Summary
In questo video dimostriamo un protocollo per la dissezione del muscolo transversus abdominis del topo e usiamo l'immunofluorescenza e la microscopia per visualizzare le giunzioni neuromuscolari.
Abstract
L'analisi della morfologia della giunzione neuromuscolare può dare una visione importante dello stato fisiologico di un dato motoneurone. L'analisi dei muscoli sottili piatti può offrire un vantaggio significativo rispetto ai muscoli più spessi tradizionalmente utilizzati, come quelli dell'artoposteriore( ad esempio . gastrocnomio). I muscoli sottili consentono una panoramica completa dell'intero modello di innervazione per un dato muscolo, che a sua volta consente l'identificazione di pool selettivamente vulnerabili di motoneuroni. Questi muscoli consentono anche l'analisi di parametri come le dimensioni dell'unità motoria, la ramificazione assonale e la germinazione terminale / nodale. Un ostacolo comune nell'uso di tali muscoli è ottenere l'esperienza tecnica per sezionarli. In questo video, dettagliamo il protocollo per sezionare il muscolo transversus abdominis (TVA) da giovani topi ed eseguire l'immunofluorescenza per visualizzare assoni e giunzioni neuromuscolari (NMJs). Dimostriamo che questa tecnica fornisce una panoramica completa del modello di innervazione del muscolo TVA e può essere utilizzata per indagare la patologia NMJ in un modello di topo della malattia del motoneurone infantile, atrofia muscolare spinale.
Introduction
Le giunzioni neuromuscolari (NMJs) sono la connessione sinaptica tra un motoneurone inferiore e una fibra muscolare scheletrica. Sono tradizionalmente considerati una sinapsi tripartita, composta da un neurone (terminale presinaptico), fibra muscolare (terminale post sinaptico) e cellula terminale di Schwann1. Gli NMJ sembrano essere obiettivi precoci e significativi in patologia in una serie di malattie dei motoneuroni e modelli ditopi 2,3. I sintomi tipici includono la denervazione, dove la piastra terminale motoria diventa priva di innervazione presnaptica, gonfiore del terminale presnaptico e riduzione della complessità della morfologia NMJ4-11. Si possono anche notare risposte compensative, che includono la germinazione terminale e nodale, in cui i processi assonali si estendono dai terminali sinaptici rimanenti o dagli internodi alle piastre terminali denervatate reinnervate12,13. A causa della stretta correlazione tra l'attività sinaptica e la morfologia nmj, è possibile ottenere una grande quantità di informazioni sullo stato funzionale dei motoneuroni dall'analisi della morfologia NMJ. Poiché la perdita di NMJ rappresenta spesso uno dei primi aspetti della patologia neuromuscolare4,10, la quantificazione a livello di innervazione può fornire informazioni importanti sulla progressione della patologia e sul potenziale effetto di un intervento terapeutico. Inoltre, poiché la perdita di NMJ rappresenta un passo significativo nella progressione patologica, lo sviluppo di terapie in grado di stabilizzare le connessioni e incoraggiare la rigenerazione può produrre un beneficio significativo.
Quando si analizza la morfologia nmj, la scelta muscolare è di grande importanza. Alcune delle considerazioni principali potrebbero includere il tipo di fibra muscolare, la posizione corporea e l'analisi comparativa alle condizioni umane. Inoltre, laddove sono necessarie manipolazioni come l'iniezione di sostanze o lesioni nervose traumatiche, è importante considerare anche l'accessibilità sperimentale. In generale, è preferibile analizzare una gamma di muscoli posizionati in tutto il corpo che riflettono una gamma di sottotipi di unità motorie. Spesso, tuttavia, la scelta muscolare è influenzata dalla facilità di dissezione. Di conseguenza, l'analisi NMJ viene spesso eseguita esclusivamente su grandi muscoli appendicolari come gastrocnemius. Per ottenere una buona colorazione NMJ in tali muscoli, è spesso necessario sessare o interruzione meccanica delle fibre muscolari. Di conseguenza, il modello di innervazione può essere interrotto e un'analisi completa e di alta qualità dei modelli di innervazione, germogliazione e denervazione è spesso compromessa. Un approccio alternativo è quello di utilizzare sottili muscoli piatti che non richiedono sessatura e possono essere macchiati e montati intatti, consentendo una panoramica completa dell'intera innervazione del muscolo. Ci sono un certo numero di muscoli che possono essere utilizzati per tale analisi, tra cui un gruppo di muscoli cranici, (che comprende levatore auris longus, auricularis superiore adduttore auris longus)14, muscoli toracici (ad esempio. triangolare sterni) 15, e muscoliaddominali (ad esempio transversus abdominis (TVA)). Il principale ostacolo all'uso di tali muscoli è l'esperienza tecnica necessaria per sezionarli senza danni.
In questo video, forniamo un protocollo per sezionare ed eseguire l'etichettatura immunofluorescente del muscolo TVA dal mouse per consentire un'analisi completa del modello di innervazione e della morfologia NMJ. Il muscolo TVA è un muscolo a contrazione prevalentemente lento che comprende lo strato più profondo di muscolatura addominale ed è innervato dai nervi intercostali inferiori. Lavori precedenti hanno dimostrato che è costantemente altamente vulnerabile alla patologia in una serie di modelli di topi della malattia del motoneurone infantile atrofia muscolare spinale (SMA) e in altri modelli di topo di degenerazione del motoneurone ad esordioprecoce 4,16. Suggeriamo quindi che il TVA sia un muscolo utile per intraprendere l'analisi NMJ nelle neuropatie periferiche.
Protocol
Tutte le procedure dovrebbero essere eseguite secondo gli standard di cura degli animali stabiliti dall'istituzione.
1. Dissezione della muscolatura addominale dal topo
- Prima di iniziare, coformare il 4% di paraformaldeide (PFA). Attenzione: tenere sempre pfa all'interno di una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione appropriati.
- Eutanasia del mouse con un metodo approvato. Nota: Il mouse mostrato nel video è stato eutanasiato da overdose di CO2 e lussazione cervicale. Questo mouse è un mouse di tipo jolly di 4 settimane su uno sfondo ibrido CD1/C57Bl6. Questo topo è stato allevato nelle strutture per animali dell'Università di Ottawa da topi originariamente acquistati.
- Fai un'incisione iniziale attraverso la pelle a livello dell'anca e taglia la pelle intorno al topo.
- Staccare la pelle, tirando verso l'alto fino a raggiungere il livello dell'avaro.
- Tagliare la muscolatura addominale a livello dell'anca e continuare l'incisione fino a raggiungere la colonna vertebrale.
- A questo punto, iniziare a tagliare verso l'alto attraverso la muscolatura e le costole fino a raggiungere l'arto superiore.
- Tagliare dritto fino a raggiungere la colonna vertebrale dall'altra parte.
- Tagliare verso il basso fino a raggiungere il punto in cui si è iniziato.
- Rilasciare il diaframma dal basso (facendo attenzione a non danneggiare il muscolo TVA) e posizionare in soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) in una piastra di dissezione rivestita in SYLGARD con perni di dissezione da 0,2 mm.
- Pin fuori la gabbia toracica e muscolatura associata nel piatto, lato superficiale verso l'alto, assicurandosi che il muscolo sia completamente allungato.
- Versare il 1x PBS e sostituire con 4% PFA.
- Coprire e lasciare su una piattaforma a dondolo a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Lavare 3 volte in 1x PBS a temperatura ambiente per 10 minuti.
* A questo punto i muscoli fissi possono essere lasciati in frigo durante la notte prima della successiva dissezione.
2. Isolamento del muscolo TVA
- Per procedere con l'isolamento del muscolo TVA, al microscopio a dissezione, iniziare tagliando il muscolo obliquo esterno a livello delle ultime costole (vedi figura 1 per una guida annotata).
- Tagliare dritto accanto alla linea alba (facendo attenzione a non tagliare il TVA sottostante) fino a raggiungere l'inizio del muscolo obliquo interno.
- Quindi tagliare per rilasciare l'abdominis retto sovrascritti e i muscoli obliqui esterni dalla parte superiore del TVA sottostante.
- Rimuovere il vaso sanguigno e qualsiasi grasso sovrascriva dal muscolo TVA.
- Rilasciare il muscolo dall'ultima costola sovrascriva.
- Tagliare intorno ai margini del muscolo e rimuovere su una piastra da 24 po 'contenente PBS.
3. Etichettatura immunofluorescente e microscopia del muscolo TVA
Per tutti i passaggi successivi, rimuovere il liquido utilizzando una pipetta a punta fine e lasciare la piastra su una piattaforma a dondolo. Salvo diversa indicazione, tutti i passaggi successivi vengono eseguiti a temperatura ambiente.
- Incubare in PBS contenente 1:1.000 bungarotossina con tag fluorescente per 30 minuti per etichettare gli NMJ. Questo può essere fatto in una stanza buia o sotto un foglio.
- Permeabilizzare il muscolo aggiungendo 300 μl per pozzo del 2% di Triton X-100 in PBS e lasciare su una piattaforma a dondolo per 30 min.
- Incubare nel reagente di blocco (4% BSA, 1% Tritone in PBS) per 30 min.
- Incubare nel reagente bloccante contenente anticorpi primari (neurofilamento 1:100; proteina sinaptica vescicolare 2, 1:250) a 4 °C durante la notte.
- Lavare 3 volte in 1x PBS.
- Incubare in PBS contenente 1:250 anticorpi secondari per 2-4 ore.
- Lavare 3 volte in 1x PBS.
- Montare i muscoli su vetrini utilizzando mezzi di montaggio fluorescenti sufficienti e coverlip.
- Le diapositive sono meglio visualizzate utilizzando un filtro passa a doppia banda su un microscopio epifluorescente standard.
- Gli NMJ sono meglio immagini utilizzando una proiezione della serie Z su un microscopio confocale dotato di almeno un obiettivo 40X.
Representative Results
Il protocollo di cui sopra dirige l'isolamento e la colorazione del muscolo TVA per l'analisi NMJ. Ciò consente l'analisi a montaggio intero dei modelli di innervazione muscolare e l'analisi ad alta risoluzione della morfologia nmj(Figura 2). Questa tecnica può essere applicata con successo per rivelare la patologia NMJ nei modelli di topo della malattia dei motoneuroni, come la SMA4,17(Figura 3). Nei modelli di topo di SMA c'è una significativa variabilità intramuscolare nella patologia, tuttavia il muscolo TVA è costantemente altamente colpito. Ciò è dimostrato dalla denervazione delle piastre terminali motorie, dall'accumulo di neurofilamenti al terminale presnaptico e dalla germinazione terminale (Figura 3). I risultati qui presentati dimostrano quindi che la tecnica sopra descritta può essere un metodo potente per fornire una panoramica completa dell'innervazione e dell'analisi della patologia NMJ nei modelli di topo.
Figura 1. Panoramica della muscolatura addominale del topo. (A) L'immagine mostra la gabbia toracica con muscolatura addominale attaccata, che è stata rimossa da un topo recentemente eutanasiato e appuntata in un lato superficiale del piatto di dissezione (A). (B) La dissezione in A è stata annotata per contrassegnare i confini approssimativi dei muscoli addominali. I muscoli addominali superficiali possono essere visti sul lato sinistro della dissezione e includono obliquo esterno (delineato in blu) e retto abdominis (delineato in rosso). Sul lato destro della dissezione, i muscoli superficiali sono stati rimossi per la visualizzazione del muscolo transversus abdominis (delineato in verde) e del muscolo obliquo interno (delineato in giallo). Lo scopo di questo protocollo è quello di dirigere la dissezione della parte superiore del muscolo TVA, qui mostrata come un solido triangolo verde. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 2. Panoramica a montaggio intero delle giunzioni neuromuscolari nel muscolo TVA. Immagini che mostrano nmjs di esempio dal muscolo TVA visualizzati con colorazione immunofluorescente per neurofilamento (NF; verde), proteina vescicolare sinaptica 2 (SV2; verde) e bungarotossina (BTX; rosso). Le immagini sono micrografie fluorescenti montate che mostrano l'intero muscolo (A) o immagini confocali che mostranogruppi (B) osingoli NMJ (C) NMJs. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 3. Patologia della giunzione neuromuscolare nel muscolo TVA da un modello di topo di SMA. Micrografie confocali che mostrano I MN del muscolo TVA visualizzati con colorazione immunofluorescente per neurofilamento (NF; verde), proteina vescicolare sinaptica 2 (SV2; verde) e bungarotossina (BTX; rosso) da entrambi icontrolli (Smn2B/+) o modello di topo SMA(Smn2B/-). Si noti che mentre la normale morfologia nmj può essere osservata nei topi di controllo, nei muscoli TVA dei topi Smn2B /- ci sono prove di denervazione completa (punta di freccia bianca), denervazione parziale (punta di freccia viola) terminale che germoglia (punta di freccia blu) e gonfiore presnaptico (punta di freccia gialla). Le piastre finali post-sinaptiche sono anche meno complesse riflettendo un fenotipo apparentemente meno maturo. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare l'immagine più grande.
Discussion
In questo video, abbiamo dettagliato un protocollo per la dissezione del muscolo TVA dal mouse e per l'etichettatura immunofluorescente a montaggio intero di NMJs all'interno del muscolo. Presentiamo anche dati che mostrano che questo muscolo può essere utilizzato per analizzare la patologia della giunzione neuromuscolare in un modello di topo di SMA.
Il successo di questa tecnica dipende da una serie di fattori. Alcuni dei problemi più comuni sono descritti di seguito. Primo: scarsa colorazione immunoistochimica. Ci possono essere una serie di ragioni per questo, una delle più comuni è l'uso di reagenti diversi da quelli elencati in questo protocollo. Un PFA di microscopia elettronica di alta qualità è molto importante per garantire una buona colorazione, così come la scelta degli anticorpi elencati in questo protocollo. Inoltre, negli animali più anziani(cioè >3 mesi), ottenere una colorazione di buona qualità può essere più difficile. Ciò è dovuto all'aumento dello spessore della fascia che circonda il muscolo e all'aumento dell'accumulo di grasso tra l'obliquo esterno e il tranversus abdominis. È importante rimuovere il grasso, prima di procedere all'immunofluorescenza. Potrebbe anche essere necessario rimuovere parte della fascia che copre il muscolo, che può diventare ispessito. A volte è difficile rimuovere la fascia e il grasso dal muscolo senza incorrere in qualche danno alla fibra muscolare e un'interruzione del modello di innervazione. Tuttavia, se questa tecnica viene eseguita con attenzione, è possibile acquisire una colorazione di buona qualità da topi fino ad almeno 1 anno di età. Nei topipiù giovani (cioè meno di3 mesi di età) non dovrebbe essere necessario eseguire alcuna presa in giro o separazione delle fibre muscolari. In secondo luogo, difficile trovare nmj dopo la dissezione e la colorazione. Questo spesso perché la dissezione non si è estesa sotto l'ultima costola. La maggior parte degli NMJ si trova appena sotto l'ultima costola e quindi bisogna fare attenzione a garantire che questa parte del muscolo sia inclusa nella dissezione. Terzo: aderenza del muscolo EO al muscolo TVA. Questo è spesso un reclamo quando gli individui tentano di estendere la dissezione al di sotto del livello del muscolo obliquo interno (IO). L'area del muscolo TVA in cui è presente anche l'IO è più difficile da analizzare in quanto può essere difficile distinguere quale muscolo è quale. Per questo motivo, di routine sezioniamo solo la parte più superiore del muscolo TVA. A questo livello, non vi è aderenza tra i muscoli EO e TVA, e quindi questo non dovrebbe essere un problema significativo.
Un ostacolo significativo all'uso del muscolo TVA, rispetto ai muscoli appendicolari, è l'accessibilità per manipolazioni chirurgiche o iniezione di sostanze. Questi tipi di esperimenti possono essere cruciali per indagare la fisiologia NMJ in un dato muscolo. Sebbene il TVA sia certamente meno facilmente accessibile rispetto ai muscoli più comunemente usati come tibialis anteriore o gastrocnemio,il lavoro precedente ha dimostrato che è possibile denervare il TVA con lesioni chirurgiche dei nervi intercostali18. Recentemente abbiamo anche usato questo muscolo per la somministrazione locale di sostanze sotto anestetico generale (dati inediti). Sebbene questi esperimenti possano rappresentare una sfida tecnica moderata, questo lavoro dimostra che sono fattibili e quindi estendono l'utilità di questo muscolo per l'analisi degli MN sotto manipolazione patologica e fisiologica.
Il muscolo TVA è uno dei numerosi muscoli piatti sottili situati in tutto il corpo che possono essere utilizzati per l'analisi a montaggio intero dei modelli di innervazione. Altri muscoli includono un gruppo di muscoli cranici innervati dai motoneuroni provenienti dal nucleo facciale del tronco encefalico, che comprendono levatore auris longus, auricularis superiore auris longus adduttore,le cui dissezioni sono state descritte in precedenza14,19. Inoltre, la muscolatura che circonda il muscolo TVA, tra cui EO, IO e rectus abdominis, può anche essere etichettata e utilizzata per l'analisi NMJ. Per un'analisi completa della patologia NMJ in un modello di topo, è importante considerare un certo numero di muscoli situati in tutto il corpo e non limitare l'analisi a un singolo muscolo. Questo è esemplificato nei modelli di topo di malattie dei motoneuroni dove c'è una significativa eterogeneità nei livelli di patologia NMJ tra diversi muscoli20. Tale variabilità intermuscolare è uno strumento estremamente prezioso quando si studia il meccanismo della vulnerabilità dei motoneuroni e quindi limitare l'analisi a un singolo muscolo potrebbe ridurre significativamente il potenziale della ricerca.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del Canadian Institutes of Health Research (numero di sovvenzione MOP 38040) a R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) a R.K., Families of SMA to R.K. e L.M.M, The SMA Trust to T.H.G., e The Muscular Dystrophy Campaign to T.H.G.. L.M.M è un destinatario di una Borsa di studio post-dottorato della Multiple Sclerosis Society of Canada, e R.K. è un destinatario di una cattedra di ricerca sanitaria universitaria presso l'Università di Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
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