Целевые деградации белков представляет собой важный механизм регулирования в отношении функции клеток. Это происходит с помощью консервативной убиквитин-протеасом пути, который придает полиубиквитиновый цепи с белком-мишенью, что тогда служить "теги", как молекулярные для 26S протеасомы. Здесь мы описываем простой и надежный бесклеточный анализ для протеасомной деградации белков.
Убиквитин-протеасомный путь для деградации белка стала одним из наиболее важных механизмов регулирования широкого спектра клеточных функций практически во всех эукариотических организмов. В частности, в растениях, протеасом система ubiquitin/26S (UPS) регулирует деградацию белков и вносит значительный вклад в развитие широкого диапазона процессов, в том числе иммунного ответа, развития и запрограммированной гибели клеток. Кроме того, все больше доказательств о том, что многочисленные возбудители растений, такие как Agrobacterium, эксплуатировать узлов ИБП для эффективного инфекции, подчеркивая важность ИБП в завод-патогенных взаимодействий.
Субстратной специфичности UPS достигается убиквитин-лигазы Е3, который действует согласованно с E1 и E2 лигазы признать и отметить специфические белковые молекулы, предназначенные для деградации путем присоединения к ним цепей молекул убиквитина. Один класс Е3 лигазы является SCF (Skp1 / CUllin / F-коробка белок) комплекс, который специфически распознает подложек ИБП и цели их для убиквитинирования через его компонента F-коробка белка. Чтобы исследовать потенциальную роль UPS в биологическом процессе интерес, важно разработать простой и надежный анализ для UPS-опосредованной деградации белков. Здесь мы описываем один такой анализ с помощью мобильного без системы растений. Этот анализ может быть адаптирована для изучения роли регулируемой деградации белков в различных клеточных процессов, с особым упором на F-коробка белок-субстрат взаимодействий.
Ubiquitin/26S протеасомный путь становится широко распространенной механизма контроля разнообразных биологических реакций, в том числе регуляции транскрипции, прогрессии клеточного цикла и передачи сигнала, рецептор понижающей регуляции или эндоцитоза, среди других обрабатывает 1-4. В этом пути, целевой белок помечены убиквитин остатки, которые сначала присоединен через тиолэфирной связью с убиквитин-активирующий фермент Е1 и затем перемещаться до остатка аминокислоты цистеина убиквитин-сопряжение фермента Е2 и, наконец, E2 взаимодействует с убиквитин лигазы Е3 , в результате чего polyubiquitination белкового субстрата. В конечном счете, polyubiquitinated белки распознаются и разрушается в результате 26S протеасомы. В этом механизме, фермент Е3 задает подложку и действует в качестве ключевого компонента регулирующего протеасомы системы ubiquitin/26S (UPS). E3 лигазы может действовать независимо, такие, как лигазы доменных кольцо или как часть мультисубъединичных SCF (Skp1/Cullin/F-box белок) комплекс, например, лигаз доменных F-коробки. SCF-опосредованные пути протеасомной деградации участвуют в регуляции транскрипции, клеточного цикла, передаче сигналов 5-10 и многих других крупных клеточных функций.
Помимо этих важнейших ролей в регуляции клеточных процессов, UPS занимает центральное место в многих растений патогенных взаимодействий. Например, увеличение данные свидетельствуют о том, что несколько патогены растений, в том числе Agrobacterium tumefaciens, полагаться на хозяина ИБП для для облегчения процесса инфекции 11. Agrobacterium вызывает опухолевые наросты на растениях, которые представляют для естественных хозяев, и это также может преобразовывать широкий спектр других эукариот, от грибов 1,2 с клетками человека 12,13. За время своего инфекции, Agrobacterium экспортирует элемент ДНК (Т-ДНК) и несколько вирулентность (Vir белков) в клетку-хозяина 12-13. Один из этих белков VirF, первый белок F-коробка найденокоторый должен быть закодирован прокариотической генома 14. В рамках убиквитинлигазы комплекса SCF, VirF и его функциональной принимающей гомолога ВПЗ 15, облегчения Agrobacterium инфицирование через UPS-опосредованной деградации белков, которые, предположительно, облегчает декапсидацию вторжения бактерий Т-ДНК из его сопровождающих бактериальных и белков хозяина, VirE2 и VIP1 соответственно 16,17. Интересно, что многие белки F-коробка, в том числе VirF, по своей природе нестабильны из-за их собственной протеолиза, который, опосредованного активностью autoubiquitination 18,19 или другими E3 лигазы, для которого F-коробка белки могут служить субстратами 20-23.
При изучении биохимических деятельности F-коробка белков, других убиквитиновых лигаз, и / или их субстратов, было бы очень полезно использовать простой и надежный тест для протеасомной деградации. Здесь мы опишем один такой протокол для анализа стабильности белка в клетке-Свободная система. В этом анализе, стабильность подложки UPS анализируют в присутствии или в отсутствие одного из важнейших компонентов в пути деградации протеосомной, такой как белок F-бокса, в бесклеточной системе. Как правило, мы выразить испытаны белок (белки) в тканях растений, готовят бесклеточных экстрактов из этих тканей, и контролировать количество белка (ов), представляющие интерес помощью вестерн-блоттинга. Механизм ИБП зависит от деградации белков свидетельствует включения специфических ингибиторов протеасом и / или с использованием коэкспрессия доминантно-негативной форме SCF компонента, Каллин. В то время как мы иллюстрации этого анализа с использованием протеасомной деградации в Arabidopsis VIP1 17 белка белка F-бокса ВПЗ 15, он может быть использован для исследования устойчивости любых других протеасом субстратов.
Этот анализ основан на экспрессии исследуемых белков в тканях растений, таким образом, потенциал процесс деградации протеасомы, очевидно, происходит уже в живые ткани. Мы анализе белка дестабилизации, однако, только в экстрактах, со временем нулевой образец, выступающей в качестве нач?…
The authors have nothing to disclose.
Работа приводит к этой публикации получил финансирование из программы Мари Кюри COFUND "U-Mobility", совместно финансируемый университета Малага и Евросоюз 7-й Рамочной программы (FP7/2007-2013) под GA-№ 246550. Работа в нашей лаборатории поддержана грантами NIH, USDA / NIFA, NSF, бард, и ЧФ в ВК
Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |