Summary
Aquí se describe un método para la medición rápida y exacta de funcionamiento de vuelo en Drosophila, lo que permite detección de alto rendimiento.
Abstract
Drosophila ha demostrado ser un sistema modelo útil para el análisis del comportamiento, incluyendo el vuelo. El probador de vuelo involucrado caída inicial vuela en un aceite recubierto probeta; altura aterrizaje proporciona una medida de la capacidad de vuelo mediante la evaluación de cómo las moscas lejos caerán antes de producir empuje suficiente para hacer contacto con la pared del cilindro. Aquí se describe una versión actualizada del probador de vuelo con cuatro mejoras importantes. En primer lugar, hemos añadido un "tubo de caída" para asegurarse de que todas las moscas entran en el cilindro de vuelo a una velocidad similar entre los ensayos, lo que elimina la variabilidad entre los usuarios. En segundo lugar, hemos sustituido el recubrimiento de aceite con láminas de plástico desmontables revestidos en Maraña-Trap, un adhesivo diseñado para capturar insectos vivos. En tercer lugar, se utiliza un cilindro más largo para permitir la discriminación más precisa de la capacidad de vuelo. En cuarto lugar se utiliza una cámara digital y software de imágenes para automatizar la puntuación de rendimiento de vuelo. Estas mejoras permiten el rapIdentificación, evaluación cuantitativa del comportamiento de vuelo, útil para grandes conjuntos de datos y pantallas de genética a gran escala.
Introduction
Drosophila ha sido utilizado para estudiar la base genética de comportamiento 1, y los investigadores han ideado un número de maneras de analizar varios tipos de conducta 2-6. Las moscas han sido particularmente útil para proporcionar modelos útiles de trastornos neuromusculares 7. Un ensayo común utilizado para estudiar el comportamiento del aparato locomotor es el rendimiento de vuelo. El probador de vuelo original es útil para identificar los vuelos mutantes defectuosos y para la evaluación cuantitativa de la habilidad de vuelo 1, pero tiene varios inconvenientes que limitan su aplicación para las pantallas de alto rendimiento: el uso de cilindros de petróleo recubierto es complicado y engorroso, ciertas características, tales como la longitud del cilindro y la introducción de las moscas en el tubo con fuerza variable a reducir la precisión cuantitativa, y es difícil de recuperar moscas en vivo desde el probador. Para superar estas limitaciones, se ha modificado el probador de vuelo para incluir una serie de mejoras. Hemos añadido una "gota maser "para introducir las moscas para eliminar la variabilidad entre los experimentos y los usuarios. Utilizamos láminas acrílicas removibles recubiertas con un adhesivo que permite la fácil limpieza y recuperación de las moscas individuales. Hemos aumentado la longitud del tubo de vuelo para mejorar la precisión y la fiabilidad cuantitativa. Finalmente , usamos una cámara digital y software de imágenes para calcular las alturas de aterrizaje de moscas. Creemos que estas mejoras sean de utilidad para todos los laboratorios interesados en la realización de cribados genéticos a gran escala para los defectos de funcionamiento de vuelo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ensamble Vuelo Tester
- Secure cilindro vuelo a Anillo de soporte 1 con abrazaderas de cadena. (Deje aproximadamente 3 cm por debajo del cilindro para pesar la cápsula.)
(Nota: El cilindro de vuelo que utilizamos es de 90 cm de largo con un diámetro de 13,5 cm.) - Inserte pesan plato con una fina capa de aceite mineral por debajo del cilindro de vuelo.
- Embudo seguro a Anillo soporte 2 con una abrazadera de anillo y abrazadera de la garra. Ajustar la altura del embudo de modo que el fondo del embudo esté a ras con la parte superior del cilindro de vuelo. (Nota: el diámetro de la punta del embudo debe ser menor que el diámetro exterior de los viales colocados en los tubos de caída de manera que los viales no se caigan a través de.)
- Inserte el tubo de llenado en la parte superior del embudo y fijar con una abrazadera de la garra.
(Nota: Nosotros usamos un tubo de caída que es de 25 cm de largo de Goteo volar-que contiene los viales desde esta altura permite la expulsión constante de todas las moscas con fuerza uniforme El diámetro interior del tubo de caída debe ser sligh..TLY más grande que el diámetro exterior del vial para permitir que el vial a gota libremente.) - Cortar hoja (s) de poliacrilamida al tamaño apropiado. (Nota: Para ayudar en la inserción y extracción de la hoja, la anchura debe ser ligeramente menor que la circunferencia interior del cilindro de vuelo).
- Aplique una capa delgada de Maraña-Trap a la hoja. Deje reposar durante 1 hora antes de su uso. (Nota: Deje suficiente espacio en la parte superior e inferior de la hoja (aproximadamente 3 cm) sin recubrir para agarrar la hoja de inserción / extracción.)
- Inserte la hoja de poliacrilamida en el cilindro de vuelo.
- Montar la pista de cámara utilizando soportes de pino. (Nota: asegúrese de que la parte inferior de la pista se puede apoyar la cámara sin bloquear la lente Consulte la Figura 1B.).
- Añadir tapones y el tornillo en su lugar. (Nota: colocar los tapones en lugares que permitan la cámara para ver la totalidad de la lámina de plástico en el modo panorámico.)
2. Ejecutar Experimento
- <li> Recoger viales de moscas para ensayar. Para obtener los mejores resultados, no use más de 20 moscas / vial.
- Golpee suavemente moscas a fondo del vial, desconecte y luego insertar en el tubo de llenado y suelte vial.
(Nota: El vial se cae el tubo de caída hasta que llega a la apertura estrecho embudo Cuando el vial golpea el embudo, las moscas son expulsados en el cilindro de vuelo.). - Levante el tubo de caída para eliminar el vial vacío.
(Nota: Varios frascos de moscas del mismo grupo de prueba se pueden ensayar en una hoja de poliacrilamida sola Encontramos que hasta 200 moscas (10 viales de 20 moscas cada uno) se pueden probar y tomar imágenes claras en una sola hoja.. - Retire la hoja de plástico y colóquelo en una superficie plana y blanca.
(Nota: cartulina blanca se puede utilizar si las mesas de trabajo son de color oscuro.) - Montar la pista de cámara sobre la lámina de plástico. La cámara debe ser lo suficientemente alta por encima de la hoja de tener la parte superior e inferior de la hoja en el campo de visión.
- Deslice la cámara a lo largo de the pista mientras mantiene pulsado el botón de "captura" para adquirir una imagen panorámica.
- El número de moscas que aterrizan en el aceite puede contarse manualmente para cada ensayo.
- Repetir los pasos 2.2 a 2.7 para todas las condiciones en un experimento dado. Las moscas pueden ser retirados de la hoja entre cada ensayo. Por otra parte, varias hojas se pueden usar, con una hoja nueva para cada ensayo.
3. Recolección de Datos
- Abrir archivos de imagen utilizando el software ImageJ.
- Recorte de imágenes si es necesario para incluir sólo el área de la superficie de aterrizaje. (Esta es la zona recubierta de Maraña-Trap.)
- Convertir imágenes a 8 bits en escala de grises.
- Crear un "umbral" para filtrar el fondo blanco.
(Imagen → Ajuste → Umbral). - Establezca los parámetros para identificar cada vuelo usando el menú de "analizar partículas".
(Analizar → Analizar Partículas) Definir los parámetros utilizados para identificar una partícula. Con nuestra creó, nos encontramos con que el uso de unárea de 5 a 90 pixeles 2 y una circularidad de 0.4-1.0 identificará con precisión todas las muestras. - Medir la ubicación de cada marcha utilizando la lista generada de coordenadas para cada partícula. Coordenada x en píxeles se puede convertir en centímetros para calcular la altura de aterrizaje.
- Importar tabla en una hoja de cálculo (como Microsoft Excel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 1A muestra un esquema del montaje probador de vuelo actualizado. Figura 1B ilustra el diseño de la pista permite la cámara para tomar una imagen panorámica sin bloquear el campo de visión. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2, en el que el rendimiento de vuelo de moscas mutantes Slowpoke, que tienen un vuelo conocido defecto de 8-10, se comparan con los de tipo salvaje Canton-S vuela. Control de moscas aterrizar constantemente cerca de la parte superior del cilindro, con muy poco difundida entre los individuos y una altura media de aterrizaje de 73 ± 2,0 cm. Por el contrario, las moscas Slowpoke muestran una propagación mucho más variada de aterrizaje, y la tierra significativamente menor, con un promedio de 44 ± 4,1 cm. Todas las moscas había 3 días de edad, criados a temperatura ambiente (23 ° C).
s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figura 1. Diagramas de Vuelo Tester, la cámara, y Track. (A) Ilustración de la puesta a punto para la actualización comprobador de vuelo. Anillo de soporte 1, mantiene el cilindro de vuelo de 90 cm de altura; Anillo soporte 2 sostiene el embudo y el 10 cm de largo "tubo de caída". (B) Diagrama de la cámara y la pista utilizada para producir una imagen panorámica. La cámara debe ser apoyado por la pista sin obstruir la vista del objetivo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Los resultados representativos de un experimento de vuelo de muestras. Comparación de la capacidad de vuelo de 3 días de edad CaControl nton-S vuela a Slowpoke mutantes (TS1 SLO). (A) de la pantalla captura de moscas Slowpoke y de control que muestra las alturas de aterrizaje de moscas individuales. Cada círculo azul representa la ubicación de una mosca individual. Estas alturas de aterrizaje se utilizan para calcular la altura media de aterrizaje (B) así como la distribución general (C) para cada genotipo. Moscas machos y hembras se agruparon en cada muestra. Las barras de error representan el error estándar de la media. Haz click aquí para ver la imagen más grande .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utilizando los métodos descritos aquí, hemos sido capaces de evaluar rápidamente el rendimiento de vuelo de un gran número de mutantes de Drosophila, que proporciona una mayor eficiencia que antes. Para nuestros experimentos, separamos rutinariamente a hombres y mujeres y criarlos a baja densidad (menos de 20 moscas / vial) para limitar la agresión que pudiera dañar las alas. Otra consideración importante es controlar adecuadamente las diferencias en el rendimiento de vuelo debido a las diferencias en el fondo genético. También encontramos que ayuda a permitir que las moscas de un mínimo de 24 horas para recuperarse de la anestesia con dióxido de carbono antes de la prueba de vuelo. Alternativamente, las moscas pueden ser anestesiados por la exposición a bajas temperaturas (4 º C) para permitir una recuperación más rápida y sin potencial influencia en el comportamiento.
El paso limitante en este protocolo es la eliminación de las moscas de la lámina de plástico entre los ensayos. Un método para aumentar la eficiencia es el uso de un número grande Ohojas f simultáneamente, dejando de lado las hojas a medida que se utilizan y de limpieza todos a la vez después de la recogida de datos. Las moscas que caen a la parte inferior tendrán que ser contados manualmente, ya que no se incluirán en la hoja. Aún así, esto es fácil en comparación con el cálculo de forma manual la altura de aterrizaje. La necesidad de volver a aplicar Maraña-Trampa a cada hoja puede variar dependiendo del grosor del revestimiento es. En nuestra experiencia, una hoja individual tendrá una duración de un mes antes de que se necesita un nuevo revestimiento.
Una ventaja adicional para el uso de enredo-Trampa sobre el aceite mineral es la capacidad de recuperar moscas vivas de la hoja. Dado que las moscas simplemente se adhieren a la superficie de Maraña-Trap en lugar de sumergirse, moscas individuales se pueden quitar fácilmente. moscas "Flightless" que caen a la parte inferior también se pueden recuperar mediante la sustitución de la bandeja de aceite mineral con un matraz de vacío.
Creemos que la medición automatizada de comportamiento de vuelo descrito aquí proporciona un númeroBER de ventajas sobre los métodos anteriores, lo que permite un mayor nivel de rendimiento, reproducibilidad, y la precisión para pantallas genéticos. Automatizada de puntuación también se ha utilizado para aumentar el rendimiento para los ensayos de comportamiento, tales como el ensayo de anillo 11. Por otra parte, la medida directa de la altura de aterrizaje proporciona una mayor sensibilidad que una simple medición de aprobado / reprobado (% volantes, etc.), Que nos permite detectar diferencias más sutiles en el rendimiento de vuelo.
El ensayo se describe aquí se puede complementar con otras posteriores ensayos que miden los aspectos más complejos de comportamiento de vuelo, incluyendo el control visual de la velocidad de vuelo 12 y las respuestas de vuelo libre al movimiento 13. Aunque estas pruebas son y no se prestan a las pantallas de genética a gran escala más que requiere mucho tiempo, es posible que ayudan a proporcionar más información sobre la función de un gen en particular en una respuesta locomotora.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones F32 NS078958 (DTB) y R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
- Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
