été enlevés, ce qui a permis la visualisation du muscle transversus abdominis (décrit en vert) et du muscle oblique interne (délimité en jaune). Le but de ce protocole est de diriger la dissection de la partie supérieure du muscle TVA, montrée ici comme un triangle vert uni. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 2. Vue d’ensemble de tout-montage des jonctions neuromusculaires dans le muscle de TVA. Images montrant des exemples de NMJs du muscle TVA visualisés avec une coloration immunofluorescente pour le neurofilament (NF; vert), la protéine 2 de la vésicule synaptique (SV2; vert) et la bungarotoxine (BTX; rouge). Les images sont des micrographies fluorescentes montages montrant l’ensemble du muscle(A)ou des images confocales montrant des groupes(B)ou des NMJ individuels(C).Barre d’échelle = 800 μm(A), 70 μm (B), 25 μm (C). Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 3. Pathologie neuromusculaire de jonction dans le muscle de TVA d’un modèle murin de SMA. Micrographies confocales montrant des NMJs du muscle TVA visualisés avec une coloration immunofluorescente pour le neurofilament (NF; vert), la protéine synaptique de la vésicule 2 (SV2; vert) et la bungarotoxine (BTX; rouge) du modèle de souristémoin (Smn2B/+) ou SMA(Smn2B/-). Notez que tandis que la morphologie normale de NMJ peut être observée chez les souris de contrôle, dans les muscles de TVA de Smn2B/- souris il y a des preuves de la dénervation complète (pointe blanche de flèche), de la dénervation partielle (arrowhead violet), de la germination terminale (arrowhead bleu) et du gonflement presynaptique (arrowhead jaune). Les plaques d’extrémité poteau-synaptiques sont également moins complexes reflétant un phénotype apparemment moins mûr. Barre d’échelle = 50 μm. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Discussion
Dans cette vidéo, nous avons détaillé un protocole pour la dissection du muscle TVA de la souris et pour le étiquetage immunofluorescent de montage entier des NMJs dans le muscle. Nous présentons également des données montrant que ce muscle peut être utilisé pour analyser la pathologie de jonction neuromusculaire dans un modèle murin de SMA.
Le succès de cette technique dépend d’un certain nombre de facteurs. Certains des problèmes les plus courants sont décrits ci-dessous. Tout d’abord: mauvaise coloration immunohistochimique. Il peut y avoir un certain nombre de raisons à cela, l’une des plus courantes étant l’utilisation de différents réactifs à ceux énumérés dans ce protocole. Un PFA de qualité de microscopie électronique de haute qualité est très important pour assurer une bonne coloration, de même que le choix des anticorps énumérés dans ce protocole. De plus, chez les animaux plus âgés(c’est-à-dire> 3 mois), il peut être plus difficile d’obtenir une coloration de bonne qualité. Cela est dû à l’augmentation de l’épaisseur du fascia entourant le muscle et à l’augmentation de l’accumulation de graisse entre l’oblique externe et tranversus abdominis. Il est important de dépouiller la graisse, avant de procéder à l’immunofluorescence. Il peut également être nécessaire de retirer une partie du fascia recouvrant le muscle, qui peut s’épaissir. Il est parfois difficile de dépouiller le fascia et la graisse du muscle sans encourir des dommages à la fibre musculaire et une perturbation du modèle d’innervation. Cependant, si cette technique est effectuée avec soin, une coloration de bonne qualité peut être acquise chez des souris jusqu’à l’âge d’au moins 1 an. Chez les souris plus jeunes(c’est-à-diremoins de 3 mois), il ne devrait pas être nécessaire d’effectuer des taquineries ou des séparations de fibres musculaires. Deuxièmement : difficile en trouvant nmjs après dissection et souillure. C’est souvent parce que la dissection ne s’est pas étendue sous la dernière côte. La majorité des NMJs sont situés juste sous la dernière côte et donc des précautions doivent être prises pour s’assurer que cette partie du muscle est incluse dans la dissection. Troisièmement: l’adhérence du muscle OT au muscle TVA. Il s’agit souvent d’une plainte lorsque les individus tentent de prolonger la dissection au-dessous du niveau du muscle oblique interne (IO). La zone du muscle TVA où l’OI est également présente est plus difficile à analyser car il peut être difficile de distinguer quel muscle est lequel. Pour cette raison, nous disséquons régulièrement la partie la plus supérieure du muscle TVA. À ce niveau, il n’y a pas d’adhérence entre les muscles EO et TVA, et donc cela ne devrait pas être un problème important.
Un obstacle important à l’utilisation du muscle TVA, par rapport aux muscles appendiculaires, est l’accessibilité pour les manipulations chirurgicales ou l’injection de substances. Ces types d’expériences peuvent être cruciaux pour étudier la physiologie nmj dans un muscle donné. Bien que la TVA soit certainement moins facilement accessible que les muscles plus couramment utilisés tels que les tibialis antérieurs ou gastrocnémieux,des travaux antérieurs ont montré qu’il est possible de dénerver la TVA par lésion chirurgicale des nerfs intercostaux18. Nous avons récemment également utilisé ce muscle pour l’administration locale de substances sous anesthésie générale (données non publiées). Bien que ces expériences puissent représenter un défi technique modéré, ce travail montre qu’elles sont réalisables et étendent ainsi l’utilité de ce muscle pour l’analyse des NMJs sous manipulation pathologique et physiologique.
Le muscle TVA est l’un des nombreux muscles plats minces situés dans tout le corps qui peuvent être utilisés pour l’analyse de montage entier des modèles d’innervation. D’autres muscles comprennent un groupe de muscles crâniens innervés par des motoneurones provenant du noyau facial du tronc cérébral, englobant le levator auris longus, auricularis superior,et adducteur auris longus,dont les dissections ont été décrites précédemment14,19. En outre, la musculature entourant le muscle TVA, y compris EO, IO, et rectus abdominis, peut également être étiquetée et utilisée pour l’analyse NMJ. Pour une analyse complète de la pathologie NMJ dans un modèle murin, il est important de considérer un certain nombre de muscles situés dans tout le corps et de ne pas restreindre l’analyse à un seul muscle. Ceci est illustré dans les modèles murins de maladies des motoneurones où il y a une hétérogénéité significative dans les niveaux de pathologie NMJ entre différents muscles20. Une telle variabilité intermusculaire est un outil extrêmement précieux lors de l’étude du mécanisme de vulnérabilité des motoneurones et, par conséquent, restreindre l’analyse à un seul muscle pourrait réduire considérablement le potentiel de la recherche.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts de recherche en santé du Canada (numéro de subvention MOP 38040) à R.K., de la Muscular Dystrophy Association (É.-U.) à R.K., de Families of SMA à R.K. et L.M.M, de The SMA Trust à T.H.G. et de The Muscular Dystrophy Campaign à T.H.G.. L.M.M est titulaire d’une bourse postdoctorale de la Société canadienne de la sclérose en plaques et R.K. est titulaire d’une chaire universitaire de recherche en santé de l’Université d’Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
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