Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/51223
Automatic Translation
1, 1
1Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

Burada yüksek verimli tarama sağlayan, Drosophila uçuş performans hızlı ve doğru bir ölçümü için bir yöntem tarif eder.

Abstract

Drosophila uçuş dahil olmak üzere davranış analizi için yararlı bir model sistemi, olduğu kanıtlanmıştır. İlk uçuş test yer bırakarak içine uçar yağ kaplı silindir mezun, iniş yüksekliği silindirin duvarı ile temas kurmaya itme yeterince hazırlamadan önce çok sinekler düşecek ne değerlendirerek uçuş performansı ölçmek sağladı. Burada dört önemli iyileştirmeler ile uçuş test güncelleştirilmiş bir sürümünü açıklar. İlk olarak, bütün sinekler kullanıcılar arasındaki değişkenliği ortadan kaldırarak, çalışmalar arasındaki benzer bir hızda uçuş silindire girer olmasını sağlamak için bir "damla tüp" ekledi. İkincisi, biz Tangle-Trap, canlı böcekleri yakalamak için tasarlanmış bir yapıştırıcı kaplı çıkarılabilir plastik levhalar ile yağ kaplaması değiştirilir. Üçüncü olarak, uçuş yeteneği daha doğru ayrımcılık sağlamak için daha uzun bir silindir kullanın. Dördüncü biz uçuş performans puanlama otomatikleştirmek için bir dijital kamera ve görüntüleme yazılımını kullanabilirsiniz. Bu gelişmeler rap için izinid, uçuş davranış kantitatif değerlendirilmesi, büyük veri kümeleri ve büyük ölçekli genetik ekranlar için yararlıdır.

Introduction

Drosophila uzun davranış 1 genetik temelini incelemek için kullanılır olmuştur, ve araştırmacılar davranış 2-6 çeşitli analiz etmek için çeşitli yollar geliştirdiler. Sinekler nöromüsküler bozukluklar 7 açısından yararlı modeller sağlayan özellikle yararlı olmuştur. Lokomotor davranışını incelemek için kullanılan ortak bir tahlil uçuş performans. Orijinal uçuş test uçuşu kusurlu mutantlar tanımlamak için ve uçuş yetenek 1 kantitatif değerlendirilmesi için yararlıdır, ancak yüksek verimli ekranlar için uygulanmasını kısıtlayan bazı eksiklikleri vardır: Yağ kaplı silindir kullanımı, dağınık ve hantal gibi bazı özellikleri Değişken güç ile tüp içine silindir ve sinekler sokulma uzunluğu kantitatif doğruluğunu azaltmak ve bu test canlı sinekler geri kazanılması zor olan. Bu sınırlamaları aşmak için, bir dizi iyileştirmeler içerecek şekilde uçuş test değiştirdiniz. Biz bir "damla tu eklendiBiz kolay temizlik ve bireysel sinekler kurtarma sağlayan bir yapıştırıcı ile kaplı çıkarılabilir akrilik yaprak kullanmak deneyler ve kullanıcılar arasındaki değişkenliği ortadan kaldırmak için sinekler tanıtmak için "olması.. Biz kantitatif doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmak için uçuş tüpün uzunluğu artmıştır. Nihayet , bir dijital kamera ve sineklerin iniş yükseklikleri hesaplamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Biz bu gelişmeler uçuş performansı kusurlar için büyük ölçekli genetik ekranlar yürütülmesi ilgilenen herhangi bir laboratuvara yararlı olacağına inanıyorum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Uçuş Tester birleştirin

  1. Yüzük Güvenli uçuş silindir zincir kelepçeler kullanarak 1 Standı. (Çanak tartmak için silindirin altında yaklaşık 3 cm bırakın.)
    (Not: Kullandığımız uçuş silindir 13.5 cm çapında 90 cm uzunluğundadır.)
  2. Uçuş silindirin altında mineral yağ ince bir tabaka ile çanak tartmak yerleştirin.
  3. Ring Güvenli huni bir halka kelepçe ve pençe kelepçe kullanarak 2 Standı. Huninin alt uçuş silindirin üst kısmı ile aynı hizada olacak şekilde huni yüksekliğini ayarlar. (Not: huninin uç çapı şişeler ile düşmez, böylece damla tüplerine yerleştirilen şişelerin dış çapından daha küçük olması gerekir.)
  4. Huni üst içine açılan tüp takın ve bir pençe kelepçe kullanarak sabitleyin.
    (Not: Bu 25 cm uzunluğunda bir damla tüpü kullanmak Bırakma hedefi içeren homojen bir kuvvet ile tüm sineklerin tutarlı çıkarılmasını sağlayan bu yükseklikten şişeler düşürme tüpünün iç çapı, sligh olmalıdır..Flakon serbestçe düşmesine olanak sağlamak üzere şişenin dış çapından daha büyük tly).
  5. Uygun boyutta poliakrilamid levha (lar) kesin. (Not: ekleme ve levha giderilmesinde yardımcı olmak için, genişliği uçuş silindirin iç çevresi biraz daha küçük olmalıdır).
  6. Yaprağa Tangle-Trap ince bir tabaka uygulayın. Kullanmadan önce 1 saat boyunca bekletin. (Not: tabakanın üst ve alt ekleme / kaldırma için sayfasını kavramak kaplanmamış (yaklaşık 3 cm) yeterli boşluk bırakın.)
  7. Uçuş silindir poliakrilamid sayfasını yerleştirin.
  8. Çam destek dirseklerini kullanarak kamera parçayı birleştirin. (Not: parçanın alt lens bloke olmadan kamera destek sağlamak Şekil 1B'ye bakınız.).
  9. Tıkaçs ekleyin ve yerine vida. (Not: Burası kamera panorama modunda tüm plastik sayfasını görüntülemek sağlayacak yerlerde tıpaları.)

2. Denemeyi çalıştırın

    <li> test edilecek sinekler şişeleri toplayın. En iyi sonuç için, en fazla 20 sinekler / şişesini kullanın.
  1. Yavaşça flakonun dibine sinekler dokunun, prizden, ardından açılan tüp içine yerleştirin ve şişeyi bırakın.
    (Not: Bu, dar huni açıklığı edecek kadar şişe düşürme tüpü düşer şişe hunisi çarptığında, sinekler uçuş silindir içine atılır.).
  2. Boş şişeyi kaldırmak için açılan tüp kaldırın.
    (Not: Aynı deney grubu sinekler Birden küçük şişeler tek bir poliakrilamid kağıda denenebilir Biz kadar 200 sinekler (20 sinekler her 10 şişe), tek bir kağıda test ve kolayca görüntülü bulabilirsiniz..
  3. Plastik levha çıkarın ve düz beyaz bir yüzey üzerine yerleştirin.
    (Not: tezgah üstleri koyu renkli ise beyaz poster panosu kullanılabilir.)
  4. Plastik levha üzerinde kamera parçayı birleştirin. Kamera görüş alanında yaprağın alt ve üst hem de sahip için tabaka üzerinde yeterli derecede yüksek olmalıdır.
  5. Th boyunca kamerayı kaydırıne parça panoramik bir görüntü elde etmek için "yakalama" tuşuna basılı tutarak.
  6. Petrol iniş sinek sayısı her deneme için elle sayılır.
  7. Tekrar verilen bir deneyde tüm koşullar için 2,2-2,7 adımları. Sinekler her deneme arasındaki tabakasından çıkarılabilir. Alternatif olarak, çok sayıda yaprak her seferinde yeni bir tabaka ile, kullanılabilir.

3. Veri Toplama

  1. ImageJ yazılımı kullanarak görüntü dosyaları açın.
  2. Kırpma görüntüleri sadece iniş yüzey alanı dahil etmek gerekirse. (Bu Tangle-Trap kaplı alandır.)
  3. 8-bit gri tonlama görüntüleri dönüştürün.
  4. Beyaz arka plan filtrelemek için bir "Eşik" oluşturun.
    (Görüntü → → Eşik ayarlayın).
  5. "Parçacıkları analiz" menüsünü kullanarak her sinek belirlemek için parametreleri ayarlayın.
    Bir parçacık tanımlamak için kullanılan parametrelerini tanımlayın (Parçacıklar Analiz → Analiz). Bizim kurmak ile bulduğumuz bir kullanıyor5-90 piksel 2 ve 0,4-1,0 bir dairesellikte alanı doğru tüm örnekleri tespit edecektir.
  6. Her parçacığın koordinat oluşturulan listesini kullanarak her sineğin yerini ölçün. Piksel x-koordinatı iniş yüksekliğini hesaplamak için santimetre dönüştürülebilir.
  7. (Microsoft Excel gibi) bir tablo içine tablo ithal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1A güncellenen uçuş test düzeneğinin şemasını göstermektedir. Şekil 1B parça tasarımı kamera görüntüsü alanını engelleme olmadan panoramik bir görüntü almasına izin göstermektedir. Sonuçlar Örnek 8-10, bilinen bir kusur bir uçuş uyuşuk mutant sinekler, uçuş performansı, vahşi tip Canton-S uçan ile karşılaştırıldığında, Şekil 2 de gösterilmiştir. Kontrolü sürekli bireyler arasında çok az yayılması ve 73 ± 2.0 cm ortalama iniş yüksekliği ile, silindirin üstüne yakın arazi uçar. Buna karşılık, mıymıntı sinekler 44 ± 4.1 cm ortalama, çok daha çeşitli iniş yayılmasını ve önemli ölçüde düşük görüntüler arazi. Bütün sinekler, 3 gün eski, oda sıcaklığında (23 ° C) ile arttırılabilir.

s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 1. Uçuş Test Cihazı, Kamera ve Track Diyagramları. (A) İllüstrasyon güncelleştirilmiş uçuş test için ayarlanmış. Ring 1 90 cm yüksekliğindeki uçuş silindir tutar Standı, Halka 2 huni ve 10 cm uzunluğunda "drop tüp" tutar durun. (B) kamera şeması ve bir panoramik görüntü üretmek için kullanılır izlemez. Kamera merceğinden görünümü engellemekten olmadan parçaya göre desteklenmelidir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Bir örnek uçuş deney Temsilcisi sonuçları. 3 günlük Ca uçuş yeteneği KarşılaştırılmasıChopin-S kontrol mutantlar (slo TS1) Slowpoke uçar. (A) Ekran bireysel sineklerin iniş yükseklikleri görüntüleme mıymıntı ve kontrol sinekler için yakalar. Her daire mavi bir birey sinek konumunu temsil eder. Bu iniş yükseklikleri her genotip için ortalama iniş yüksekliği (B) hem de genel dağılımı (C) hesaplamak için kullanılır. Erkek ve dişi sinekler, her bir numune bir araya toplanmıştır. Hata çubukları ortalamanın standart hata temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan yöntemler kullanılarak, hızla daha önce mümkün olandan daha yüksek verimlilik sağlayan, Drosophila mutantlarının bir sayıda uçuş performansının değerlendirilmesi mümkün olmuştur. Deneyler için, rutin, erkek ve dişileri ayrı ve kanatları zarar verebilir saldırganlığı sınırlamak için düşük yoğunluklu (az 20 sinekler / flakon) onları yükseltmek. Diğer bir önemli husus genetik arka farklılıklardan ötürü uçuş performans farklılıkları için uygun kontrol etmektir. Biz de önce uçuş test karbondioksit ile anestezi kurtarmak için uçar 24 saat en az izin yardımcı olur bulabilirsiniz. Alternatif olarak, sinekler potansiyel davranışını etkileyen olmadan hızlı iyileşme sağlamak için soğuk sıcaklık (4 ° C) maruz anestezi olabilir.

Bu protokolde oran-sınırlayıcı aşama çalışmalar arasındaki plastik levhadan sinekleri kaldırıyor. Etkinliğini geliştirmek için bir yöntem, çok sayıda o kullanmaktıraynı anda f yaprak, bir kenara kullanıldıkları gibi sayfaları ayarlama ve veri toplama aşağıdaki hepsini aynı anda temizlik. Altına düşmek Sinekler bilançolarına dahil olmayacak gibi, elle sayılır gerekir. Yine de, bu elle iniş yüksekliği hesaplama ile karşılaştırıldığında kolaydır. Her yaprağa Tangle-Trap yeniden uygulamak için ihtiyaç kaplama nasıl kalın bağlı olarak değişecektir. Yeni bir kaplama tabi önce bizim deneyim, bireysel bir levha bir ay sürecek.

Mineral yağı içinde dolaştırmak-Trap kullanmanın bir diğer avantajı, tabaka canlı sinekler kurtarmak için yeteneğidir. Sinekler sadece yerine dalmış olma daha Tangle-Trap yüzeyine sopa yana, bireysel sinekler kolayca çıkarılabilir. Altına düşmek "Uçamayan" sinekler de boş şişesi ile mineral yağı tepsiyi değiştirilmesi ile elde edilebilir.

Biz burada açıklanan uçuş davranış otomatik ölçüm bir num sağlar inanıyorumgenetik ekranlar için verim, tekrarlanabilirlik ve doğruluk daha yüksek bir düzeyi için izin önceki yöntemlere göre avantajları ber. Otomatik puanlama ayrıca HALKA deneyde 11 olarak davranış testleri için iş verimini arttırmak için kullanılmıştır. Ayrıca, iniş yükseklik ölçüm doğrudan bize uçuş performansı daha ince farklılıkları algılamasını sağlayan, basit bir geçiş / başarısız ölçümü (% tanıtımlarında, vb.) Daha büyük bir hassasiyet sağlar.

Burada açıklanan tahlil uçuş hızı 12 ve hareket 13 ücretsiz uçuş tepkilerin görsel kontrolü dahil olmak üzere uçuş davranışın daha karmaşık yönlerini ölçmek sonra başka tahlilleri ile tamamlanabilir. Bu testler daha fazla zaman yoğun büyük ölçekli genetik ekranlar ve mükellef değildir, onlar bir lokomotor yanıt belirli bir genin fonksiyonu ile ilgili daha fazla bilgi sağlamak için yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen F32 NS078958 (DTB) ve R01 AG033620 (BG) verir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Putty knife Home Depot 630147 www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x) Home Depot 156469 www.homedepot.com
Furring Strip Board Home Depot 164704 www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap Coating BioControl Network 268941 www.biconet.com
Laptop Computer  Apple www.apple.com/mac/
Mineral oil Fisher Scientific BP26291 www.fishersci.com
White poster board Staples 247403 www.staples.com
Polystyrene weighing dish Fisher Scientific S67091A www.fishersci.com
ImageJ Software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital camera Sony DSC-TX7 www.store.sony.com
Fine forceps Fine Science Tools www.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube) McMaster-Carr 8585K62 www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic) McMaster-Carr 8486K943 www.mcmaster.com
Polycarbonate sheets McMaster-Carr 85585K25 www.mcmaster.com
ring stand (2x) Fisher Scientific S47808 www.fishersci.com
Ring support Fisher Scientific S47791 www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2) Fisher Scientific 05-769-7Q www.fishersci.com
Funnel Fisher Scientific 10-500-3 www.fishersci.com
chain clamps (2x) VWR 21573-275 www.vwr.com
Glass vials VWR 66020-198 www.vwr.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
  2. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
  3. de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
  4. Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
  5. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
  6. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
  7. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
  8. Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
  9. Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
  10. Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
  11. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
  12. Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
  13. Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).

Tags

Davranış Sayı 84, Nörobilim uçuş performansı, yabani-türü uçan
Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Babcock, D. T., Ganetzky, B. An… More

Babcock, D. T., Ganetzky, B. An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila. J. Vis. Exp. (84), e51223, doi:10.3791/51223 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter