Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji
Summary
Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.
Abstract
Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Ancak, mevcut platformlar gibi emek yoğun numune hazırlama, düşük tespit limitleri, yavaş tarama hızları, her bir metaboliti için yoğun metot optimizasyonu ve olumlu hem ölçmek için yetersizlik ve tek deneylerde negatif yüklü iyonlar gibi farklı sınırlayıcı faktörler var. Bu nedenle, yeni bir metabolomiks protokol metabolomiks çalışmaları ilerlemek olabilir. Amid bazlı hidrofilik kromatografi kimyasal türetme olmaksızın polar metabolit analizi sağlar. Q-Exactive (QE-MS) kullanılarak yüksek çözünürlüklü MS, iyon optik geliştirilmiş tarama hızlarını (çözünürlükte 70,000 256 msn) artmış, ve pozitif / negatif anahtarlama yürüten yeteneğine sahiptir. Soğuk metanol ekstre strateji kullanarak, ve QE-MS ile bir amid sütun bağlanması aynı anda ek özellikler 168 hedef polar metabolitleri ve binlerce sağlam algılanmasını sağlar. Datbir işleme, yüksek verimli bir şekilde ticari olarak temin edilebilen yazılımı ile gerçekleştirilir, ve kütle spektrumları elde edilen bilinmeyen özellikleri veritabanlarında sorgulanabilir.
Introduction
Aynı anda birden fazla metabolitleri ölçen bir deney olarak tanımlanan Metabolomik, yoğun bir ilgi alanı olmuştur. Metabolomik moleküler fizyoloji doğrudan okunmasını sağlar ve kanser 1-4 gibi geliştirme ve hastalık halinde anlayışlar sağladı. Nükleer manyetik rezonans (NMR) ve gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), en yaygın olarak kullanılan araçlar 5-9 arasındadır. NMR, özellikle 13 C etiketli metabolitleri gibi ağır izotop etiketli bileşikleri, tarihi akış deneyleri için kullanılmıştır, 10,11-NMR etkindir. Ancak, bu strateji metabolitler onun uygulamalarını sınırlar, nispeten yüksek saflık ve büyük örnek miktar gerektirir. Bu arada, NMR toplanan verilerin analizi yoğun ve karmaşık NMR spektrumları bileşik atama zordur gerekiyor. GC-MS çok polar metabolitleri ve lipid çalışmaları için kullanılmıştır, ama bu uçucu compoun gerektirirds ve bazen zaman alıcı olabilir karmaşık kimya içerir ve deneysel gürültü tanıttı metabolitleri bu nedenle sık sık türetme,.
Üçüncü dört kutuplu karakteristik fragmanları veya kız iyonları seçmek için kullanılır ise üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi birleştirilmiş sıvı kromatografisi (LC), daha sonra ikinci bir dört kat olarak parçalanmış dokunulmamış ana iyonları, seçme için ilk kuadruple kullanır. Belirli bir kız iyonlarına ana iyonu geçişi kaydeder bu yöntem, çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM) olarak adlandırılır. MRM küçük molekül ve protein kantitatif 12-15,21 hem de çok duyarlı, spesifik ve güçlü bir yöntemdir. Ancak, MRM sınırlamaları var. Yüksek özgüllük ulaşmak için MRM yöntemi, her metaboliti için inşa edilmesi gerekmektedir. Bu yöntem, özel bir fragmanının belirlenmesi ve prope ön bilgi gerektirir optimize çarpışma enerjisi, ilgili oluşmaktadırBu tür kimyasal yapı bilgileri gibi ilgilenilen metabolitleri, ve ilgili taraflar. Bu nedenle, ortak parçalarının nötr kaybı ile ilgili bazı özel durumlar dışında, bu yöntem ile bilinmeyen metabolitlerin tespit etmek mümkün değildir.
Son yıllarda, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) aletler gibi LTQ-Orbitrap ve Exactive serisi, QuanTof olarak yayımlanan ve TripleTOF 5600 16-18,22 edilmiştir. HRMS birkaç ppm bir hata payı içinde sağlam iyonları oranını (m / z) şarj etmek için bir kütle sağlayabilir. Bu nedenle, tüm ön-madde iyonları (tam tarama modu) tespit edilmesi ile işletilen bir araç HRMS tam kütlesi ve bir analit 'in elde edilen temel bileşiminin doğrudan yapısal bilgi elde edebilir ve bu bilgiler potansiyel metabolitleri tanımlamak için kullanılabilir. Gerçekten de, bir bileşik ile ilgili tüm bilgiler yapısal izomer seviyesine kadar, tam bir kütle ile elde edilebilir. Ayrıca, tam birTarama yöntemi metabolitleri önceki bilgi gerektirmez ve yöntem optimizasyonu gerektirmez. M / z tarama aralığı içine düşen tüm iyonları analiz edilebilir Dahası, HRMS MRM yöntemine göre tek vadede kantifiye edilebilir metabolitlerin sayısı açısından neredeyse sınırsız bir kapasiteye sahiptir. HRMS nedeniyle tarama, tam MS elde edilebilir veri noktaları benzer bir dizi ile sonuçlanan kısa görev döngüsü için, aynı zamanda nicel kapasitede bir üçlü dört kutuplu MRM karşılaştırılabilir. Bu nedenle, HRMS kantitatif metabolitler için alternatif bir yaklaşım sağlar. Son zamanlarda, HRMS geliştirilmiş bir versiyonu (QE-MS) algılama mesafesi 19 genişleten tek bir yöntemle, yeterince hızlı döngü süreleri ile pozitif ve negatif modları arasında geçiş altında ameliyat edilebilir Q-Exactive kütle spektrometresi olarak adlandırılır. Burada QE-MS kullanılarak bizim metabolomiks stratejisini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol kullanılarak hücre başarılı metabolit profil için en önemli adımlar şunlardır: 1) büyütme ortamı ve hücreler dikkatli çıkarma kontrol edilmesi; 2) kantitatif bir tepe üzerinde yeterince (genellikle en az 10) veri noktaları vardır sağlamak için MS yöntemi kurulum dayalı LC yöntemini ayarlanması; 3) örnekleri çalıştırmadan önce düşük kütle kalibrasyonu yapıyor; 4) vites tutma süresini önlemek için en fazla 5 ml enjekte ve zirve genişletilmesi su neden; ve 5) toplu etkile…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kütle kalibrasyon ve veri işleme değerli tartışmalar için Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) ve Nathaniel Snyder (Pennsylvania Üniversitesi) kabul etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma Ödülü sayısı R00CA168997 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner–semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
