אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי
Summary
פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.
Abstract
פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. עם זאת, יש לי פלטפורמות הנוכחיות גורמים מגבילים שונים, כגון הכנות עבודה אינטנסיבית מדגם, מגבלות זיהוי נמוכות, מהירויות סריקה איטיות, אופטימיזציה בשיטה אינטנסיבית עבור כל המטבוליט, וחוסר היכולת למדוד גם באופן חיובי ויונים טעונים שלילי בניסויים אחת. לכן, פרוטוקול metabolomics רומן יכול לקדם מחקרי metabolomics. כרומטוגרפיה הידרופילי מבוססת אמיד מאפשרת ניתוח המטבוליט קוטבי ללא כל derivatization כימי. MS ברזולוציה גבוהה באמצעות Q-Exactive (QE-MS) השתפר אופטיקה יון, גדל במהירויות סריקה (256 msec ברזולוציה 70,000), ויש לו את היכולת לבצע מיתוג חיובי / שלילי. משתמש באסטרטגית חילוץ מתנול קרה, וצימוד עמודה אמיד עם QE-MS מאפשרת זיהוי חזק של 168 מטבוליטים ממוקדים קוטב ואלפים תכונות נוספות בו זמנית. Datעיבוד מתבצע עם תוכנה זמינה באופן מסחרי בצורה יעילה ביותר, ותכונות ידועות שחולצו מן הספקטרום ההמוני ניתן שאילתה במסדי נתונים.
Introduction
Metabolomics, שהוגדר כניסוי שמודד מטבוליטים מרובים בו זמנית, כבר שטח של עניין רב. Metabolomics מספק readout ישיר של פיזיולוגיה מולקולרית וספק תובנות פיתוח ומחלות כגון סרטן 1-4. תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה מסה (GC-MS) הן בין המכשירים 5-9 הנפוצים ביותר. NMR, במיוחד נעשה שימוש בניסויי שטף מאז תרכובות האיזוטופ הכבד שכותרתו, כגון 13 מטבוליטים C שכותרתו, הם NMR פעיל 10,11. עם זאת, אסטרטגיה זו דורשת טוהר מדגם גבוה יחסית וכמות מדגם גדולה, אשר מגבילה את היישומים שלה בmetabolomics. בינתיים, הנתונים שנאספו מתמ"ג ניתוח הצרכים אינטנסיבי והקצאת מתחם של ספקטרום NMR המורכב הוא קשה. GC-MS כבר בשימוש נרחב למטבוליטים קוטב ומחקרי שומנים בדם, אבל זה דורש compoun נדיפיםDS ולכן לעתים קרובות derivatization של מטבוליטים, שלעתים כרוך כימיה מורכבת שיכול להיות זמן רב ומכניס רעש ניסיוני.
כרומטוגרפיה נוזלית (LC) מצמידים ספקטרומטריית מסת quadrupole משולשת משתמשת quadrupole הראשון לבחירת יוני ההורה שלמים, אשר לאחר מכן מקוטעים בquadrupole השני, בעוד quadrupole השלישי משמש לבחירת ברים אופייניים או יונים בתו. שיטה זו, המתעדת את המעבר מיוני הורה ליונים בתו ספציפי, שמכונה ניטור תגובה מרובה (MRM). MRM הוא שיטה מאוד רגישה, ספציפית וחזקה עבור שתי מולקולה קטנה וquantitation חלבון 12-15,21. עם זאת, MRM יש מגבלות שלה. כדי להשיג סגוליות גבוה שיטת MRM צריכה להיות בנויה לכל המטבוליט. שיטה זו מורכבת מזיהוי שבר ספציפי ומתאימים אנרגיית התנגשות מותאמת, אשר דורשת מראש ידע של נכסrties של מטבוליטים של עניין, כגון מידע על מבנה כימי. לכן, עם כמה יוצאים מן הכלל הכולל אובדן הניטרלי של שברים נפוצים, לא ניתן לזהות מטבוליטים ידועים בשיטה זו.
בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה מכשירים (HRMS) כבר פורסמו, כגון סדרת LTQ-Orbitrap וExactive, QuanTof, וTripleTOF 5600 16-18,22. HRMS יכול לספק המוני לחייב יחס (m / z) של יוני שלם בשגיאה של כמה עמודים לדקה. לכן, מכשיר HRMS המופעל על ידי איתור כל היונים המבשר (כלומר מצב סריקה מלא) ניתן לקבל מידע מבני ישיר מהמסה המדויקת והרכב יסודות וכתוצאה מכך של אנליטי, ומידע זה יכול לשמש כדי לזהות מטבוליטים פוטנציאליים. ואכן, ניתן לקבל את כל המידע על מתחם עם מסה מדויקת, עד לרמה של איזומרים מבניים. כמו כן, מלאשיטת סריקה אינה דורשת ידע קודם של מטבוליטים ואינו דורשת אופטימיזציה של שיטה. יתר על כן, מאחר שניתן לנתח את כל היונים עם מ '/ z נופל לתוך טווח הסריקה, יש HRMS קיבולת בלתי מוגבלת כמעט במונחים של מספר מטבוליטים שניתן לכמת בטווח אחת בהשוואה לשיטת MRM. HRMS הוא גם דומה לMRM quadrupole משולש ביכולת כמותית בשל מחזור העבודה הקצרה וכתוצאה מכך מספר דומה של נקודות נתונים שניתן להשיג בטרשת נפוצה סריקה מלאה. לכן, HRMS מספק גישה חלופית לmetabolomics כמותית. לאחרונה, גרסה משופרת של HRMS מכונה ספקטרומטריית מסת Q-Exactive (QE-MS) יכול להיות מופעלת תחת המיתוג בין מצבים חיוביים ושליליים עם זמני מחזור מהיר מספיק בשיטה אחת, אשר מרחיבה את טווח הגילוי 19. כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו באמצעות metabolomics QE-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר לפרופיל המטבוליט מוצלח בתאים תוך שימוש בפרוטוקול זה הם: 1) שליטה על מדיום הגידול והפקה מדוקדקת של התאים; 2) לשנות את שיטת LC מבוסס על שיטת התקנת MS, כדי להבטיח שיש מספיק (בדרך כלל לפחות 10 נקודות נתונים) על פני שיא כדי לכמת; 3) עושה כיול מסה נמוך לפני הפע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר דטלף שומאן, ג'ניפר סאטון (תרמו פישר סיינטיפיק) ונתנאל סניידר (אוניברסיטת פנסילבניה) לדיונים חשובים בכיול מסה ועיבוד נתונים. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס R00CA168997. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner–semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
