Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics
Summary
Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Verwendung normaler-Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie, um hochauflösende Massenspektrometrie mit Polaritätsumschaltung und eine schnelle Arbeitszyklus gekoppelt ist, beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Stoffwechselpolar Zusammensetzung von biologischem Material mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung.
Abstract
Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Allerdings haben aktuelle Plattformen verschiedene limitierende Faktoren, wie arbeitsintensive Probenvorbereitungen, niedrige Nachweisgrenzen, langsamen Scan-Geschwindigkeiten, intensive Methodenoptimierung für jeden Metaboliten, und die Unfähigkeit, sowohl positiv messen und negativ geladenen Ionen in einzelnen Experimenten. Daher könnte ein Roman Metabolomics-Protokoll Metabolomics-Studien voranzubringen. Amid-Basis hydrophilen Chromatographie ermöglicht polare Metabolitenanalyse ohne chemische Derivatisierung. Hochauflösende MS mit der Q-Exactive (QE-MS) hat Ionenoptik verbessert, erhöhte Scan-Geschwindigkeiten (256 ms bei einer Auflösung von 70.000), und hat die Fähigkeit der Durchführung von positiven / negativen Schalt. Mit einem kalten Methanol-Extraktionsstrategie und Koppeln eines Amid-Säule mit QE-MS ermöglicht robuste Detektion von 168 gezielte polaren Metaboliten und Tausende von zusätzlichen Funktionen gleichzeitig. Dateine Verarbeitung wird mit im Handel erhältlichen Software in sehr effizienter Weise durchgeführt, und unbekannte Funktionen aus den Massenspektren extrahiert können in Datenbanken abgefragt werden.
Introduction
Metabolomics, definiert als ein Experiment, das mehrere Metabolite gleichzeitig misst, hat eine Fläche von großem Interesse. Metabolomics bietet eine direkte Auslesen der molekularen Physiologie und hat Einblicke in Entwicklung und Krankheit wie Krebs 4.1 zur Verfügung gestellt. Kernspinresonanz (NMR) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) gehören zu den am häufigsten verwendeten Instrumente 5-9. NMR, vor allem für Fluss Experimente seit schweres Isotop markierten Verbindungen, wie 13 C-markierten Metaboliten verwendet wurde, sind NMR-aktiven 10,11. Diese Strategie erfordert jedoch relativ hohe Probenreinheit und großen Probenmenge, die ihre Anwendungen in der Metabolomics begrenzt. Inzwischen Daten aus NMR gesammelt braucht intensive Analyse und Zuordnung der komplexen Verbindung NMR-Spektren ist schwierig. GC-MS wurde weithin für Polar-und Lipidstoffwechselstudien verwendet, aber es erfordert flüchtigen Compounds und daher oft Derivatisierung von Metaboliten, die manchmal mit komplexen Chemie, die zeitaufwendig sein kann und führt experimentelle Rauschen.
Flüssigkeitschromatographie (LC), um Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie verwendet den ersten Quadrupol zum Auswählen der intakten Elternionen, die dann in der zweiten Quadrupol fragmentiert werden, während der dritte Quadrupol wird verwendet, um charakteristische Fragmente oder Folgeionen zu wählen. Diese Methode, die den Übergang von der Mutterionen zu bestimmten Tochterionen erfasst wird multiple reaction monitoring (MRM) bezeichnet. MRM ist eine sehr empfindlich, spezifisch und robuste Methode sowohl für Kleinmolekül-und Protein-Quantifizierung 12-15,21. Allerdings MRM hat seine Grenzen. Um eine hohe Spezifität zu erreichen ein MRM-Methode muss für jeden Metaboliten gebaut werden. Dieses Verfahren besteht aus der Identifizierung eines spezifischen Fragments und entsprechend optimierten Kollisionsenergie, die vor der Kenntnis der prope erfordertrties der Metaboliten von Interesse, wie die chemischen Strukturinformation. Daher, mit einigen Ausnahmen, die die neutralen Verlust von gemeinsamen Fragmenten, ist es nicht möglich, unbekannte Metaboliten mit dieser Methode zu identifizieren.
In den letzten Jahren haben die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) Instrumente veröffentlicht worden, wie der LTQ-Orbitrap und Exactive Serie, die QuanTof und TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kann eine Masse bereitzustellen Verhältnis (m / z) von intakten Ionen innerhalb eines Fehlers von einigen ppm berechnen. Daher kann eine HRMS Instrument der Erfassung aller Vorläuferionen (dh Scan-Modus) betrieben direkte Strukturinformation von der exakten Masse und der daraus resultierenden elementaren Zusammensetzung des Analyten zu erhalten, und diese Informationen können verwendet werden, um potentiellen Metaboliten zu identifizieren. In der Tat können alle Informationen über eine Verbindung mit einer exakten Masse erhalten werden, bis auf die Ebene der strukturellen Isomere. Auch eine VollScan-Methode erfordert keine Vorkenntnisse von Metaboliten und nicht Methodenoptimierung erfordern. Darüber hinaus, da alle Ionen mit m / z in den Scan-Bereich fallen, kann analysiert werden, hat HRMS eine nahezu unbegrenzte Kapazität in Bezug auf die Anzahl der Metaboliten, die in einem einzigen Lauf quantifiziert kann im Vergleich zu der MRM-Methode werden. HRMS ist auch vergleichbar mit einem Triple-Quadrupol-MRM in der quantitativen Kapazität aufgrund der kurzen Arbeitszyklus, was zu einer vergleichbaren Anzahl von Datenpunkten, die in einem Voll MS erhalten werden, können zu scannen. Daher stellt HRMS einen alternativen Ansatz für die quantitative Metabolomics. Vor kurzem hat eine verbesserte Version des HRMS bezeichnet Q-Exactive Massenspektrometrie (QE-MS) können unter dem Wechsel zwischen positiven und negativen Arten mit ausreichend schnellen Zykluszeiten in einer einzigen Methode, die den Erfassungsbereich 19 erweitert betrieben werden. Hier beschreiben wir unsere Metabolomics-Strategie mit der QE-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Metabolite Profiling in Zellen mit diesem Protokoll sind: 1) die Steuerung des Wachstumsmediums und sorgfältige Entnahme der Zellen; 2) Einstellen des LC-Verfahren auf Basis von MS-Methode Einrichtung, um sicherzustellen, gibt es genug (in der Regel mindestens 10) Datenpunkte über einen Peak für die Quantifizierung; 3) macht einen geringen Masse Kalibrierung, bevor Sie Proben; 4) Einspritzen nicht mehr als 5 ml Retentionszeit zu vermeiden und Schaltspitzenverbreiterung …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) und Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) für wertvolle Diskussionen über Massenkalibrierung und Datenverarbeitung bestätigen. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R00CA168997 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
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