وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. استخدام العادي على مراحل اللوني السائل إلى جانب عالية الدقة قياس الطيف الكتلي مع تبديل قطبية ودورة العمل السريع، ونحن تصف البروتوكول لتحليل تكوين الأيض القطبية من المواد البيولوجية مع حساسية عالية، ودقة، والقرار.
وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. ومع ذلك، والمنصات الحالية لديها العوامل التي تحد مختلفة، مثل عمالة كثيفة عينة الاستعدادات، وحدود الكشف منخفضة، وسرعات المسح الضوئي بطيئة أو أسلوب الأمثل مكثفة لكل الأيض، وعدم القدرة على قياس إيجابا وسلبا الأيونات المشحونة في التجارب احدة. وبالتالي، يمكن لبروتوكول الايض الرواية تقدم دراسات الايض. اللوني ماء مقرها أميد-تمكن من تحليل المستقلب القطبية دون أي اشتقاق الكيميائية. عالية الدقة باستخدام MS Q-Exactive (QE-MS) قد تحسنت البصريات أيون، زيادة سرعات المسح الضوئي (256 ميللي ثانية في قرار 70،000)، ولديه القدرة على تنفيذ الإيجابية / السلبية التبديل. يستخدم إستراتيجية استخراج الميثانول الباردة، واقتران عمود أميد مع QE-MS تمكن الكشف قوية من 168 الأيض وآلاف القطبية المستهدفة من الميزات الإضافية في وقت واحد. داتويتم تجهيز خارجا مع البرمجيات المتاحة تجاريا بطريقة ذات كفاءة عالية، وميزات غير معروف المستخرجة من أطياف الشامل يمكن الاستعلام في قواعد البيانات.
الايض، الذي يعرف بأنه تجربة يقيس نواتج متعددة في وقت واحد كان، وهي منطقة شديدة الأهمية. يوفر الايض قراءات مباشرة لعلم وظائف الأعضاء الجزيئية وقدمت رؤى في التنمية وأمراض مثل السرطان 1-4. الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والغاز اللوني الطيف الكتلي (GC-MS) هي من بين الأكثر شيوعا الصكوك 5-9. NMR، وخاصة استخدمت لتدفق التجارب منذ النظائر الثقيلة المركبات المسمى، مثل C 13 الأيض المسمى، هي NMR-النشطة 10،11. ومع ذلك، يتطلب هذه الاستراتيجية عالية نسبيا نقاء عينة وكمية كبيرة العينة، الأمر الذي يحد من تطبيقاتها في الايض. وفي الوقت نفسه، البيانات التي تم جمعها من NMR تحليل الاحتياجات مكثفة وتخصيص مجمع معقدة NMR أطياف أمر صعب. وقد GC-MS تستخدم على نطاق واسع لنواتج الأيض القطبية والدراسات الدهون، لكنه يتطلب compoun متقلبةس، وبالتالي غالبا ما اشتقاق من نواتج الأيض، الذي ينطوي في بعض الأحيان الكيمياء المعقدة التي يمكن أن يكون مضيعة للوقت ويدخل الضوضاء التجريبية.
اللوني السائل (LC) بالإضافة إلى الثلاثي مطياف الكتلة رباعي يستخدم رباعي الأولى لاختيار الأيونات الأم سليمة، والتي يتم بعد ذلك مجزأة في رباعية الثانية، في حين يتم استخدام رباعي الثالث لتحديد شظايا مميزة أو الأيونات ابنة. هذا الأسلوب، الذي يسجل الانتقال من الأم إلى أيونات أيونات ابنة محددة، ويطلق متعددة رصد رد فعل (MRM). MRM هو طريقة حساسة جدا ومحددة، وقوية لكل من جزيء صغير من البروتين والكميات 12-15،21. ومع ذلك، MRM لديها حدودها. لتحقيق نوعية عالية يحتاج إلى أسلوب MRM سيتم بناؤها لكل المستقلب. يتكون هذا الأسلوب من تحديد جزء معين وما يقابلها من الطاقة الاصطدام الأمثل، الأمر الذي يتطلب قبل معرفة PROPErties من نواتج الأيض من الفائدة، مثل معلومات التركيب الكيميائي. لذلك، مع بعض الاستثناءات التي تنطوي على خسارة محايدة من شظايا مشتركة، فإنه ليس من الممكن تحديد مستقلبات غير معروفة مع هذا الأسلوب.
في السنوات الأخيرة، وقد تم إطلاق سراح عالية الدقة قياس الطيف الكتلي (HRMS) والصكوك، مثل سلسلة LTQ-orbitrap وExactive، وQuanTof، وTripleTOF 5600 16-18،22. يمكن نظام إدارة الموارد البشرية توفير الشامل لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) من الأيونات سليمة داخل خطأ من عدد قليل من جزء في المليون. وبالتالي، أداة نظام إدارة الموارد البشرية تعمل عن طريق الكشف عن أيونات السلائف (أي وضع المسح الضوئي الكامل) يمكن الحصول على معلومات مباشرة من الهيكلية الشامل الدقيق والتركيب العنصري مما أدى لتحليلها، ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد نواتج المحتملة. في الواقع، كل المعلومات عن مركب يمكن الحصول عليها مع الشامل الدقيق، وتصل إلى مستوى أيزومرات الهيكلي. أيضا، كاملطريقة مسح لا تتطلب معرفة سابقة من نواتج الأيض و لا يتطلب الأسلوب الأمثل. علاوة على ذلك، لأن جميع الأيونات مع م / ض الوقوع في تفحص نطاق يمكن تحليلها، نظام إدارة الموارد البشرية لديها قدرة غير محدودة تقريبا من حيث عدد الأيض التي يمكن قياسها كميا في شوط واحد مقارنة مع الطريقة MRM. نظام إدارة الموارد البشرية هي أيضا قابلة للمقارنة إلى MRM رباعي الثلاثي في القدرات الكمي نظرا لدورة عمل قصيرة مما أدى إلى عدد مماثل من نقاط البيانات التي يمكن الحصول عليها في MS مسح كامل. وبالتالي، يوفر نظام إدارة الموارد البشرية نهجا بديلا لالايض الكمي. في الآونة الأخيرة، ووصف نسخة محسنة من نظام إدارة الموارد البشرية Q-Exactive مطياف الكتلة (QE-MS) يمكن تشغيلها تحت التبديل بين الأوضاع الإيجابية والسلبية مع دورة مرات سريع بما فيه الكفاية في أسلوب واحد، والذي يوسع نطاق الكشف عن 19. نحن هنا تصف استراتيجية الايض لدينا باستخدام QE-MS.
الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لالتنميط المستقلب ناجحة في الخلايا باستخدام هذا البروتوكول هي: 1) السيطرة على النمو المتوسطة واستخراج الدقيق للخلايا؛ 2) تعديل طريقة LC يعتمد على طريقة MS الإعداد لضمان وجود ما يكفي من (عادة لا يقل عن 10) نقاط البيانات عبر الذروة لتحديد الكمي?…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أنوه ديتليف شومان، جينيفر ساتون (الحرارية فيشر العلمية) وناثانيل سنايدر (جامعة بنسلفانيا) لإجراء مناقشات قيمة حول المعايرة الشامل ومعالجة البيانات. وأيد البحوث التي أعلن عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة الوطنية في إطار جائزة عدد R00CA168997. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |