Summary
Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de "tags", como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal.
Abstract
A via da ubiquitina-proteassoma por degradação proteica tem emergido como um dos mecanismos mais importantes para a regulação de uma grande variedade de funções celulares em praticamente todos os organismos eucarióticos. Especificamente, em plantas, o sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS) regula a degradação de proteína e contribui significativamente para o desenvolvimento de uma ampla variedade de processos, incluindo a resposta imunológica, desenvolvimento e morte celular programada. Além disso, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, tais como Agrobacterium, explorar as UPS de acolhimento para a infecção eficiente, enfatizando a importância da UPS em interações planta-patógeno.
A especificidade do substrato da UPS é conseguido pela ubiquitina-ligase E3, que actua em conjunto com a E1 e E2-ligases para reconhecer e marcar as moléculas de proteína específicos destinados a degradação, anexando-os a cadeias de moléculas de ubiquitina. Uma classe das ligases E3 é o SCF (Skp1 / Cproteína Ullin / F-box) complexo, que reconhece especificamente os substratos UPS e tem como alvo os para ubiquitination através do seu componente de proteína F-box. Para investigar um papel potencial da UPS em um processo biológico de interesse, é importante elaborar um ensaio simples e confiável para a degradação de proteínas mediada por UPS. Aqui, nós descrevemos um tal teste, utilizando um sistema isento de célula de planta. Este ensaio pode ser adaptado para estudos sobre os papéis de degradação da proteína regulada em diversos processos celulares, com um foco especial sobre as interações proteína-substrato da caixa-F.
Introduction
A via proteassoma ubiquitin/26S está emergindo como um mecanismo generalizado para o controle de diversas reações biológicas, incluindo a regulação da transcrição, a progressão do ciclo celular e transdução de sinal, receptor infra-regulação ou endocitose, entre outros processos 1-4. Nesta via, a proteína alvo é identificado pela ubiquitina resíduos que estão ligados através de uma primeira ligação thiolester a enzima activadora de ubiquitina E1 e translocados para um resíduo de aminoácido cisteína da enzima de conjugação da ubiquitina-E2 e, finalmente, E2 interage com ubiquitina ligase E3 , resultando em polyubiquitination do substrato de proteína. Em última análise, as proteínas polyubiquitinated são reconhecidos e degradado pelo proteassoma 26S. Neste mecanismo, a enzima E3 especifica o substrato e funciona como o componente regulador chave do sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS). Ligases E3 pode agir de forma independente, como ligases domínio RING, ou como parte de um SCF multisubunit (Sproteínas) complexo kp1/Cullin/F-box, tais como ligases de domínio F-box. SCF mediadas por vias de degradação proteosomal estão envolvidas na regulação da transcrição, do ciclo celular, a transdução de sinal 5-10 e muitas outras importantes funções celulares.
Além desses papéis críticos na regulação de processos celulares, UPS toma o palco central em muitas interações planta-patógeno. Por exemplo, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, incluindo Agrobacterium, contam com a UPS host para facilitar o processo de infecção 11. Agrobacterium provoca tumores neoplásicos em plantas, os quais representam os seus hospedeiros naturais, e também podem transformar uma vasta gama de outros eucariotas, a partir de fungos de 1,2 para as células humanas 12,13. Durante a infecção, Agrobacterium exporta um elemento de DNA (T-DNA) e várias proteínas de virulência (vir) na célula hospedeira 12-13. Uma dessas proteínas é VirF, a primeira proteína F-box encontradoa ser codificada por um genoma procariótico 14. Como parte do complexo de SCF ubiquitina-ligase, VirF, e seu homólogo funcional hospedeiro VBF 15, facilitar a infecção por Agrobacterium por meio da degradação de proteínas mediado por UPS, que presumivelmente facilita desencapsulamento de o T-DNA de bactérias invasoras dos seus acompanhantes e proteínas bacterianas hospedeiras, VirE2 e VIP1, respectivamente 16,17. Curiosamente, muitas proteínas F-box, incluindo VirF, são intrinsecamente instáveis devido ao seu próprio proteólise, que é mediada pela actividade autoubiquitination 18,19 ou por outras ligases E3 para o qual as proteínas F-box podem servir como substratos 20-23.
Ao estudar actividades bioquímicas das proteínas F-box, outros ubiquitina ligases, e / ou os seus substratos, seria muito útil para empregar um ensaio simples e fiável para a degradação do proteossoma. Descrevemos aqui um tal protocolo para a análise da estabilidade da proteína na célula-Livre do sistema. Neste ensaio, a estabilidade do substrato UPS é analisada na presença ou ausência de um dos componentes essenciais da via de degradação do proteossoma, tal como uma proteína da caixa F, num sistema isento de células. Em geral, a expressão da proteína testada (s) em tecidos de plantas, preparação de extractos de células livres a partir destes tecidos e controlar as quantidades de proteína (s) de interesse por western blotting. O mecanismo dependente da UPS de degradação de proteínas é demonstrada pela inclusão de inibidores de proteossomo específicas e / ou da utilização de co-expressão de forma dominante negativa de um componente de SCF, Cullin. Considerando que ilustram este ensaio utilizando degradação proteosomal da proteína de Arabidopsis VIP1 17 pela proteína F-VBF caixa 15, que pode ser empregue para investigar a estabilidade de quaisquer outros substratos proteossomo.
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Protocol
1. A expressão de proteínas
- A escolha do sistema de expressão
Escolha do sistema, ou seja, vectores e um método de distribuição de vectores, os mais adequados para a expressão da proteína de interesse no modelo de organismo / célula específica. Note-se que o nosso ensaio requer a expressão das proteínas testadas em quantidades facilmente detectáveis, o que é melhor alcançada pela transformação transiente de um grande número de células. Em plantas, por exemplo, isto é melhor conseguido utilizando plasmídeos binários como os vectores de expressão e de Agrobacterium como sistema de entrega. - Construção de vectores de expressão binário
O clone da sequência de codificação (s) da proteína (s) de interesse num vector de expressão, quer isoladamente ou em fusão de tradução de um marcador de epitopo. Uso Os vectores adequados para o sistema de expressão escolhido e processos de biologia molecular convencionais para a clonagem de genes. Para a entrega de genes mediada por Agrobacterium, empregar vetores binários e apresentá-los, utilizando também standaprotocolos rd, em uma cepa de Agrobacterium, como EHA105, para inoculação posterior dos tecidos vegetais. - A escolha de espécies de plantas
Selecione as espécies de plantas em que a proteína (s) de interesse serão expressas. Note-se que, ao passo que todas as espécies de plantas susceptíveis à transformação genética mediada por Agrobacterium pode ser usado, as nossas espécies de plantas de Nicotiana benthamiana escolha é, que seja facilmente cultivada, altamente susceptíveis a Agrobacterium, e tem grandes folhas que são facilmente inoculados. - O crescimento das plantas
Crescer uma planta de 4 a 6 semanas em uma panela com Pro-Mix BX em uma panela (20 cm x 20 cm x 20 cm), sob condições controladas-ambiental (por exemplo, câmara de crescimento) de dia longo (ou seja, 16 h de 130 -150 μE m-2 s-1 de luz a 23 ° C e 8 horas e escuro a 20 ° C) e 40-65% de humidade relativa.
1.5.2 Fertilize ocasionalmente com produtos comercialmente disponíveis por instruções do fabricante. Uma vez que a planta é cultivada, selecionefolhas com o tamanho de 50 mm x 70 mm ou maior (estas medições de comprimento não incluem o pecíolo) para inoculação com Agrobacterium. - A inoculação com Agrobacterium
Grow Agrobacterium estirpe portadora da construção binário expressando a proteína testada (s) a partir do passo 1.3 durante a noite a 28 ° C em meio YEP (1% de peptona, 1% de extracto de levedura e 0,5% de NaCl) suplementado com os antibióticos apropriados (por exemplo, 100 mg / L de estreptomicina e 10 mg / L, rifampicina para vectores baseados em pPZP-RSC2 24-25).
1.6.2 Centrifugar as células ressuspensas a OD 600 = 0,5 em tampão de infiltração [10 mM de MgCl 2, 10 mM de MES (pH 5,6), 100 pM de acetosiringona], e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Infiltrar a cultura para o lado abaxial da folha, usando uma agulha de seringa de 1 ml; observar que as folhas são inoculadas in situ, enquanto que está ligado à planta.
1.6.3 Após a infiltração, cultivar a planta durante 72 h sob o regime de luz de 16 h 130-150 &# 181; E m-2 s-1 de luz a 23 ° C / 8 h escuro a 20 ° C antes da colheita. - Aplicação de inibidores proteossomo
Para apoiar a noção de que a proteína testada (s) é degradada através de uma via proteosomal, usar inibidores de proteossomo MG132 específicos e lactacistina 28-29, o que deve reduzir ou mesmo bloquear a degradação. Quatro horas antes da colheita (ver passo 2.1), infiltrar as áreas foliares inoculados com Agrobacterium com 10 mM MG132 (EMD Millipore) ou 10 mM lactacistina (Sigma-Aldrich) ou mock-tratar a folha com os respectivos solventes, ou seja, 0,1% de DMSO ou água destilada.
2. Preparação de extractos isentos de células
- Colheita Folha
Colher as áreas inoculadas da folha, geralmente ca. 200-400 mg de peso fresco, e triturá-los em pó fino em nitrogênio líquido. Alternativamente, conta-bater os tecidos, usando qualquer bead-beater (por exemplo, Biospec) ou um amalgamador dental (por exemplo, TPC Avançada Technologies) diretamente no buffer de degradação (ver passo 2.2). - Extração de proteínas
Preparar um extracto de proteína total, colocando o tecido triturado em 500 mL de tampão de degradação [50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM de adenosina-5'-trifosfato, e 1 x inibidor da protease cocktail (Sigma-Aldrich)]. Note-se que a mistura de inibidores de protease afecta principalmente serina, cisteína, aspártico, e metaloproteases e não interfere com a protease 26S. Clarificar o extracto por duas centrifugações sequenciais a 12,000 xg por 5 min. - Reacção de degradação de proteínas
Transferir volumes iguais de extractos, normalmente 20 mL, para tubos de microcentrífuga e incubar à temperatura ambiente durante períodos de tempo crescente. Tipicamente, o tempo de amostra zero, e 5, 10, 15, 20, e 30 pontos de tempo mínimo. Pare reacções por fervura em tampão de amostra de SDS-gel, e analisá-las por western blotting.
- A electroforese em gel
3.1.1 resolver as amostras de proteínas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e electrotransferência das proteínas resolvidas para uma membrana de nitrocelulose de acordo com o protocolo padrão 30.
3.1.2 Determinar a concentração de proteína utilizando o método de Bradford (Bio-Rad), e carregar 50-80 ug de proteína total por pista. Certifique-se de que todas as amostras são carregadas igualmente. Para os controlos de carga, comparar as intensidades de uma espécie de proteína ubíquos, tais como putativo Rubisco grandes correntes que migram como uma banda principal com uma mobilidade electroforética relativa de cerca de 50 kDa, podem ser detectadas em géis corados Coomassie-Blue ou em Ponceau S-ou fluorescente SYPRO Rubi-manchado membranas de nitrocelulose. - Bloqueio
Bloquear a membrana com 5% de leite desnatado em TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) durante 1 h à temperatura ambiente. O anticorpo primário
Diluir anticorpo anti-epitopo primária em 1% de leite desnatado em TBST com a concentração recomendada pelo fabricante e incubar com a membrana bloqueada durante 1 h à temperatura ambiente ou durante uma noite a 4 º C com agitação suave. - Lavagem
Lavar a membrana é lavada com 20 ml de TBST, durante 15 minutos, uma vez, e duas vezes durante 5 min à temperatura ambiente com agitação suave. - O anticorpo secundário
Dilui-se anticorpo secundário (por exemplo, anti-IgG de coelho) conjugado com peroxidase de rábano (HRP) em 1% de leite desnatado em TBST tal como recomendado pelo fabricante e incubar com a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. - Detecção
Lavar a membrana tal como é descrito no Passo 3.4. Após a lavagem final em TBST, visualizar as proteínas de interesse com um substrato quimioluminescente HRP, mais vulgarmente usando um kit ECL.
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Representative Results
A Figura 1, adaptada do Zaltsman et al. 17, ilustra experiências representativas para a detecção da degradação proteosomal em um sistema isento de células. Especificamente, nós demonstramos a desestabilização de uma planta relacionada com a defesa proteína VIP1 pela proteína F-box VBF pela via SCF VBF em N. benthamiana. VBF Arabidopsis e marcadas com HA VIP1 (HA-VIP1 proteínas) foram transientemente co-expressos, e o conteúdo de proteína HA-VIP1 dentro de extractos das folhas que expressam foi analisada por transferência Western. Esta análise demonstrou que as quantidades VIP1 foram reduzidos de forma significativa, quando co-expresso com VBF, mas manteve-se relativamente estável na ausência de VBF co-expressão (Figura 1A). Note-se que uma ligeira redução do teor de VIP1 sem VBF pode ser devido ao baixo nível da atividade VBF tabaco endógena. O mecanismo de degradação proteosomal de VIP1 desestabilização por VBF foi deduzida do inhibition por MG132 (Figura 1A). A quantificação dos resultados na Figura 1A demonstrada quase completa (≥ 90 ± 5%) por VIP1 VBF, que foi bloqueada por MG132 (Figura 1B). Note-se que os níveis ligeiramente mais elevados de VIP1 na presença de MG132 provavelmente são explicadas pela inibição da actividade endógena VBF 17.
Figura 1. VBF promove degradação proteosomal de VIP1. HA-VIP1 foi expressa sozinho ou co-expressos com VBF em N. benthamiana sai. Os extractos de proteína resultantes foram incubadas durante os períodos de tempo indicados e analisados por western blotting utilizando anticorpos anti-HA. A grande cadeia putativo RuBisCo foi utilizado como controle de carga (A). Quantified sinal de western blot foi expressa como percentagem do sinal obtido na ausência de VBF no início do período de incubação. Os dados representam os valores médios de três experiências independentes com desvios padrão (B) indicados. Esta figura foi adaptado a partir de Zaltsman et al. 17
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Discussion
Este ensaio baseia-se na expressão das proteínas testadas em tecidos de plantas, assim, o processo de degradação potencial proteosomal obviamente, já ocorre dentro dos tecidos vivos. Nós ensaio desestabilização da proteína, no entanto, apenas nos extratos, com o tempo de amostra de zero servindo como ponto de referência inicial. Por isso, nós definimos como um ensaio isento de células.
Um aspecto importante para o sucesso deste ensaio é a escolha correcta do vector de expressão a partir do qual a proteína testada (s) irá ser produzida. A menos que os anticorpos específicos contra a proteína testados estão disponíveis, deve ser para a detecção por transferência de western marcado com epitopo. A proteína marcada deve ser expresso a partir de um vector binário de Agrobacterium. Considerando que muitos desses vectores estão disponíveis 26, sugerimos usar vectores derivados de nosso sistema modular PSAT plasmídeo 24, o que permite um passo de inserção de cassetes de expressão para os plasmídeos binários pPZP-RCS224-25. Outra vantagem do sistema PSAT é que ele permite a expressão de vários genes do mesmo vector 25, o que é particularmente útil para experiências de ensaio de vários substratos proteossomo ou para estudar os efeitos de interactores do substrato testado; por exemplo, a co-expressão de Agrobacterium VirD5 proteína que interage com o substrato proteosomal VirF resulta na protecção de VirF proteosomal degradação 22. É importante ressaltar que a série PSAT expansão do vetor já inclui vetores para epítopos de marcação 27. Independentemente da estratégia de clonagem escolhida, a sequência que codifica a proteína marcada com epitopo de interesse deve ser introduzida num vector binário para a subsequente expressão em tecidos de plantas. Uma vez que este ensaio utiliza a expressão transitória, o vector binário não tem que contêm marcadores de selecção para a transformação estável, embora a sua presença não é prejudicial para a eficácia do ensaio.
Embora a co-expressão de várias proteínas de interesse é melhor conseguido utilizando vectores de expressão de multigene, que também pode ser feito por combinação de volumes equivalentes de culturas líquidas de dois ou três estirpes de Agrobacterium, cada um dos quais transporta uma construção de binário separado.
Um outro ponto crítico é que, em muitos casos, o ensaio de degradação de proteosomal envolve a expressão não só do substrato proteosomal, mas também de um componente da via de SCF. Por exemplo, o objectivo pode ser experimental para testar se uma proteína F-box reconhece e alvos para a degradação de um substrato específico. Neste caso, este substrato marcado com epitopo deve ser co-expressa com a proteína não marcada F-box.
Para uma análise mais pormenorizada dos dados, o grau de degradação de proteínas pode ser facilmente quantificada através da medição da intensidade relativa dos sinais de western ucantar o mais recente software ImageJ (NIH) 31. Ao realizar essa quantificação, é importante não para o excesso de desenvolver as manchas ocidentais para evitar a saturação do sinal. Quantificação de dados também requer que todas as amostras são carregadas num gel de SDS-poliacrilamida igualmente no que respeita ao seu teor de proteína como a degradação da proteína no presente ensaio é detectado pela redução na intensidade da banda de proteína apropriada. Isto é conseguido através da determinação do teor de proteínas de cada extracto celular e pelo controlo a posteriori de igual carga de cada pista (veja o passo 3.1). Além disso, em qualquer dada experiência ao longo do tempo, todas as amostras devem ser derivados a partir do mesmo lote de extracto ajuda a assegurar a igualdade de carga.
O ensaio livre de células para a degradação proteosomal descrito aqui usa plantas como um sistema experimental. No entanto, o mesmo modelo experimental pode ser utilizado para qualquer outro organismo. O ensaio também pode ser prorrogado por Further focando o percurso SCF. Por exemplo, o mecanismo dependente de SCF de degradação da proteína pode ser demonstrada utilizando uma forma negativa dominante da CULLIN1 componente SCF (Cul1 DN). Especificamente, um mutante de Arabidopsis Cul1 com os resíduos de aminoácidos eliminados entre as posições 1 e 420 foi mostrado para interagir com o componente Skp1/ASK1 do complexo de SCF, mas não com RBX1, que representa o núcleo catalítico de SCF 22. A inibição ou redução da degradação do substrato após co-expressão de Cul1 DN indica envolvimento da via SCF.
O nosso ensaio utiliza proteínas de interesse expressos em tecidos de plantas, no seu ambiente natural. Uma alternativa a esta abordagem é a de purificar proteínas recombinantes, adicioná-los a plantar extratos, e siga a sua degradação pela análise ocidental 32. Nós não recomendamos essa tática como metodologia de escolha, pois proteínas recombinantes não always reflectem fielmente as propriedades biológicas nativas, no entanto, se a expressão in planta não é possível a utilização de proteínas recombinantes, certamente, representa uma alternativa valiosa.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os trabalhos que conduziram a esta publicação tem recebido financiamento do programa Marie Curie COFUND "U-Mobility", co-financiado pela Universidade de Málaga e do Programa da União Europeia 7 º Programa-Quadro (FP7/2007-2013) sob n º 246550 GA. O trabalho em nosso laboratório é suportado por concessões do NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, e BSF para VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
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