Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

لتحسين طريقة لقياس دقة وسرعة الأداء في الطيران Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/51223
Automatic Translation
1, 1
1Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

نحن هنا تصف طريقة لقياس سريع ودقيق للأداء الطيران في ذبابة الفاكهة، مما يتيح الفرز الفائق الإنتاجية.

Abstract

وقد ثبت ذبابة الفاكهة ليكون نظام نموذجا مفيدا لتحليل السلوك، بما في ذلك الرحلات الجوية. الأولي اختبار طيران تشارك إسقاط الذباب إلى تخرج المغلفة النفط أسطوانات، شريطة ارتفاع الهبوط مقياسا للأداء الرحلة من خلال تقييم مدى الذباب بعيدا ستسقط قبل إنتاج ما يكفي من التوجه لاجراء اتصالات مع جدار الاسطوانة. نحن هنا تصف إصدار محدث من اختبار الطيران مع أربعة تحسينات كبيرة. الأول، وأضاف لدينا "قطرة أنبوب" لضمان أن جميع الذباب أدخل اسطوانة طيران في سرعة مماثلة بين التجارب، والقضاء على التباين بين المستخدمين. الثانية، ونحن استبدال النفط الطلاء مع الأغطية البلاستيكية القابلة للإزالة المغلفة في تشابك-فخ، لاصقة مصممة لالتقاط الحشرات الحية. الثالثة، ونحن نستخدم اسطوانة أطول لتمكين التمييز أكثر دقة من قدرة الطيران. الرابع نستخدم الكاميرا الرقمية وبرامج التصوير لأتمتة التهديف من أداء الطيران. هذه التحسينات تسمح للالرابالهوية، والتقييم الكمي للسلوك طيران، مفيدة لمجموعات البيانات الكبيرة وشاشات جينية واسعة النطاق.

Introduction

منذ فترة طويلة تستخدم ذبابة الفاكهة لدراسة الأساس الجيني للسلوك 1، وابتكر الباحثون عددا من الطرق لتحليل أنواع مختلفة من السلوك 2-6. كان الذباب مفيدة بشكل خاص في تقديم نماذج مفيدة من الاضطرابات العصبية والعضلية 7. A مقايسة شيوعا التي تستخدم لدراسة السلوك الحركي هو أداء الطيران. اختبار طيران الأصلي هو مفيد لتحديد المسوخ معيبة الطيران وللتقييم الكمي للقدرة طيران 1، لكنه لا يملك العديد من أوجه القصور التي تحد من تطبيقه للشاشات إنتاجية عالية: استخدام اسطوانات المغلفة للنفط هو فوضوي ومرهقة، وميزات معينة مثل طول الاسطوانة وإدخال الذباب في أنبوب مع قوة متغير تقليل الدقة الكمية، وأنه من الصعب استعادة الذباب على الهواء مباشرة من اختبار. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتعديل اختبار طيران لتشمل عددا من التحسينات. واضاف نحن "قطرة توأن "لإدخال الذباب للقضاء على التباين بين التجارب والمستخدمين. نحن نستخدم أوراق الأكريليك القابلة للإزالة المغلفة بمادة لاصقة تسمح لتسهيل تنظيف والانتعاش من الذباب الفردية. لقد زاد طول أنبوب رحلة إلى تحسين دقة وموثوقية الكمي. أخيرا ، ونحن نستخدم كاميرا رقمية وبرامج التصوير لحساب ارتفاعات الهبوط من الذباب، ونحن نعتقد أن هذه التحسينات أن تكون مفيدة لأي مختبر مهتمة في إجراء شاشات جينية واسعة النطاق لعيوب في أداء الطيران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تجميع تستر الطيران

  1. آمنة اسطوانة رحلة الى الدائري قف 1 باستخدام المشابك السلسلة. (اترك حوالي 3 سم أسفل الاسطوانة لوزن الطبق.)
    (ملاحظة: اسطوانة طيران الذي نستعمله هو 90 سنتيمترا وقطره 13.5 سم).
  2. إدراج وزن الطبق مع طبقة رقيقة من الزيت المعدني تحت اسطوانة الطيران.
  3. قمع آمنة لحزام حامل 2 باستخدام المشبك الدائري والمشبك مخلب. ضبط ارتفاع القمع بحيث الجزء السفلي من القمع هو مطاردة مع الجزء العلوي من الاسطوانة الطيران. (ملاحظة: يجب أن يكون قطرها غيض من قمع أقل من القطر الخارجي للقارورة وضعت في أنابيب قطرة بحيث قارورة لا تقع من خلال.)
  4. إدراج قطرة أنبوب في الجزء العلوي من القمع وتأمين استخدام المشبك مخلب.
    (ملاحظة: نحن نستخدم أنبوب قطرة هذا هو طوله 25 سم اسقاط قارورة من هذا الارتفاع يسمح طرد ثابت من كل الذباب مع قوة موحدة تحتوي على ذبابة يجب أن يكون القطر الداخلي للأنبوب قطرة سليغ.أكبر TLY من القطر الخارجي للقارورة للسماح القارورة لإسقاط بحرية.)
  5. قطع ورقة بولكرلميد (ق) إلى الحجم المناسب. (ملاحظة: لمساعدة في إدراج وإزالة ورقة، ويجب أن يكون عرض أصغر قليلا من محيط الداخلي للاسطوانة الطيران).
  6. تطبيق طبقة رقيقة من التشابك-فخ إلى ورقة. السماح للجلوس لمدة 1 ساعة قبل الاستخدام. (ملاحظة: اترك مساحة كافية في الجزء العلوي والسفلي من ورقة (حوالي 3 سم) غير المصقول لفهم ورقة عن الإدراج / إزالة.)
  7. إدراج ورقة بولي أكريلاميد في الاسطوانة الطيران.
  8. تجميع المسار الكاميرا باستخدام الأقواس دعم الصنوبر. (ملاحظة: تأكد من أن الجزء السفلي من المسار يمكن أن تدعم الكاميرا دون عرقلة عدسة ارجع إلى الشكل 1B.)
  9. إضافة سدادات والمسمار في مكانه. (ملاحظة: مكان سدادات في المواقع التي تسمح الكاميرا لعرض ورقة من البلاستيك بالكامل في وضع بانورامية.)

2. تشغيل التجربة

    <لى> جمع قارورة من الذباب لفحصها. للحصول على أفضل النتائج، استخدم ما لا يزيد عن 20 الذباب / القارورة.
  1. اضغط برفق الذباب إلى أسفل القارورة، افصل، ثم تضاف إلى انخفاض أنبوب والافراج القارورة.
    (ملاحظة: قارورة تسقط أنبوب قطرة حتى يضرب افتتاح قمع الضيقة عندما يضرب القارورة القمع، وطرد الذباب في الاسطوانة الرحلة.)
  2. رفع أنبوب قطرة لإزالة قارورة فارغة.
    (ملاحظة: قوارير متعددة من الذباب من نفس المجموعة الاختبار يمكن أن يعاير على ورقة واحدة بولكرلميد نجد أن ما يصل إلى 200 الذباب (10 قارورة من الذباب 20 لكل منهما) ويمكن اختبارها وتصويرها بسهولة على ورقة واحدة.
  3. إزالة ورقة من البلاستيك ووضعه على سطح مستو أبيض.
    (ملاحظة: يمكن استخدام لوحة الملصق الأبيض إذا قمم مقاعد البدلاء هي داكنة اللون.)
  4. تجميع المسار الكاميرا على ورقة من البلاستيك. يجب أن تكون الكاميرا عالية بما فيه الكفاية فوق ورقة لديك كل من أعلى وأسفل الورقة في مجال الرؤية.
  5. حرك الكاميرا على طول الالبريد المسار أثناء الضغط على زر "التقاط" للحصول على صورة بانورامية.
  6. قد تحسب عدد الذباب الهبوط في النفط يدويا لكل المحاكمة.
  7. كرر الخطوات من 2،2-2،7 لجميع الظروف في تجربة معينة. يمكن إزالة الذباب من ورقة بين كل محاكمة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام عدة أوراق، مع ورقة جديدة لكل المحاكمة.

3. جمع البيانات

  1. ملفات الصور المفتوحة باستخدام برنامج ImageJ.
  2. الصور المحاصيل إذا لزم الأمر ليشمل فقط مساحة الهبوط. (وهذا هو المجال المغلفة في تشابك-فخ.)
  3. تحويل الصور إلى 8 بت الرمادي.
  4. إنشاء "عتبة" لتصفية خلفية بيضاء.
    (صورة → → ضبط عتبة).
  5. تعيين المعلمات لتعريف كل الطاير باستخدام "تحليل الجزيئات" القائمة.
    (تحليل → تحليل الجزيئات) تحديد المعايير المستخدمة لتحديد الجسيمات. مع تعيين لدينا ما يصل، نجد أن استخدامسوف مجال 5-90 بكسل 2 ودائرية من 0،4-1،0 تحديد بدقة جميع العينات.
  6. قياس موقع كل الطاير باستخدام قائمة ولدت من الإحداثيات لكل الجسيمات. الإحداثي س بالبكسل يمكن تحويلها إلى سم لحساب ارتفاع الهبوط.
  7. استيراد الجدول إلى جدول بيانات (مثل Microsoft Excel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1A التخطيطي لتجميع اختبار طيران تحديثها. يوضح الشكل 1B تصميم المسار تسمح الكاميرا لالتقاط صورة بانورامية دون عرقلة مجال الرؤية. وتظهر نتائج ممثلة في الشكل 2، حيث من الذباب متحولة الكسول، التي لديها الطيران المعروفة عيب 8-10 أداء الطيران، ويتم مقارنة من نوع البرية كانتون-S الذباب. الذباب تحكم الأرض باستمرار بالقرب من أعلى الأسطوانة، مع انتشار قليلا جدا بين الأفراد وارتفاع هبوط متوسط ​​73 ± 2.0 سم. في المقابل، عرض الذباب الكسول انتشار الهبوط أكثر تنوعا بكثير، والأرض أقل من ذلك بكثير، حيث بلغ متوسطها 44 ± 4.1 سم. كانت كل الذباب 3 أيام القديمة، أثار في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية).

s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الشكل 1. الرسوم البيانية للتستر الطيران، كاميرا، والمسار (أ) توضيحات من إعداد لاختبار طيران تحديثها. حلقة قف 1 يحمل 90 سم ارتفاع اسطوانة طيران؛ الدائري الوقوف 2 تتولى قمع و10 سم طويلة "قطرة أنبوب". (ب) رسم تخطيطي للكاميرا وتتبع استخدامها لإنتاج صورة بانورامية. وينبغي دعم الكاميرا عن طريق المسار دون عرقلة وجهة نظر من العدسة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. نتائج ممثلة من تجربة طيران العينة. مقارنة من الكالسيوم لمدة 3 أيام القديمة قدرة طيرانالسيطرة NTON-S تسير رحلات الى السلحفائي المسوخ (سلوفاكيا TS1). (أ) يلتقط الشاشة لالذباب الكسول والسيطرة عرض مرتفعات الهبوط من الذباب الفردية. يمثل كل دائرة زرقاء موقع ذبابة الفردية. وتستخدم تلك المرتفعات الهبوط لحساب ارتفاع متوسط ​​الهبوط (B)، وكذلك التوزيع العام (C) لكل الوراثي. وكان يتم تجميع الذباب الذكور والإناث معا في كل عينة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باستخدام أساليب وصفها هنا، كنا قادرين على تقييم سريع لعدد كبير من المسوخ ذبابة الفاكهة أداء الطيران، وتوفير كفاءة أكبر مما كان ممكنا في السابق. لتجاربنا، ونحن بشكل روتيني فصل الذكور والإناث ورفع لهم في منخفض الكثافة (أقل من 20 الذباب / القارورة) للحد من العدوان الذي يمكن ان يلحق الضرر الأجنحة. هناك اعتبار آخر مهم هو السيطرة بشكل صحيح لاختلافات في أداء الطيران بسبب الاختلافات في الخلفية الوراثية. نجد أيضا أنه يساعد على السماح الذباب ما لا يقل عن 24 ساعة للتعافي من التخدير مع ثاني أكسيد الكربون قبل اختبار الطيران. بدلا من ذلك، قد يتم تخدير الذباب عن التعرض لدرجات الحرارة الباردة (4 ° C) للسماح للانتعاش أسرع دون التأثير على سلوك يحتمل.

الخطوة معدل الحد في هذا البروتوكول وإزالة الذباب من ورقة من البلاستيك بين التجارب. أسلوب واحد لزيادة الكفاءة في استخدام عدد كبير سورقة و في وقت واحد، ووضع جانبا الأوراق أنها تستخدم وتنظيفها في كل مرة بعد جمع البيانات. سوف الذباب التي تقع إلى أسفل يجب أن تحسب يدويا، كما أنها لن تكون واردة في الورقة. لا يزال، وهذا أمر سهل مقارنة مع حساب ارتفاع الهبوط يدويا. فإن الحاجة إلى إعادة تطبيق تشابك-مصيدة لكل ورقة تختلف اعتمادا على كيفية سميكة من الطلاء هو. في تجربتنا، فإن ورقة الفردية آخر قبل شهر هناك حاجة إلى طلاء جديد.

ميزة إضافية لاستخدام التشابك-فخ أكثر من الزيوت المعدنية هي القدرة على استعادة الذباب على الهواء مباشرة من ورقة. منذ الذباب ببساطة عصا على سطح تشابك-فخ بدلا من أن تصبح مغمورة، الذباب الفردية يمكن إزالتها بسهولة. ويمكن أيضا الذباب "يطير" التي تقع إلى أسفل يمكن استردادها عن طريق استبدال علبة الزيوت المعدنية مع قارورة فارغة.

نعتقد قياس الآلي للسلوك طيران الموصوفة هنا يوفر الأسطواناتالبر من المزايا على الطرق السابقة، والسماح لمستوى أعلى من الإنتاجية، استنساخ، والدقة للشاشات الوراثية. كما تم استخدام التهديف الآلي لزيادة الإنتاجية لفحوصات السلوكية مثل مقايسة RING 11. وعلاوة على ذلك، فإن القياس المباشر من ارتفاع الهبوط يوفر حساسية أكبر من مجرد تمرير / تفشل القياس (منشورات٪، الخ.)، مما يسمح لنا للكشف عن الاختلافات أكثر دهاء في أداء الطيران.

ويمكن استكمال الفحص وصفها هنا من قبل المقايسات مزيد اللاحقة التي تقيس جوانب أكثر تعقيدا من السلوك الطيران، بما في ذلك المراقبة البصرية من سرعة الطيران 12 و استجابات رحلة مجانية إلى حركة 13. في حين أن هذه الاختبارات هي أكثر وغير قابلة للشاشات جينية واسعة النطاق كثيفة الوقت، فإنها قد تساعد على توفير مزيد من المعلومات حول وظيفة جين معين في استجابة الحركي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح F32 NS078958 (DTB) وR01 AG033620 (BG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Putty knife Home Depot 630147 www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x) Home Depot 156469 www.homedepot.com
Furring Strip Board Home Depot 164704 www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap Coating BioControl Network 268941 www.biconet.com
Laptop Computer  Apple www.apple.com/mac/
Mineral oil Fisher Scientific BP26291 www.fishersci.com
White poster board Staples 247403 www.staples.com
Polystyrene weighing dish Fisher Scientific S67091A www.fishersci.com
ImageJ Software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital camera Sony DSC-TX7 www.store.sony.com
Fine forceps Fine Science Tools www.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube) McMaster-Carr 8585K62 www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic) McMaster-Carr 8486K943 www.mcmaster.com
Polycarbonate sheets McMaster-Carr 85585K25 www.mcmaster.com
ring stand (2x) Fisher Scientific S47808 www.fishersci.com
Ring support Fisher Scientific S47791 www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2) Fisher Scientific 05-769-7Q www.fishersci.com
Funnel Fisher Scientific 10-500-3 www.fishersci.com
chain clamps (2x) VWR 21573-275 www.vwr.com
Glass vials VWR 66020-198 www.vwr.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
  2. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
  3. de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
  4. Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
  5. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
  6. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
  7. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
  8. Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
  9. Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
  10. Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
  11. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
  12. Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
  13. Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).

Tags

السلوك، العدد 84،
لتحسين طريقة لقياس دقة وسرعة الأداء في الطيران<em&gt; ذبابة الفاكهة</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Babcock, D. T., Ganetzky, B. An… More

Babcock, D. T., Ganetzky, B. An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila. J. Vis. Exp. (84), e51223, doi:10.3791/51223 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter