Summary
Hier beschrijven we een methode voor een snelle en nauwkeurige meting van vliegprestaties in Drosophila, waardoor high-throughput screening.
Abstract
Drosophila heeft bewezen een bruikbaar model systeem voor de analyse van het gedrag, met inbegrip van de vlucht zijn. De eerste vlucht tester betrokken dropping vliegt in een geoliede maatcilinder; landing hoogte aanwezig is een maat voor de vliegprestaties door het beoordelen hoe ver vliegen zal vallen voordat het produceren van voldoende stuwkracht om contact met de wand van de cilinder te maken. Hier beschrijven we een bijgewerkte versie van de vlucht tester met vier belangrijke verbeteringen. Eerst voegden we een "drop tube" zodat alle vliegen alstublieft de cilinder vlucht op een vergelijkbare snelheid tussen processen, waardoor variabiliteit tussen gebruikers. Ten tweede, we vervangen de olie coating met uitneembare kunststof platen bekleed in Tangle-Trap, een lijm ontwikkeld om levende insecten vangen. Ten derde gebruiken we een langere cilinder om meer accurate discriminatie vlucht vermogen mogelijk te maken. Vierde gebruiken we een digitale camera en imaging software om het scoren van vliegprestaties automatiseren. Deze verbeteringen zorgen voor de rapid, kwantitatieve beoordeling van vlieggedrag, handig voor grote datasets en grootschalige genetische screens.
Introduction
Drosophila is lange tijd gebruikt om de genetische basis van het gedrag 1 te bestuderen, en onderzoekers hebben een aantal manieren om verschillende gedragingen 2-6 analyseren ontwikkeld. Vliegen zijn bijzonder nuttig bij het verstrekken van bruikbare modellen van neuromusculaire aandoeningen 7 geweest. Een veel voorkomende test gebruikt om motorische gedrag te bestuderen is vliegprestaties. De oorspronkelijke vlucht tester is nuttig voor het identificeren vlucht defecte mutanten en voor de kwantitatieve beoordeling van de vlucht het vermogen 1, maar het heeft een aantal tekortkomingen die zijn aanvraag voor high throughput schermen beperken: het gebruik van geoliede cilinders is rommelig en omslachtig, bepaalde functies zoals de lengte van de cilinder en invoering van ongedierte in de buis met variabele kracht kunnen kwantitatieve nauwkeurigheid, en het is moeilijk om levende vliegen herstellen van de tester. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we de vlucht tester gemodificeerd om een aantal verbeteringen. We voegden een "drop tuworden "om vliegen de variabiliteit tussen experimenten en gebruikers elimineren introduceren. We maken gebruik van verwijderbare acryl platen bekleed met een kleefstof die zorgt voor eenvoudiger opruimen en herstel van individuele vliegen. We hebben de lengte van de vlucht buis verhoogd tot kwantitatieve nauwkeurigheid en betrouwbaarheid te verbeteren. Tenslotte maken we gebruik van een digitale camera en imaging software om de landing hoogten van vliegen te berekenen. Wij geloven dat deze verbeteringen zullen nuttig zijn in elk laboratorium geïnteresseerd in het uitvoeren van grootschalige genetische screens voor gebreken in vliegprestaties zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monteer Flight Tester
- Veilige vlucht cilinder Ring Stand 1 behulp kettingklemmen. (Laat ongeveer 3 cm onder de cilinder voor wegen gerecht.)
(Opmerking: De vlucht cilinder we gebruiken is 90 cm lang met een diameter van 13,5 cm.) - Plaats Weeg met een dun laagje minerale olie onder de cilinder vlucht.
- Secure trechter Ring Stand 2 met behulp van een ring klem en klauw klem. De hoogte van de trechter, zodat de onderkant van de trechter gelijk ligt met de bovenkant van de cilinder vlucht. (Opmerking: de tip diameter van de trechter moet kleiner zijn dan de buitendiameter van flacons geplaatst in de zaaipijp zodat de injectieflacons niet door zal vallen zijn.)
- Steek hangende buis in de bovenkant van de trechter en vast met een klauw klem.
(Opmerking: We maken gebruik van een druppel buis die is 25 cm lang Dropping fly-bevattende flesjes uit deze hoogte maakt consistente uitwerpen van alle vliegen met uniforme kracht De binnendiameter van de valpijp moet sligh zijn..tgevoerd groter dan de buitendiameter van de flacon om de flacon vrij vallen.) - Snijd polyacrylamide vel (len) naar de juiste grootte. (Opmerking: Om te helpen bij het plaatsen en verwijderen van de plaat, moet de breedte iets kleiner dan de binnenste omtrek van de cilinder vlucht zijn).
- Breng een dun laagje van Tangle-Trap naar de plaat. Laat zitten 1 uur voor gebruik. (Let op: Laat voldoende ruimte vrij aan de bovenkant en onderkant van het vel (ongeveer 3 cm) ongecoat om het laken voor het inbrengen / verwijderen begrijpen.)
- Plaats de polyacrylamide blad in de cilinder vlucht.
- Monteer de camera track met grenen steunbeugels. (Let op: zorg ervoor dat de onderkant van de baan de camera kan ondersteunen zonder het blokkeren van de lens zie figuur 1B..)
- Stoppers toevoegen en vastschroeven. (Let op: plaats de stoppers op locaties waarmee de camera om de hele kunststof plaat in panoramische modus te bekijken.)
2. Run Experiment
- <li> Verzamel flacons van vliegen te testen. Voor het beste resultaat, gebruik niet meer dan 20 vliegen / flacon.
- Tik voorzichtig vliegen naar onderkant van flesje, loskoppelen en vervolgens invoegen in valpijp en laat flacon.
(Opmerking: Het flesje naar beneden valt de daling buis totdat hij de smalle trechter opening raakt Wanneer de flacon raakt de trechter, worden de vliegen uitgeworpen in de cilinder vlucht..) - Til de druppel buis naar de lege flacon te verwijderen.
(Opmerking: Meerdere flacons van vliegen van dezelfde testgroep kan worden getest op een polyacrylamide vel We vinden dat tot 200 vliegen (10 flacons van 20 vliegen per stuk) kunnen worden getest en gemakkelijk afgebeeld op een vel.. - Verwijder het plastic en leg het op een vlakke witte ondergrond.
(Opmerking: wit poster boord mogen worden gebruikt als bankje tops zijn donker gekleurd.) - Monteer de camera spoor over de plastic plaat. De camera moet voldoende hoog boven het blad aan zowel de boven-en onderkant van het blad in het gezichtsveld hebben.
- Schuif de camera langs the spoor terwijl de "capture"-knop ingedrukt om een panoramisch beeld te verwerven.
- Het aantal vliegen de landing in de olie kan handmatig worden geteld voor elk onderzoek.
- Herhaal stappen 2.2-2.7 alle omstandigheden in een bepaald experiment. De vliegen worden verwijderd van de plaat tussen elke proef. Alternatief kunnen meerdere bladen worden gebruikt, een nieuw vel voor elk onderzoek.
3. Data Collection
- Beeldbestanden opent met behulp van ImageJ software.
- Gewas beelden indien nodig alleen de landing oppervlakte omvatten. (Dit is het gebied bedekt met Tangle-Trap.)
- Beelden omzetten naar 8-bits grijsschaal.
- Maak een "drempel" om te filteren op de witte achtergrond.
(Afbeelding → Pas → Threshold). - Stel de parameters voor elke vlieg met het menu "deeltjes te analyseren" te identificeren.
(Analyze → Analyseer Particles) Definieer de parameters die worden gebruikt om een deeltje te identificeren. Met onze opgezet, vinden we dat het gebruik van eengebied van 5-90 pixels 2 en een circulariteit van 0,4-1,0 zal nauwkeurig te identificeren alle monsters. - Meet de locatie van elke vliegen met de gegenereerde lijst coördinaten voor elk deeltje. De x-coördinaat in pixels worden omgezet in centimeter tot de overloop hoogte berekenen.
- Importeer tabel in een spreadsheet (zoals Microsoft Excel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont een schema van de bijgewerkte vlucht tester montage. Figuur 1B illustreert het spoor ontwerp laat de camera een panoramisch beeld te nemen zonder het blokkeren van het gezichtsveld. Representatieve resultaten worden getoond in Figuur 2, waar de prestaties van slowpoke mutantvliegen, die een bekende vlucht defect 8-10 hebben vlucht, vergeleken met wildtype Canton-S vliegt. Controle vliegt vaste land nabij de bovenkant van de cilinder, met zeer weinig spreiding bij individuen en een gemiddelde aanvoer hoogte van 73 ± 2,0 cm. In tegenstelling, slome vliegen vertonen een veel gevarieerder landing verspreiden, en land beduidend lager, gemiddeld 44 ± 4,1 cm. Alle vliegen waren 3 dagen oud, opgegroeid bij kamertemperatuur (23 ° C).
s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 1. Diagrammen of Flight Tester, Camera, en Track. (A) Illustratie van de set-up voor de bijgewerkte vlucht tester. Ring Stand 1 houdt de 90 cm hoge vlucht cilinder; Ring Stand 2 houdt de trechter en de 10 cm lang "drop tube". (B) Schema van de camera en track gebruikt om een panoramisch beeld te produceren. De camera moet door het spoor worden gesteund zonder het uitzicht belemmeren van de lens. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Representatieve resultaten van een steekproef vlucht experiment. Vergelijking vlucht vermogen van 3 dagen oude CaNTON-S controle vliegt naar mutanten (slo ts1) slowpoke. (A) Scherm vangt voor slowpoke en controle vliegen weergeven van de landing hoogten van individuele vliegen. Elke blauwe cirkel geeft de locatie van een individuele fly. Deze landing hoogtes worden gebruikt om de gemiddelde hoogte overloop (B) en de algehele verdeling (C) voor elk genotype berekenen. Mannelijke en vrouwelijke vliegen werden samengevoegd in elk monster. Fout balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van de hier beschreven methoden, zijn we in staat om vliegprestaties van een groot aantal van Drosophila mutanten snelle beoordeling, waardoor een grotere efficiëntie dan voorheen mogelijk was. Voor onze experimenten hebben we routinematig scheiden mannen en vrouwen en hen op te voeden bij lage dichtheid (minder dan 20 vliegen / flacon) om agressie die vleugels kunnen beschadigen beperken. Een andere belangrijke overweging is om goed te controleren voor verschillen in vliegprestatie gevolg van verschillen in genetische achtergrond. We vinden het ook helpt om vliegen te stellen om minimaal 24 uur om te herstellen van verdoving met kooldioxide voorafgaand aan testvluchten. Alternatief kan vliegen worden verdoofd door blootstelling aan koude temperaturen (4 ° C) om sneller herstel zonder potentieel beïnvloeden gedrag.
De snelheidsbeperkende stap in dit protocol is het verwijderen van de vliegen uit de plastic plaat tussen studies. Een methode om de efficiëntie te verhogen is om een groot aantal o gebruikenf vellen tegelijk, afgezien van de vellen als ze worden gebruikt en het schoonmaken ze allemaal tegelijk na het verzamelen van gegevens. Vliegen die vallen op de bodem moet handmatig worden geteld, omdat zij niet zullen worden opgenomen op het vel. Toch is dit gemakkelijk in vergelijking met het handmatig berekenen landing hoogte. De noodzaak om Tangle-Trap opnieuw toepassen op elk vel is afhankelijk van hoe dik de laag is. In onze ervaring, zal een individueel blad een maand duren voordat een nieuwe coating nodig is.
Een bijkomend voordeel van het gebruik wirwar Trap op minerale olie is het vermogen om levende vliegen herstellen van de plaat. Omdat de vliegen gewoon vasthouden aan het oppervlak van Tangle-Trap in plaats van steeds ondergedompeld, kan individuele vliegen gemakkelijk worden verwijderd. "Vliegende" vliegen die vallen op de bodem kan ook worden hersteld door het vervangen van de minerale olie dienblad met een lege fles.
Wij geloven dat de geautomatiseerde meting van vlieggedrag hier beschreven biedt een number voordelen boven eerdere werkwijzen, waardoor een hogere doorvoer, reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid voor genetische screens. Geautomatiseerde noteren is ook gebruikt om de doorvoer te verhogen voor gedrags testen zoals de RING test 11. Bovendien is de directe meting van de landing hoogte zorgt voor een grotere gevoeligheid dan een eenvoudige pass / fail meting (% vliegers, enz.), Waardoor we meer subtiele verschillen te detecteren in vliegprestaties.
De hier beschreven test kan worden aangevuld door latere verdere testen die meer complexe aspecten van het vlieggedrag, waaronder visuele controle vlucht snelheid 12 en free-flight reacties op beweging 13 meten. Hoewel deze testen zijn tijdrovend en ongeschikt geacht voor grootschalige genetische screens, kunnen zij helpen om informatie over de functie van een bepaald gen in een motorische respons verschaffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent F32 NS078958 (DTB) en R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
- Benzer, S.
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
