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Biology

उड़ान प्रदर्शन का सही और तेजी से मापन के लिए एक बेहतर तरीका में Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/51223
Automatic Translation
1, 1
1Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

यहाँ हम उच्च throughput प्रदर्शन को सक्षम करने, ड्रोसोफिला में उड़ान प्रदर्शन के लिए तेजी से और सही माप के लिए एक विधि का वर्णन.

Abstract

ड्रोसोफिला उड़ान सहित व्यवहार के विश्लेषण के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली, साबित हो गया है. प्रारंभिक उड़ान परीक्षक शामिल छोड़ने में मक्खियों एक तेल में लिपटे सिलेंडर स्नातक, लैंडिंग ऊंचाई सिलेंडर की दीवार के साथ संपर्क बनाने के लिए जोर पर्याप्त उत्पादन से पहले दूर मक्खियों गिर जाएगी कैसे आकलन करने से उड़ान प्रदर्शन का एक उपाय प्रदान की है. यहाँ हम चार प्रमुख सुधार के साथ उड़ान परीक्षक का एक अद्यतन संस्करण का वर्णन. सबसे पहले, हम सब मक्खियों उपयोगकर्ताओं के बीच परिवर्तनशीलता को नष्ट करने, परीक्षणों के बीच एक समान वेग पर उड़ान सिलेंडर में प्रवेश सुनिश्चित करना है कि एक "ड्रॉप ट्यूब" गयी. दूसरा, हम उलझन से जाल, लाइव कीड़ों को पकड़ने के लिए बनाया गया एक चिपकने वाला में लेपित हटाने योग्य प्लास्टिक शीट के साथ तेल कोटिंग बदल दिया. तीसरा, हम उड़ान क्षमता का अधिक सटीक भेदभाव सक्षम करने के लिए एक लंबे समय तक सिलेंडर का उपयोग करें. चौथा हम उड़ान प्रदर्शन की स्कोरिंग स्वचालित करने के लिए एक डिजिटल कैमरा और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. इन सुधारों रैप के लिए अनुमतिआईडी, उड़ान व्यवहार के गुणात्मक मूल्यांकन, बड़े डेटासेट और बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन के लिए उपयोगी.

Introduction

ड्रोसोफिला लंबे व्यवहार 1 के आनुवंशिक आधार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और शोधकर्ताओं व्यवहार 2-6 की विभिन्न प्रकार का विश्लेषण करने के तरीकों की एक संख्या तैयार कर लिया है. मक्खियों neuromuscular विकारों 7 के उपयोगी मॉडल उपलब्ध कराने में विशेष रूप से उपयोगी किया गया है. हरकत व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक आम परख उड़ान प्रदर्शन है. मूल उड़ान परीक्षक उड़ान दोषपूर्ण म्यूटेंट की पहचान करने के लिए और उड़ान क्षमता 1 की मात्रात्मक आकलन के लिए उपयोगी है, लेकिन यह उच्च throughput स्क्रीन के लिए अपने आवेदन की सीमा है कि कई कमियों है: तेल में लिपटे सिलेंडरों के उपयोग गंदा और बोझिल है, जैसे कुछ विशेषताएं चर बल के साथ ट्यूब में सिलेंडर और मक्खियों की शुरूआत की लंबाई मात्रात्मक सटीकता को कम करने, और यह परीक्षक से लाइव मक्खियों को ठीक करने के लिए मुश्किल है. इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम सुधार के एक नंबर शामिल करने के लिए उड़ान परीक्षक को संशोधित किया है. हम एक "ड्रॉप तू गयीहम आसान सफाई और व्यक्तिगत मक्खियों की वसूली के लिए अनुमति देता है कि एक चिपकने के साथ लेपित हटाने योग्य ऐक्रेलिक शीट का उपयोग प्रयोगों और उपयोगकर्ताओं के बीच परिवर्तनशीलता को खत्म करने के लिए मक्खियों को पेश करने के लिए "हो.. हम मात्रात्मक सटीकता और विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए उड़ान ट्यूब की लंबाई में वृद्धि हुई है. अंत , हम एक डिजिटल कैमरा और मक्खियों की लैंडिंग ऊंचाइयों की गणना करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. हम इन सुधारों उड़ान प्रदर्शन में दोष के लिए बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन के संचालन में रुचि किसी भी प्रयोगशाला के लिए उपयोगी हो जाएगा.

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Protocol

1. फ्लाइट परीक्षक इकट्ठा

  1. अंगूठी को सुरक्षित उड़ान सिलेंडर श्रृंखला clamps का उपयोग 1 खड़े हो जाओ. (पकवान तौलना के लिए सिलेंडर के नीचे लगभग 3 सेमी छोड़ दें.)
    (नोट: उपयोग हम उड़ान सिलेंडर 13.5 सेमी की एक व्यास के साथ 90 सेमी लंबा है.)
  2. उड़ान सिलेंडर के नीचे खनिज तेल की एक पतली परत के साथ पकवान तौलना डालें.
  3. अंगूठी को सुरक्षित कीप एक अंगूठी दबाना और पंजा दबाना का उपयोग कर 2 खड़े हो जाओ. चिमनी के नीचे उड़ान सिलेंडर के ऊपर से भरा है कि इतनी कीप की ऊंचाई समायोजित करें. (नोट: कीप की नोक व्यास शीशियों के माध्यम से गिर नहीं होगा कि इतना बूंद ट्यूबों में रखा शीशियों के बाहरी व्यास से कम होना चाहिए.)
  4. कीप के शीर्ष में ड्रॉप ट्यूब डालें और एक पंजा दबाना का उपयोग कर सुरक्षित.
    (नोट: हम 25 सेमी लंबा है कि एक बूंद ट्यूब का उपयोग गिराने के लिए उड़ान भरने वाले एक समान बल के साथ सभी मक्खियों की लगातार इंजेक्शन की अनुमति देता है इस ऊंचाई से शीशियों बूंद ट्यूब के भीतरी व्यास Sligh होना चाहिए..शीशी स्वतंत्र रूप से ड्रॉप करने के लिए अनुमति देने के लिए शीशी के बाहरी व्यास से TLY बड़ा.)
  5. उचित आकार के लिए polyacrylamide शीट (ओं) में कटौती. (नोट: डालने और चादर को दूर करने में सहायता करने के लिए, चौड़ाई उड़ान सिलेंडर की आंतरिक परिधि से थोड़ा छोटा होना चाहिए).
  6. चादर को उलझन से ट्रैप की एक पतली परत लागू करें. उपयोग से पहले 1 घंटे के लिए बैठने की अनुमति. (नोट: शीट के ऊपर और नीचे प्रविष्टि / हटाने के लिए चादर काबू करने के लिए uncoated (लगभग 3 सेमी) में पर्याप्त जगह छोड़ें.)
  7. उड़ान सिलेंडर में polyacrylamide चादर डालें.
  8. पाइन समर्थन कोष्ठक का उपयोग कैमरा ट्रैक इकट्ठे. (नोट: ट्रैक के नीचे लेंस अवरुद्ध बिना कैमरे का समर्थन कर सकते हैं कि यह सुनिश्चित चित्रा 1 बी को देखें.).
  9. Stoppers जोड़ें और जगह में पेंच. (नोट: जगह कैमरा नयनाभिराम मोड में पूरे प्लास्टिक शीट को देखने के लिए अनुमति देगा स्थानों में stoppers.)

2. प्रयोग चलाने

    <ली> परीक्षण किया जाना मक्खियों की शीशियों लीजिए. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, कोई 20 से अधिक मक्खियों / शीशी का उपयोग करें.
  1. धीरे शीशी के नीचे करने के लिए मक्खियों नल, हाल चलाना, तब ड्रॉप ट्यूब में डालें और शीशी जारी.
    (नोट: यह संकीर्ण कीप उद्घाटन हिट जब तक शीशी बूंद ट्यूब नीचे गिर जाता शीशी कीप हिट, मक्खियों उड़ान सिलेंडर में अलग हो रहे हैं..)
  2. खाली शीशी को दूर करने के लिए ड्रॉप ट्यूब उठा.
    (नोट: ही परीक्षण समूह की मक्खियों के कई शीशियों एक एकल polyacrylamide चादर पर assayed किया जा सकता है हम 200 से ऊपर मक्खियों (20 मक्खियों प्रत्येक की 10 शीशियों) एक पत्रक पर परीक्षण किया और आसानी से imaged किया जा सकता हैं..
  3. प्लास्टिक शीट निकालें और एक फ्लैट सफेद सतह पर जगह है.
    (नोट: बेंच सबसे ऊपर रंग का अंधेरा हो अगर सफेद पोस्टर बोर्ड का उपयोग किया जा सकता है.)
  4. प्लास्टिक शीट पर कैमरा ट्रैक इकट्ठे. कैमरा देखने के क्षेत्र में चादर के ऊपर और नीचे दोनों की चादर के ऊपर उच्च पर्याप्त होना चाहिए.
  5. वें के साथ कैमरा स्लाइडई ट्रैक एक नयनाभिराम छवि प्राप्त करने के लिए "कब्जा" बटन दबाए हुए.
  6. तेल में उतरने मक्खियों की संख्या प्रत्येक परीक्षण के लिए मैन्युअल रूप से गिना जा सकता है.
  7. दोहराएँ एक भी प्रयोग में सभी स्थितियों के लिए 2.2-2.7 कदम. मक्खियों प्रत्येक परीक्षण के बीच चादर से हटाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, कई चादरें प्रत्येक परीक्षण के लिए एक नया पत्र के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. डेटा संग्रह

  1. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खुला छवि फ़ाइलें.
  2. फसल छवियों केवल लैंडिंग सतह क्षेत्र शामिल करने के लिए यदि आवश्यक हो तो. (इस उलझन से जाल में लेपित क्षेत्र है.)
  3. 8 बिट स्केल करने के लिए छवियों कन्वर्ट.
  4. सफेद पृष्ठभूमि बाहर फिल्टर करने के लिए एक "सीमा" बनाएँ.
    (छवि → → दहलीज समायोजित).
  5. "कणों का विश्लेषण" मेनू का उपयोग कर प्रत्येक मक्खी की पहचान करने के लिए मानकों सेट.
    एक कण की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता मानकों को परिभाषित (कण विश्लेषण → विश्लेषण). हमारे सेट अप के साथ, हम पाते हैं कि एक का उपयोग5-90 पिक्सल 2 और 0.4-1.0 का एक घेरा के क्षेत्र सही सभी नमूनों की पहचान करेगा.
  6. प्रत्येक कण के लिए निर्देशांक के उत्पन्न सूची का उपयोग कर प्रत्येक मक्खी के स्थान उपाय. पिक्सल में एक्स समन्वय लैंडिंग ऊंचाई की गणना करने सेंटीमीटर करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है.
  7. (जैसे माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल के रूप में) एक स्प्रेडशीट में तालिका आयात करें.

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Representative Results

चित्रा 1 ए अद्यतन उड़ान परीक्षक विधानसभा का एक योजनाबद्ध दिखाता है. चित्रा 1 बी ट्रैक डिजाइन कैमरा देखने के क्षेत्र अवरुद्ध बिना एक नयनाभिराम छवि लेने के लिए अनुमति दिखाता है. प्रतिनिधि परिणाम दोष 8-10 एक ज्ञात उड़ान है जो मूर्ख उत्परिवर्ती मक्खियों की उड़ान प्रदर्शन, जंगली प्रकार कैंटन-S मक्खियों की तुलना कर रहे हैं, जहां चित्रा 2 में दिखाया गया है. नियंत्रण लगातार व्यक्तियों के बीच बहुत थोड़ा प्रसार और 73 ± 2.0 सेमी की एक औसत लैंडिंग ऊंचाई के साथ, सिलेंडर के शीर्ष के पास भूमि मक्खियों. इसके विपरीत, मूर्ख मक्खियों 44 ± 4.1 सेमी औसतन, एक बहुत अधिक विभिन्न लैंडिंग प्रसार, और काफी कम भूमि प्रदर्शित करते हैं. सब मक्खियों, 3 दिन पुराने थे कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर उठाया.

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चित्रा 1. की फ्लाइट परीक्षक, कैमरा, और ट्रैक का चित्र. (ए) चित्रण अद्यतन उड़ान परीक्षक के लिए निर्धारित किया है. अंगूठी 1 90 सेमी ऊंची उड़ान सिलेंडर धारण स्टैंड, अंगूठी 2 कीप और 10 सेमी लंबे "ड्रॉप ट्यूब" धारण खड़े हो जाओ. (बी) कैमरा के चित्र और एक मनोरम छवि का उत्पादन किया जाता ट्रैक. कैमरे के लेंस से देखने में बाधा डालने के बिना ट्रैक समर्थन किया जाना चाहिए. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. एक नमूना उड़ान प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम है. 3 दिन पुराने सीए की उड़ान क्षमता की तुलनाnton-S नियंत्रण म्यूटेंट (SLO TS1) मूर्ख के लिए मक्खियों. (ए) स्क्रीन व्यक्तिगत मक्खियों की लैंडिंग ऊंचाइयों प्रदर्शित मूर्ख और नियंत्रण मक्खियों के लिए कब्जा. प्रत्येक ब्लू सर्किल एक व्यक्ति मक्खी के स्थान का प्रतिनिधित्व करता है. ये लैंडिंग ऊंचाइयों प्रत्येक जीनोटाइप के लिए औसत लैंडिंग ऊंचाई (बी) के साथ ही समग्र वितरण (सी) की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. नर और मादा मक्खियों प्रत्येक नमूने में एक साथ जमा किए गए. त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ वर्णित विधियों का प्रयोग, हम तेजी से संभव पहले से कहीं अधिक दक्षता प्रदान करने, ड्रोसोफिला म्यूटेंट की एक बड़ी संख्या के लिए उड़ान के प्रदर्शन का आकलन करने में सक्षम है. हमारे प्रयोगों के लिए, हम नियमित रूप से पुरुषों और महिलाओं को अलग किया और पंखों को नुकसान पहुंचा सकता है कि आक्रामकता की सीमा को कम घनत्व (कम से कम 20 मक्खियों / शीशी) में उन्हें बढ़ा. एक अन्य महत्वपूर्ण विचार आनुवंशिक पृष्ठभूमि में मतभेद के कारण उड़ान प्रदर्शन में अंतर के लिए ठीक से नियंत्रित करने के लिए है. हम भी यह पिछले उड़ान परीक्षण करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के साथ anesthetization से उबरने के लिए मक्खियों 24 घंटा का एक न्यूनतम अनुमति देने के लिए मदद करता है. वैकल्पिक रूप से, मक्खियों संभावित व्यवहार को प्रभावित किए बिना तेजी से वसूली के लिए अनुमति देने के लिए ठंडे तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए जोखिम के anesthetized किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में दर सीमित कदम परीक्षणों के बीच प्लास्टिक शीट से मक्खियों को दूर किया जाता है. क्षमता बढ़ाने के लिए एक विधि एक बड़ी संख्या में ओ उपयोग करने के लिए हैएक साथ एफ चादरें, एक तरफ वे उपयोग किया जाता है के रूप में चादरें सेटिंग और डेटा संग्रह के बाद उन्हें एक बार में सभी सफाई. नीचे तक गिर मक्खियों कि वे चादर पर शामिल नहीं किया जाएगा, जैसा कि मैन्युअल रूप से गिना जा करने की आवश्यकता होगी. फिर भी, इस मैन्युअल लैंडिंग ऊंचाई की गणना के साथ तुलना में आसान है. प्रत्येक चादर को उलझन से जाल को फिर से लागू करने की जरूरत कोटिंग है कैसे मोटी के आधार पर अलग अलग होंगे. एक नई कोटिंग की जरूरत है इससे पहले कि हमारे अनुभव में, एक व्यक्ति की चादर एक माह तक चलेगा.

खनिज तेल पर उलझन से जाल का उपयोग करने के लिए एक अतिरिक्त लाभ यह चादर से लाइव मक्खियों ठीक करने की क्षमता है. मक्खियों बस बल्कि डूबे बनने से उलझन से ट्रैप की सतह के लिए छड़ी के बाद से, व्यक्तिगत मक्खियों को आसानी से हटाया जा सकता है. नीचे तक गिर कि "उड़ान" मक्खियों भी एक खाली कुप्पी के साथ खनिज तेल ट्रे की जगह से बरामद किया जा सकता है.

हम यहाँ वर्णित उड़ान व्यवहार का स्वचालित माप एक संख्या प्रदान करता हैआनुवंशिक स्क्रीन के लिए throughput, reproducibility और सटीकता की एक उच्च स्तर की अनुमति के लिए पिछले तरीकों से अधिक लाभ की संख्या,. स्वचालित स्कोरिंग भी ऐसी अंगूठी परख 11 के रूप में व्यवहार assays के लिए throughput बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, लैंडिंग ऊंचाई के प्रत्यक्ष माप हमें उड़ान प्रदर्शन में अधिक सूक्ष्म अंतर का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, एक सरल पास / असफल माप (% उड़ान भरने वालों, आदि.) की तुलना में एक अधिक से अधिक संवेदनशीलता प्रदान करता है.

यहाँ वर्णित परख उड़ान गति 12 और प्रस्ताव 13 को मुक्त उड़ान प्रतिक्रियाओं का दृश्य नियंत्रण सहित उड़ान व्यवहार के और अधिक जटिल पहलुओं, उपाय है कि बाद में आगे assays से पूरित किया जा सकता है. इन परीक्षणों में अधिक समय लेने वाला बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन करने के लिए और उत्तरदायी नहीं हैं, वे एक हरकत का जवाब में एक विशेष जीन के समारोह के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए मदद मिल सकती है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया F32 NS078958 (DTB) और R01 AG033620 (बीजी) अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Putty knife Home Depot 630147 www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x) Home Depot 156469 www.homedepot.com
Furring Strip Board Home Depot 164704 www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap Coating BioControl Network 268941 www.biconet.com
Laptop Computer  Apple www.apple.com/mac/
Mineral oil Fisher Scientific BP26291 www.fishersci.com
White poster board Staples 247403 www.staples.com
Polystyrene weighing dish Fisher Scientific S67091A www.fishersci.com
ImageJ Software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital camera Sony DSC-TX7 www.store.sony.com
Fine forceps Fine Science Tools www.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube) McMaster-Carr 8585K62 www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic) McMaster-Carr 8486K943 www.mcmaster.com
Polycarbonate sheets McMaster-Carr 85585K25 www.mcmaster.com
ring stand (2x) Fisher Scientific S47808 www.fishersci.com
Ring support Fisher Scientific S47791 www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2) Fisher Scientific 05-769-7Q www.fishersci.com
Funnel Fisher Scientific 10-500-3 www.fishersci.com
chain clamps (2x) VWR 21573-275 www.vwr.com
Glass vials VWR 66020-198 www.vwr.com

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References

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Tags

व्यवहार अंक 84, तंत्रिका विज्ञान उड़ान प्रदर्शन, जंगली प्रकार मक्खियों
उड़ान प्रदर्शन का सही और तेजी से मापन के लिए एक बेहतर तरीका में<em&gt; ड्रोसोफिला</em
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Babcock, D. T., Ganetzky, B. An… More

Babcock, D. T., Ganetzky, B. An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila. J. Vis. Exp. (84), e51223, doi:10.3791/51223 (2014).

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