Summary
Здесь мы опишем метод для быстрого и точного измерения летно у дрозофилы, что позволяет высокопроизводительного скрининга.
Abstract
Drosophila оказалась полезной моделью система для анализа поведения, в том числе полет. Первоначальный тестер полета участие понижение летит в масло покрытием мерный цилиндр, высота посадки условии меру летно путем оценки, как далеко летит упадет перед производить достаточный толчок, чтобы вступить в контакт со стенкой цилиндра. Здесь мы опишем обновленную версию тестера полета с четырьмя основными улучшений. Во-первых, мы добавили "в раскрывающемся трубку", чтобы гарантировать, что все мухи введите полета цилиндр на аналогичной скорости между испытаниями, устраняя изменчивость между пользователями. Во-вторых, мы заменили масло покрытие со съемными пластиковыми листами, покрытыми в Tangle-Trap, Клей, предназначенный для захвата живых насекомых. В-третьих, мы используем более длительный цилиндр для обеспечения более точную дискриминацию способности полета. В-четвертых, мы используем цифровую камеру и обработки изображений для автоматизации счет производительности полета. Эти усовершенствования позволяют рэпID, количественная оценка поведения полета, полезно для больших наборов данных и крупномасштабных генетических экранов.
Introduction
Дрозофилы уже давно используется для изучения генетической основы поведения 1, и исследователи разработали ряд способов анализа различных типов поведения 2-6. Мухи были особенно полезны в предоставлении полезные модели нервно-мышечных расстройств 7. Общий анализ используется для изучения поведения двигательную является летно-технические характеристики. Оригинальный тестер полет полезны для определения летных дефектных мутантов и для количественной оценки полета способности 1, но у него есть несколько недостатков, которые ограничивают его применение для экранов высокой пропускной: использование цилиндров покрытых нефтью является грязным и громоздким, некоторые функции, такие как длина цилиндра и введение летит в трубке с переменной силы уменьшить количественный точность и трудно восстановить живые мух от тестера. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы изменили тестер полета включить ряд усовершенствований. Мы добавили "падение Тубыть "ввести мух для устранения изменчивости между экспериментами и пользователей. Мы используем съемные акриловые листы, покрытые клеем, что облегчает очистку и восстановление отдельных мух. Мы увеличили продолжительность полета трубки улучшить количественную точность и надежность. Наконец , мы используем цифровую камеру и обработки изображений для вычисления высоты посадки мух. Мы считаем, что эти улучшения будут полезны для любой лаборатории, заинтересованных в проведении широкомасштабных генетических экраны для дефектов в летных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Соберите Flight тестер
- Безопасный цилиндр рейс в кольцо Стенд 1 с помощью цепи зажимов. (Оставьте примерно на 3 см. под цилиндром для взвешивания блюдо.)
(Примечание: Полет цилиндр мы используем длиной 90 см, диаметром 13,5 см.) - Вставка весить блюдо тонким слоем минерального масла под полета цилиндра.
- Безопасный воронка в кольцо Стенд 2 с использованием кольцевой зажим и коготь зажим. Отрегулировать высоту воронки так, что дно воронки находится на одном уровне с верхней части полета цилиндра. (Примечание: Диаметр наконечника воронки должен быть меньше наружного диаметра пробирки помещают в вертикальных трубок, так что пузырьки не будет падать до конца.)
- Вставка падение трубку в верхней части воронки и закрепить с помощью кулачковой зажим.
(Примечание: Мы используем падение трубку, которая длиной 25 см Падение летать содержащих флаконов с этой высоты позволяет последовательно выброс всех мух с равномерным силу Внутренний диаметр раскрывающегося трубки должны быть Слай..TLY больше наружного диаметра пузырька, чтобы позволить флакон свободно падать.) - Вырезать полиакриламидном лист (ы) для надлежащего размера. (Примечание: Для помощи в установке и извлечении листа, ширина должна быть немного меньше, чем внутренний окружности цилиндра полета).
- Нанесите тонкий слой Tangle-Trap к листу. Разрешить сидеть в течение 1 часа перед использованием. (Примечание: должно быть достаточно места в верхней и нижней части листа (приблизительно 3 см) без покрытия понять лист для вставки / удаления.)
- Вставьте полиакриламидном лист в полете цилиндра.
- Соберите камеры дорожку при помощи поддержки сосна скобки. (Примечание: гарантировать, что в нижней части дорожки может поддерживать камеру без блокировки объектива см. фиг.1В.).
- Добавить пробки и винтовые на место. (Примечание: Место фиксаторы в местах, которые позволят камере, чтобы просмотреть весь пластиковый лист в панорамном режиме.)
2. Запустите эксперимент
- <литий> Сбор флаконов мух, которые будут проверены. Для получения наилучших результатов используйте не более 20 Мухи / флакон.
- Слегка постучите мух в нижней части флакона, отключите, а затем вставьте в вертикальную трубку и отпустите флакон.
(Примечание: Флакон падает в раскрывающемся трубку, пока она не попадает в узкое отверстие воронки Когда флакон попадает в воронку, мухи вылетают в полете цилиндра..) - Поднимите падение трубку для удаления пустой флакон.
(Примечание: Несколько флаконов мух той же тестовой группы могут быть проанализированы на одном листе полиакриламидном Мы считаем, что до 200 мух (10 флаконов по 20 мух каждый) могут быть проверены и отображаемого легко на одном листе.. - Снимите пластиковый лист и положите его на ровную белую поверхность.
(Примечание: белый плакат доска может использоваться, если скамейка топы темного цвета.) - Соберите камеры трек по пластиковым листом. Камера должна быть достаточно высоко над листом иметь и верхнюю и нижнюю часть листа в поле зрения.
- Вставьте камеру вдоль гоэ трек, удерживая кнопку «захват», чтобы приобрести панорамное изображение.
- Количество мух посадки в масле может быть засчитана вручную для каждого суда.
- Повторите шаги 2.2-2.7 для всех условий в данном эксперименте. Мухи могут быть удалены из листа между каждым испытанием. Кроме того, несколько листов могут быть использованы, с новым листа для каждого испытания.
3. Сбор данных
- Открытые файлы изображений с использованием ImageJ программного обеспечения.
- Кадрирование изображений, если необходимо включить только площадь поверхности посадки. (Это область покрытие Tangle-Trap.)
- Преобразование изображения в 8-битные оттенки серого.
- Создать "Threshold", чтобы отфильтровать белый фон.
(Изображение → Настройка → Порог). - Установите параметры для идентификации каждого муху с помощью меню "проанализировать частицы".
(Анализ → Анализ частиц) Определите параметры, используемые для идентификации частицу. С нашей установки, мы находим, что с помощьюплощадь 5-90 пикселей 2 и округлости 0,4-1,0 будет точно идентифицировать все образцы. - Измерение местоположение каждого лету с использованием сгенерированного список координат для каждой частицы. X-координата в пикселах могут быть преобразованы в сантиметрах для вычисления высоты посадки.
- Импорт таблицы в таблицу (например, Microsoft Excel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1А показана схема обновленной сборке тестера полета. Рис. 1В иллюстрирует дизайн трек позволяет фотокамере взять панорамное изображение, не блокируя поле зрения. Представитель результаты показаны на рисунке 2, где летные характеристики тугодум мутантных мух, которые имеют известный полет дефект 8-10, которые по сравнению с дикого типа Canton-S летит. Контроль летит последовательно посадку в верхней части цилиндра, с очень небольшим распространения между людьми и средней высотой посадки 73 ± 2,0 см. В противоположность этому, тугодум мухи отображения гораздо более разнообразны посадки распространение, и землю значительно ниже, в среднем 44 ± 4,1 см. Все полеты были 3 дней, поднял при комнатной температуре (23 ° C).
s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 1. Схемы полетов Tester, камеры, и Track. (А) Иллюстрация создана для обновленного тестера полета. Кольцо Стенд 1 удерживает 90 см-высокого полета цилиндр; Кольцо Стенд 2 держит воронку и 10 см длиной "в раскрывающемся трубку". (В) Схема камеры и трек используется для производства панорамное изображение. Камера должна быть поддержана трассе без препятствуя при этом вид от объектива. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Представитель результаты от эксперимента образец полета. Сравнение способности полета в 3-дневный старой Caконтроль NTON-S летит в тугодум мутантов (СЛО tS1). (А) Экран фиксирует для тугодум и контроля мух отображения высот посадки отдельных мух. Каждый синий круг представляет местоположение индивидуального лету. Эти посадки высоты используются для расчета среднюю высоту посадки (B), а также общее распределение (C) для каждого генотипа. Мужские и женские мухи были объединены вместе в каждом образце. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя методы, описанные здесь, мы смогли быстро оценить летные характеристики большого числа Drosophila мутантов, обеспечивая большую эффективность, чем это было возможно ранее. Для наших экспериментов мы регулярно отделить самцов и самок и поднять их при низкой плотности (менее 20 мух / флаконе), чтобы ограничить агрессию, которые могут повредить крылья. Еще одним важным фактором является правильно контролировать различия в летно вследствие различий в генетическом фоне. Мы также считаем, что это помогает, чтобы мухи не менее 24 часов, чтобы оправиться от наркоза с диоксидом углерода до летных испытаний. Кроме того, мухи могут быть под наркозом под воздействием низкой температуры (4 ° C), чтобы позволить для более быстрого восстановления без потенциально влияющие на поведение.
Лимитирующей стадией в этом протоколе является удаление мух из пластикового листа между испытаний. Один из способов повышения эффективности является использование большого количества Oе листов одновременно, отложив в сторону листы, как они используются и очистки их все сразу следующее сбора данных. Мухи, которые попадают на дно необходимо будет пересчитать вручную, так как они не будут включены на листе. Тем не менее, это легко по сравнению с вручную расчета высоты посадки. Необходимость повторно запутывать-Trap для каждого листа будет варьироваться в зависимости от толщины покрытия. По нашему опыту, отдельный лист продлится месяц до новое покрытие не требуется.
Дополнительным преимуществом использования Tangle-Trap над минерального масла является способность к восстановлению живые мух от листа. Так как мухи просто придерживаться поверхности Tangle-Trap, а не погружаясь, индивидуальные мухи могут быть легко удалены. "Нелетающие" мухи, которые падают на дно также могут быть восстановлены путем замены лоток минерального масла с пустой колбе.
Мы считаем, что автоматическое измерение поведения полета, описанной здесь обеспечивает питBER преимуществ по сравнению с предыдущими методами, что позволяет более высокий уровень пропускной способности, воспроизводимости и точности для генетических экранов. Автоматизированная скоринг также используется для увеличения пропускной способности для поведенческих тестах, таких как кольца анализа 11. Кроме того, прямое измерение высоты посадки обеспечивает большую чувствительность, чем простой Pass / Fail измерения (% листовок и др.), Что позволяет нам обнаружить более тонкие различия в летно.
Анализ, описанный здесь может быть дополнена последующими дальнейших анализов, которые измеряют более сложные аспекты поведения полета, в том числе визуального контроля скорости полета 12 и ответов свободного полета в движении 13. Хотя эти тесты более временных затрат и не поддаются крупномасштабных генетических экранов, они могут помочь предоставить больше информации о функции конкретного гена в ответ опорно-двигательного аппарата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья предоставляет F32 NS078958 (DTB) и R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
- Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
