Summary
In diesem Video zeigen wir ein Protokoll zur Zerlegung des Transversus-Abdominis-Muskels der Maus und verwenden Immunfluoreszenz und Mikroskopie, um neuromuskuläre Knoten zu visualisieren.
Abstract
Die Analyse der neuromuskulären Knotenmorphologie kann wichtige Einblicke in den physiologischen Status eines bestimmten motorischen Neurons geben. Die Analyse dünner flacher Muskeln kann gegenüber traditionell verwendeten dickeren Muskeln, wie z.B. aus der Hinterbeinen (z.B.. gastrocnemius). Dünne Muskeln ermöglichen einen umfassenden Überblick über das gesamte Innervationsmuster eines bestimmten Muskels, was wiederum die Identifizierung selektiv anfälliger Becken von motorischen Neuronen ermöglicht. Diese Muskeln ermöglichen auch die Analyse von Parametern wie Motoreinheitsgröße, axonale Verzweigung und Terminal/Knoten-Spriegung. Ein häufiges Hindernis bei der Verwendung solcher Muskeln ist die Gewinnung des technischen Know-hows, um sie zu sezieren. In diesem Video beschreiben wir das Protokoll zur Zerkleinerung des Transversus Abdominis (TVA) Muskels von jungen Mäusen und zur Durchführung von Immunfluoreszenz zur Visualisierung von Axonen und neuromuskulären Knoten (NMJs). Wir zeigen, dass diese Technik einen vollständigen Überblick über das Innervationsmuster des TVA-Muskels gibt und zur Untersuchung der NMJ-Pathologie in einem Mausmodell der motorischen Neuronenerkrankung im Kindesalter, spinaler Muskelatrophie, verwendet werden kann.
Introduction
Neuromuskuläre Knoten (NMJs) sind die synaptische Verbindung zwischen einem unteren motorischen Neuron und einer Skelettmuskelfaser. Sie gelten traditionell als dreigliedrige Synapse, bestehend aus einem Neuron (präsynaptisches Terminal), Muskelfaser (postsynaptische Seat) und terminalschwann Zelle1. NMJs scheinen frühe und signifikante Ziele in der Pathologie in einer Reihe von motorischen Neuronenerkrankungen und Mausmodellen zu sein2,3. Typische Symptome sind Dieervation, wo die Motorendplatte frei von einer präsynaptischen Innervation, Schwellung des präsynaptischen Terminals und einer Verringerung der Komplexität derNMJ-Morphologie 4-11wird. Kompensatorische Reaktionen können auch festgestellt werden, einschließlich Terminal- und Knotenkeimung, wo axonale Prozesse von verbleibenden synaptischen Klemmen oder Internoden bis hin zu reinvierten denervierten Endplatten12,13reichen. Aufgrund der engen Korrelation zwischen synaptischer Aktivität und NMJ-Morphologie können aus der Analyse der NMJ-Morphologie viele Informationen über den funktionellen Status von motorischen Neuronen gewonnen werden. Da der Verlust von NMJs häufig einen der ersten Aspekte der neuromuskulären Pathologiedarstellt 4,10, kann die Quantifizierung auf der Ebene der Innervation wichtige Informationen über das Fortschreiten der Pathologie und die mögliche Wirkung einer therapeutischen Intervention geben. Da der NMJ-Verlust einen bedeutenden Schritt in der pathologischen Progression darstellt, kann die Entwicklung von Therapeutika, die Verbindungen stabilisieren und die Regeneration fördern können, einen erheblichen Nutzen bringen.
Bei der Analyse der NMJ-Morphologie ist die Muskelwahl von großer Bedeutung. Einige der primären Überlegungen können Muskelfasertyp, Körperposition und vergleichende Analyse zu menschlichen Bedingungen umfassen. Darüber hinaus ist, wenn Manipulationen wie Injektion von Substanzen oder traumatische Nervenverletzungen erforderlich sind, auch die experimentelle Zugänglichkeit zu berücksichtigen. Im Allgemeinen ist es vorzuziehen, eine Reihe von Muskeln im ganzen Körper zu analysieren, die eine Reihe von Motoreinheiten-Subtypen widerspiegeln. Oft wird die Muskelwahl jedoch durch die einfache Zerlegung beeinflusst. Folglich wird die NMJ-Analyse oft ausschließlich an großen Anhängsmuskelmuskeln wie Gastrocnemiusdurchgeführt. Um eine gute NMJ Färbung in solchen Muskeln zu erhalten, ist oft Schnitt oder mechanische Störung der Muskelfasern erforderlich. Als Ergebnis kann das Innervationsmuster gestört werden und eine umfassende und qualitativ hochwertige Analyse von Innervationsmustern, Keimen und Denervation wird oft beeinträchtigt. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung dünner flacher Muskeln, die keine Schnitte erfordern und intakt gebeizt und montiert werden können, was einen umfassenden Überblick über die gesamte Innervation des Muskels ermöglicht. Es gibt eine Reihe von Muskeln, die für eine solche Analyse verwendet werden können, einschließlich einer Gruppe von Schädelmuskeln, (einschließlich Levator auris longus, auricularis superior, und Adduktoren auris longus)14, Brustmuskeln (z.B.. triangularis sterni) 15, und Bauchmuskeln(z.B. transversus abdominis (TVA)). Das Haupthindernis bei der Verwendung solcher Muskeln ist das technische Know-how, das erforderlich ist, um sie ohne Schäden zu sezieren.
In diesem Video stellen wir ein Protokoll zur Sezieren und Durchführung von immunfluoreszierender Kennzeichnung des TVA-Muskels von der Maus zur Verfügung, um eine umfassende Analyse des Innervationsmusters und der NMJ-Morphologie zu ermöglichen. Der TVA-Muskel ist ein überwiegend langsamer Zuckmuskel, der die tiefste Schicht der Bauchmuskulatur umfasst und durch die unteren interkostalen Nerven innerviert wird. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass es konsequent sehr anfällig für Pathologie in einer Reihe von Mausmodellen der Kindheit motorischen Neuronenkrankheit spinale Muskelatrophie (SMA) und in anderen Mausmodellen der frühen einsetzenden motorischen Neuronendegeneration4,16. Wir schlagen daher vor, dass das TVA ein nützlicher Muskel für die Durchführung von NMJ-Analysen in peripheren Neuropathien ist.
Protocol
Alle Verfahren sollten nach den von der Einrichtung festgelegten Tierpflegestandards durchgeführt werden.
1. Dissektion der Bauchmuskulatur von der Maus
- Vor dem Start 4% Paraformaldehyd (PFA) ausmachen. Achtung: Halten Sie PFA immer in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie eine geeignete Schutzausrüstung.
- Euthanisieren Sie die Maus nach einer genehmigten Methode. Hinweis: Die im Video gezeigte Maus wurde durch eine Überdosis CO2 und Zervixdislokation eingeschläfert. Diese Maus ist eine 4 Wochen alte Wild-Type-Maus auf einem CD1/C57Bl6-Hybridhintergrund. Diese Maus wurde in den Tieranlagen der Universität Ottawa von Mäusen gezüchtet, die ursprünglich gekauft wurden.
- Machen Sie einen ersten Schnitt durch die Haut auf der Ebene der Hüfte und schneiden Sie durch die Haut den ganzen Weg um die Maus.
- Die Haut abziehen, nach oben ziehen, bis Sie das Niveau des Vorderbeins erreichen.
- Schneiden Sie die Bauchmuskulatur auf der Ebene der Hüfte durch und setzen Sie den Schnitt fort, bis Sie die Wirbelsäule erreichen.
- An diesem Punkt beginnen Sie, nach oben durch die Muskulatur und die Rippen zu schneiden, bis Sie die obere Extremität erreichen.
- Schneiden Sie geradeüber, bis Sie die Wirbelsäule auf der anderen Seite erreichen.
- Schneiden Sie nach unten, bis Sie den Punkt erreichen, an dem Sie begonnen haben.
- Lösen Sie das Zwerchfell von unten (wobei darauf geachtet wird, den TVA-Muskel nicht zu beschädigen) und legen Sie es in Phosphatgepufferte Salin (PBS) in einer SYLGARD-beschichteten Sezierschale mit 0,2 mm Sezierstiften.
- Pin out der Rippenkäfig und die damit verbundene Muskulatur in der Schale, oberflächliche Seite nach oben, um sicherzustellen, dass der Muskel vollständig ausgestreckt ist.
- Gießen Sie die 1x PBS ab und ersetzen Sie sie durch 4% PFA.
- Bedecken und lassen Sie auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur für 15 min.
- Waschen Sie 3x in 1x PBS bei Raumtemperatur für 10 min.
* An dieser Stelle können die festen Muskeln über Nacht vor der anschließenden Zerlegung im Kühlschrank gelassen werden.
2. Isolierung des TVA-Muskels
- Um mit der Isolierung des TVA-Muskels unter einem Seziermikroskop fortzufahren, beginnen Sie mit dem Durchschneiden des äußeren schrägen Muskels auf der Ebene der letzten Rippen (siehe Abbildung 1 für eine anmerkungsierte Anleitung).
- Schneiden Sie gerade neben der Linea alba (achten Sie darauf, nicht durch den TVA unten zu schneiden), bis Sie den Beginn der inneren schrägen Muskel erreichen.
- Dann schneiden Sie durch, um die darüber liegenden Rectus abdominis und externe schräge Muskeln aus dem oberen Teil des TVA unten zu lösen.
- Entfernen Sie das Blutgefäß und jedes darüber liegende Fett aus dem TVA-Muskel.
- Lassen Sie den Muskel von der überlegenen letzten Rippe.
- Schneiden Sie um die Ränder des Muskels und entfernen Sie auf eine 24-Well-Platte, die PBS enthält.
3. Immunfluoreszenz-Etikettierung und Mikroskopie des TVA-Muskels
Für alle nachfolgenden Schritte Flüssigkeit mit einer fein gekippten Pipette entfernen und die Platte auf einer Schaukelplattform lassen. Sofern nicht anders angegeben, werden alle nachfolgenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Inkubieren Sie in PBS mit 1:1.000 fluoreszierend Bungarotoxin für 30 min, um die NMJs zu kennzeichnen. Dies kann in einem dunklen Raum oder unter Folie erfolgen.
- Permeabilisieren Sie den Muskel, indem Sie 300 l pro Bohrgut von 2% Triton X-100 in PBS hinzufügen und 30 min auf einer Schaukelplattform lassen.
- Inkubieren Sie in blockierendem Reagenz (4% BSA, 1% Triton in PBS) für 30 min.
- Inkubieren Sie in blockierendem Reagenz, das primäre Antikörper (Neurofilament 1:100; synaptisches Vesikelprotein 2, 1:250) bei 4 °C über Nacht enthält.
- Waschen Sie 3x in 1x PBS.
- Inkubieren in PBS mit 1:250 sekundärem Antikörper für 2-4 Stunden.
- Waschen Sie 3x in 1x PBS.
- Montieren Sie Muskeln mit ausreichend fluoreszierenden Montagemedien und Deckelrutschen auf Glasschlitten.
- Dias werden am besten mit einem Doppelbandpassfilter auf einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop betrachtet.
- NMJs werden am besten mit einer Z-Serie-Projektion auf einem konfokalen Mikroskop mit mindestens einem 40-Fach-Objektiv abgebildet.
Representative Results
Das obige Protokoll leitet die Isolierung und Färbung des TVA-Muskels für die NMJ-Analyse. Dies ermöglicht eine vollwertige Analyse von Muskelinnervationsmustern sowie eine hochauflösende Analyse der NMJ-Morphologie (Abbildung 2). Diese Technik kann erfolgreich angewendet werden, um NMJ-Pathologie in Mausmodellen der motorischen Neuronenerkrankung, wie SMA4,17(Abbildung 3) zu offenbaren. In Mausmodellen von SMA gibt es signifikante intramuskuläre Variabilität in der Pathologie, jedoch ist der TVA-Muskel durchweg stark betroffen. Dies wird durch die Denervation von motorischen Endplatten, die Ansammlung von Neurofilamenten am präsynaptischen Terminal und das Terminalkeimen belegt (Abbildung 3). Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen somit, dass die oben beschriebene Technik eine leistungsfähige Methode sein kann, um einen umfassenden Überblick über die Innervation und Analyse der NMJ-Pathologie in Mausmodellen zu bieten.
Abbildung 1. Überblick über die Bauchmuskulatur der Maus. (A) Bild zeigen den Brustkäfig mit angehängter Bauchmuskulatur, der von einer kürzlich eingeschläferten Maus entfernt und in einer Sezierschale auf der oberflächlichen Seite nach oben gepinnt wurde (A). (B) Die Dissektion in A wurde mit Anmerkungen zur ungefähren Grenze der Bauchmuskeln bezeichnet. Die oberflächlichen Bauchmuskeln können auf der linken Seite der Sezierung gesehen werden, und umfassen äußere Schräglage (blau umrandet) und rectus abdominis (rot umrandet). Auf der rechten Seite der Sektion wurden die oberflächlichen Muskeln entfernt erlaubt Visualisierung der transversus abdominis Muskel (in grün umrissen) und der internen schrägen Muskel (in gelb umrissen). Ziel dieses Protokolls ist es, die Zerlegung des oberen Teils des TVA-Muskels, der hier als ein durchgehendes grünes Dreieck dargestellt wird, zu lenken. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Überblick über neuromuskuläre Knoten im TVA-Muskel. Bilder, die Beispiel-NMJs aus dem TVA-Muskel zeigen, visualisiert mit immunfluoreszierender Färbung für Neurofilamente (NF; grün), synaptischeves Vesikelprotein 2 (SV2; grün) und Bungarotoxin (BTX; rot). Die Bilder sind montagierte fluoreszierende Mikrographien, die den gesamten Muskel (A) oder konfokale Bilder zeigen Gruppen (B) oder einzelne (C) NMJs. Scale bar = 800 'm (A), 70 'm (B), 25 'm (C). Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Neuromuskuläre Knotenpathologie im TVA-Muskel aus einem Mausmodell von SMA. Konfokale Mikrographien zeigen NMJs aus dem TVA-Muskel visualisiert mit immunfluoreszierender Färbung für Neurofilament (NF; grün), synaptischeves Vesikelprotein 2 (SV2; grün) und Bungarotoxin (BTX; rot) von entweder Kontrolle (Smn2B/+) oder SMA-Mausmodell (Smn2B/-). Beachten Sie, dass während normale NMJ-Morphologie bei Kontrollmäusen beobachtet werden kann, bei TVA-Muskeln von Smn2B/- Mäusen gibt es Hinweise auf eine vollständige Denervation (weiße Pfeilspitze), partielle Denervation (lila Pfeilspitze) Terminal-Keimung (blaue Pfeilspitze) und präsynaptische Schwellung (gelbe Pfeilspitze). Die postsynaptischen Endplatten sind auch weniger komplex und spiegeln einen scheinbar weniger ausgereiften Phänotyp wider. Maßstabsleiste = 50 m. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Discussion
In diesem Video haben wir ein Protokoll für die Zerlegung des TVA-Muskels von der Maus und für die ganzmontierte immunfluoreszierende Kennzeichnung von NMJs innerhalb des Muskels detailliert beschrieben. Wir präsentieren auch Daten, die zeigen, dass dieser Muskel verwendet werden kann, um neuromuskuläre Knotenpathologie in einem Mausmodell von SMA zu analysieren.
Der Erfolg dieser Technik hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Einige der häufigsten Probleme werden im Folgenden beschrieben. Erstens: schlechte immunhistochemische Färbung. Es kann eine Reihe von Gründen dafür geben, einer der häufigsten ist die Verwendung von verschiedenen Reagenzien zu denen, die in diesem Protokoll aufgeführt sind. Eine hochwertige Elektronenmikroskopie Qualität PFA ist sehr wichtig, um eine gute Färbung zu gewährleisten, wie die Wahl der Antikörper in diesem Protokoll aufgeführt sind. Darüber hinaus kann bei älteren Tieren(d.h.> 3 Monaten) eine gute Färbung schwieriger sein. Dies ist aufgrund der erhöhten Dicke der Faszien um den Muskel und die Zunahme der Fettansammlung zwischen der äußeren Schräglage und Tranversus Abdominis. Es ist wichtig, das Fett abzustreifen, bevor Sie zur Immunfluoreszenz übergehen. Es kann auch notwendig sein, einige der Faszien abzustreifen, die den Muskel bedecken, die verdickt werden können. Es ist manchmal schwierig, die Faszien und Fett aus dem Muskel zu entfernen, ohne einige Schäden an der Muskelfaser und eine Störung des Innervationsmusters. Wenn diese Technik jedoch sorgfältig durchgeführt wird, kann eine gute Färbung von Mäusen bis mindestens 1 Jahr erworben werden. Bei jüngeren Mäusen(d.h.weniger als 3 Monate alt) sollte es nicht notwendig sein, eine Hänseleien oder Trennung von Muskelfasern durchzuführen. Zweitens: schwierig bei der Suche nach NMJs nach Sezieren und Färben. Dies liegt oft daran, dass sich die Sezierung unter der letzten Rippe nicht verlängert hat. Die meisten NMJs befinden sich direkt unter der letzten Rippe und daher muss darauf geachtet werden, dass dieser Teil des Muskels in der Zerlegung enthalten ist. Drittens: Die Haftung des EO-Muskels am TVA-Muskel. Dies ist oft eine Beschwerde, wenn Einzelpersonen versuchen, die Sektion unter dem Niveau der inneren Schrägstrich (IO) Muskel zu verlängern. Der Bereich des TVA-Muskels, in dem auch die IO vorhanden ist, ist schwieriger zu analysieren, da es schwierig sein kann, zu unterscheiden, welcher Muskel welche ist. Aus diesem Grund sezieren wir routinemäßig nur den überlegensten Teil des TVA-Muskels. Auf dieser Ebene gibt es keine Haftung zwischen der EO und TVA Muskeln, und daher sollte dies kein signifikantes Problem sein.
Ein erhebliches Hindernis für die Verwendung des TVA-Muskels, im Vergleich zu appendicular Muskeln, ist zugänglich für chirurgische Manipulationen oder Injektion von Substanzen. Diese Arten von Experimenten können entscheidend sein, um die NMJ-Physiologie in einem bestimmten Muskel zu untersuchen. Obwohl der TVA sicherlich weniger leicht zugänglich ist als häufiger verwendete Muskeln wie tibialis anterior oder gastrocnemius, hat frühere Arbeiten gezeigt, dass es möglich ist, den TVA durch chirurgische Verletzung der Interkostalnerven zu denervate18. Wir haben diesen Muskel vor kurzem auch für die lokale Verabreichung von Substanzen unter Vollnarkose (unveröffentlichte Daten) verwendet. Obwohl diese Experimente eine moderate technische Herausforderung darstellen können, zeigt diese Arbeit, dass sie machbar sind und somit die Nützlichkeit dieses Muskels für die Analyse von NMJs unter pathologischer und physiologischer Manipulation erweitern.
Der TVA-Muskel ist einer von mehreren dünnen flachen Muskeln im ganzen Körper, die für die Gesamt-Mount-Analyse von Innervationsmustern verwendet werden können. Andere Muskeln umfassen eine Gruppe von Schädelmuskeln, die durch motorische Neuronen, die aus dem Gesichtskern des Hirnstamms stammen, innerviert werden und Levator auris longus, auricularis superiorund Adduktoren auris longusumfassen, deren Dissektionen zuvor14,19beschrieben wurden. Darüber hinaus kann die Muskulatur, die den TVA-Muskel umgibt, einschließlich EO, IO und rectus abdominis, auch gekennzeichnet und für die NMJ-Analyse verwendet werden. Für eine umfassende Analyse der NMJ-Pathologie in einem Mausmodell ist es wichtig, eine Reihe von Muskeln im ganzen Körper zu berücksichtigen und die Analyse nicht auf einen einzelnen Muskel zu beschränken. Dies wird in Mausmodellen von motorischen Neuronenerkrankungen veranschaulicht, bei denen es eine signifikante Heterogenität in den Niveaus der NMJ-Pathologie zwischen verschiedenen Muskeln20gibt. Eine solche intermuskuläre Variabilität ist ein äußerst wertvolles Werkzeug bei der Untersuchung des Mechanismus der Motorneuron-Schwachstelle und daher könnte die Beschränkung der Analyse auf einen einzelnen Muskel das Potenzial der Forschung erheblich verringern.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Canadian Institutes of Health Research (Grant-Nummer MOP 38040) an R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) an R.K., Families of SMA to R.K. und L.M.M, The SMA Trust to T.H.G. und The Muscular Dystrophy Campaign to T.H.G. unterstützt. L.M.M ist Empfänger eines Multiple-Sklerose-Gesellschafts-Postdoktorandenstipendiums der Multiple Sclerosis Society of Canada und R.K. ist Empfänger eines University Health Research Chair von der University of Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
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