Summary
ここでは、ハイスループットスクリーニングを可能にする、 ショウジョウバエの飛行性能を迅速かつ正確に測定するための方法を記載している。
Abstract
ショウジョウバエは、飛行を含む行動の分析に有用なモデル系であることが証明されている。最初の飛行試験機は、油でコーティングされたにハエを落とす関与メスシリンダーに、着陸の高さは、はるかにハエがシリンダーの壁と接触するために十分な推力を発生する前に落ちるか評価することにより、飛行性能の尺度を提供した。ここでは、4の主要な改善と飛行試験機の更新版について説明します。まず、我々はすべてのハエがユーザー間でのばらつきをなくし、試験間で類似の速度で飛行シリンダーに入ることを保証するために、「落下管」を追加しました。第二に、我々はもつれトラップ、生きた昆虫を捕獲するように設計され、接着剤でコーティングされた取り外し可能なプラスチックシートにオイルコーティングを取り替えた。第三に、我々は、飛翔能力のより正確な識別を可能にするために、より長いシリンダーを使用しています。第四に、我々は飛行性能の採点を自動化するために、デジタルカメラと画像処理ソフトウェアを使用しています。これらの改良は、ラップを可能にID、飛行挙動の定量的評価、大規模なデータセットおよび大規模な遺伝子スクリーニングに便利。
Introduction
ショウジョウバエは、長い行動1の遺伝的基礎を研究するために使用されており、研究者は行動2-6の様々なタイプを分析するための多数の方法を考案した。ハエは、神経筋疾患7の有用なモデルを提供するのに特に有用であった。運動行動を研究するために使用される一般的なアッセイは、飛行性能である。オリジナルの飛行試験機は、飛行欠損変異株を識別するための飛行能力1の定量的評価に有用であるが、それはハイスループットスクリーニングへの応用を制限するいくつかの欠点があります。油でコーティングされたシリンダーの使用は面倒で煩雑であるなどの特定の機能を可変力を有するチューブ内にシリンダとハエの導入の長さは、定量的な精度を低下させると、それは、テスタからのライブハエを回収することは困難である。これらの制限を克服するために、我々は多数の改良を含むように飛行試験を変更している。私たちは、 "ドロップTUを追加しました実験とユーザ間のばらつきを排除するためにハエを導入すること」である。我々は、簡単にクリーンアップし、個々のハエの回復を可能にする接着剤を塗布した取り外し可能なアクリルシートを使用して我々は、定量的な精度と信頼性を向上させるために、飛行管の長さを増加して、最終的に、我々は、ハエの着地高さを計算するために、デジタルカメラと画像処理ソフトウェアを使用しています。我々は、これらの改善は、飛行性能に欠陥のための大規模な遺伝子スクリーニングを実施することに興味の任意の研究室に有用であると考えています。
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Protocol
1。フライトテスターを組み立てる
- リングへの安全な飛行シリンダーチェーンクランプを使用して1スタンド。 （お皿の重量を量るためのシリンダーの下に約3cmのままにしておきます。）
（注：我々が使用する飛行シリンダー13.5センチ、直径90センチです。） - 飛行シリンダーの下にミネラルオイルの薄い層で、皿の重さに挿入します。
- リングへの安全な漏斗をリングクランプを使用して2スタンドとクランプ爪。漏斗の底が飛行シリンダーの上部と同じ高さになるように、漏斗の高さを調整します。 （注：漏斗の先端径は、バイアルが通過落下しないよう、ドロップチューブに入れ、バイアルの外径よりも小さくなければなりません。）
- 漏斗の上に落下管を挿入し、爪クランプを使って固定します。
（注：私たちは、長さ25cmで落下管を使用してこの高さから落下飛ぶ含有するバイアルに均一な力を持つすべてのハエの一貫したインク吐出が可能な落下管の内径はスライでなければなりません。バイアルが自由にドロップできるようにバイアルの外径よりもTLY大きくなります。） - 適当な大きさにポリアクリルアミドシート（S）をカット。 （注：挿入したシートを除去することを助けるために、幅が飛行シリンダの内周面よりも僅かに小さくあるべきである）。
- シートにもつれトラップの薄い層を適用します。使用前に1時間放置することができます。 （注：挿入/除去のためのシートを把握することがコーティングされていないシート（約3cm）の上部と下部に十分な余地を残している）
- 飛行シリンダ内のポリアクリルアミドシートを挿入します。
- 松のサポートブラケットを使用してカメラトラックを組み立てます。 （注：トラックの底部がレンズをブロックすることなく、カメラをサポートできることを確認してください。図1（b）参照。）
- ストッパーを追加し、所定の位置にねじ込みます。 （注：場所をカメラがパノラマモードで、全体のプラスチックシートを表示することができます場所にストッパー。）
2。走行実験
- <李>試験しようとするハエのバイアルを収集します。最良の結果を得るには、せいぜい20ハエ/バイアルを使用しています。
- 優しく落下管とリリースバイアル内に挿入して、抜いて、バイアルの底にハエをタップします。
（注：これは、狭い漏斗開口部に当たるまで、バイアルは、落下管に倒れバイアル漏斗に当たると、ハエは飛行シリンダー内に噴射される。） - 空のバイアルを削除するには落下管を持ち上げます。
（注：同じテストグループのハエの複数のバイアルは、単一のポリアクリルアミドシートにアッセイすることができる私たちは、最大200ハエ（20ハエそれぞれの10バイアル）は一枚のシートでテストされ、容易に画像化することができることがわかります。。 - プラスチックシートを取り外し、平らな白い面に置きます。
（注：ベンチトップが暗色であれば白のポスターボードを使用することができる。） - プラスチックシートの上にカメラトラックを組み立てます。カメラは、視野内のシートの頂部および底部の両方を有するように、シートの上に十分に高くあるべきである。
- 目に沿ってカメラをスライドさせます電子軌道のパノラマ画像を取得する「捕捉」ボタンを押したまま。
- 油に着陸ハエの数は、各試験のために手動でカウントしてもよい。
- 繰り返しは、指定された実験ではすべての条件のための2.2から2.7を繰り返します。ハエは、各試行間のシートから取り外すことができます。あるいは、いくつかのシートを各試験のために新しいシートを、使用することができる。
3。データ収集
- ImageJソフトウェアを使用して開いている画像ファイル。
- クロップ画像は着陸表面積を含める必要がある場合。 （これはもつれトラップにコーティングされた領域です。）
- 8ビットグレースケールに画像を変換します。
- 白い背景をフィルタリングする「しきい値」を作成します。
（画像→→スレッショルドを調整）。 - 「粒子を分析」メニューを使用して、各ハエを識別するためにパラメータを設定します。
粒子を識別するために使用するパラメータを定義します（粒子を分析→分析）。私たちは、セットアップにより、我々は見つけることが使用して5〜90ピクセル2および0.4〜1.0の円形の領域を正確にすべてのサンプルを識別します。 - 各粒子の座標の生成されたリストを使用して、各ハエの位置を測定します。 x座標（ピクセル単位）は、着陸の高さを計算するためにセンチメートルに変換することができる。
- （Microsoft Excelなど）スプレッドシートにテーブルをインポートします。
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Representative Results
図1Aは、更新された飛行試験器アセンブリの概略図を示す。 図1Bは、トラックの設計がカメラの視野を遮断することなく、パノラマ画像を撮影できるように示している。代表的な結果は、欠陥8-10公知のフライトを有するもどかしい変異体ハエの飛行性能は、野生型カントン-Sハエと比較される図2に示されている。コントロールは、一貫して個人間ではほとんど普及して73±2.0 cmで平均着地高さ、円柱の上部付近に土地を飛ぶ。これとは対照的に、 もどかしいハエは44±4.1 cmで平均し、はるかに多様な着陸の広がり、および有意に低い土地が表示されます。全てのハエは、3日齢であった室温（23℃）で調達した。
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図1。飛行試験機、カメラ、トラックのダイアグラム。更新された飛行試験機用に設定（A）のイラスト。リングは1が90 CM-高飛行シリンダーを保持しているスタンド、リングスタンド2は、漏斗と10cmの長い「落下管」を保持している。パノラマ画像を生成するために使用される（B）カメラとトラックのダイアグラム。カメラは、レンズからの眺めを妨げることなく、トラックによってサポートされる必要があります。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。サンプルの飛行実験からの代表的な結果。3日齢のCa飛翔能力の比較NTON-S制御は、変異体（SLOのTS1）をはぐれた人に飛ぶ。 （A）画面は、個々のハエの着地高さを表示しもどかしいし、制御ハエのためにキャプチャします。各青い円は、個々のハエの位置を表しています。これらの着陸高さは、各遺伝子型の平均ランディング高さ（B）、ならびに全体的な分布（C）を計算するために使用される。オスとメスのハエを各サンプルに一緒にプールした。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ここに記載される方法を用いて、我々は、以前に可能であったよりも高い効率を提供し、迅速にショウジョウバエの変異体の多数の飛行性能を評価することができた。我々の実験のために、我々は日常的に男性と女性とを分離し、翼を損傷する可能性が攻撃を制限するために、低濃度（20未満のハエ/バイアル）でそれらを発生させます。もう一つの重要な考慮事項は、遺伝的背景の違いによる飛行性能の違いを適切に制御することです。我々はまた、それが前に飛行試験に二酸化炭素で麻酔から回復するためにハエを24時間の最小値を可能にするために役立ちます見つける。代替的に、ハエは、潜在的行動に影響を与えることなく、迅速な復旧を可能にするために、低温（4℃）への暴露により麻酔してもよい。
このプロトコルの律速段階は、試験間のプラスチックシートからハエを削除しています。効率を増加させる一つの方法は、多数oをを使用することである同時にFシート、それらが使用されているようにシートを確保しておくと、データの収集、次のすべてを一度に清掃。底に落ちたハエは、彼らがシートに含まれませんように、手動でカウントする必要があります。それでも、これは手動で着陸の高さを計算することに比べて容易である。各シートにもつれトラップを再適用する必要があり、コーティングがいかに厚いによって異なります。新しいコーティングが必要になる前に我々の経験では、個々のシートは月続く。
鉱物油の上にもつれトラップを使用して、追加の利点は、シートからのライブハエを回復する能力である。ハエは、単にもつれトラップの表面に付着ではなく、浸漬して以来、個々のハエは、容易に除去することができる。底部に落下」飛べ」ハエはまた、空のフラスコに鉱油トレイを置換することによって回収することができる。
私たちは、ここで説明するの飛行挙動の自動測定のテンキーを提供するものと考えている遺伝子スクリーニングのスループット、再現性、精度の高いレベルを可能にし、従来の方法に比べて利点のBER、。自動化されたスコアリングはまた、RINGアッセイ11として行動アッセイのスループットを増加させるために使用されてきた。また、着陸の高さを直接測定は、私たちは、飛行性能に、より微妙な違いを検出することができるように、簡単な合格/不合格の測定（％チラシなど ）よりも高い感度を提供します。
ここに記載されるアッセイは、視覚的な飛行速度12の制御と運動13に自由飛行応答を含む飛行行動のより複雑な側面を測定、その後のさらなるアッセイによって補完することができます。これらのテストは、より多くの時間がかかり、大規模な遺伝子スクリーニングに適していないが、彼らは運動応答特定の遺伝子の機能に関する詳細な情報を提供するために役立つことがあります。
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Disclosures
著者らは、開示することは、特別の利害関係はありません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていましたF32 NS078958（DTB）とR01 AG033620（BG）が付与されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
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