En strategi for følsomme, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Summary

Metabolite profilering har været et værdifuldt aktiv i studiet af stofskiftet i sundhed og sygdom. Ved hjælp af normal-faset væskekromatografi koblet til høj opløsning massespektrometri med polaritet skift og en hurtig arbejdscyklus beskriver vi en protokol til at analysere polære metaboliske sammensætning af biologisk materiale med høj følsomhed, nøjagtighed og opløsning.

Abstract

Metabolite profilering har været et værdifuldt aktiv i studiet af stofskiftet i sundhed og sygdom. Men nuværende platforme har forskellige begrænsende faktorer, såsom arbejdskraftintensive prøve præparater, lave detektionsgrænser, langsomme scan hastigheder, intensiv metode optimering for hver metabolit, og den manglende evne til at måle både positivt og negativt ladede ioner i enkelte eksperimenter. Derfor kunne en roman metabolomics protokol rykke metabolomics studier. Amid-baserede hydrofile kromatografi muliggør polær metabolit analyse uden nogen kemisk derivatisering. Høj opløsning MS ved hjælp af Q-Exactive (QE-MS) har forbedret ion optik, øget scanningshastigheder (256 msek hos opløsning 70.000), og har evnen til at udføre positiv / negativ omskiftning. Ved hjælp af en kold methanolekstraktion strategi og koble et amid søjle med QE-MS giver robust detektion af 168 målrettede polære metabolitter og tusindvis af ekstra funktioner samtidigt. Daten behandlingen foretages med kommercielt tilgængeligt software på en meget effektiv måde, og ukendte features ekstraheret fra massespektrene kan forespørges i databaser.

Introduction

Metabolomics, defineret som et eksperiment, der måler flere metabolitter samtidigt, har været et område for intens interesse. Metabolomics giver en direkte udlæsning af molekylær fysiologi og har givet indsigt i udvikling og sygdom som kræft ^1-4. Kernemagnetisk resonans (NMR) og gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er blandt de mest almindeligt anvendte instrumenter ^5-9. NMR, især har været anvendt til flux eksperimenter, da tung isotop mærkede forbindelser, såsom ^13C mærkede metabolitter, er NMR-aktive ^10,11. Men denne strategi kræver relativt høj prøve renhed og stor stikprøve mængde, hvilket begrænser dens anvendelse i metabolomics. I mellemtiden, data indsamlet fra NMR har brug for intensiv analyse og sammensatte tildeling af komplekse NMR-spektre er vanskelig. GC-MS har været meget anvendt til polære metabolitter og lipid undersøgelser, men det kræver flygtig compounDS og derfor ofte derivatisering af metabolitter, som undertiden involverer komplekse kemi, der kan være tidskrævende og introducerer eksperimentel støj.

Væskekromatografi (LC) koblet til tripel kvadrupol massespektrometri bruger den første kvadrupol for udvælgelse af de intakte moderioner, som derefter fragmenteret i den anden kvadrupol, mens den tredje kvadrupol bruges til at vælge karakteristiske fragmenter eller datterioner. Denne metode, som registrerer overgangen fra moderioner specifikke datterioner, der betegnes multipel reaktion overvågning (MRM). MRM er en meget følsom, specifik og robust metode til både lille molekyle og protein kvantificering ^12-15,21. MRM har dog sine begrænsninger. For at opnå høj specificitet et MRM metode skal bygges for hver metabolit. Denne metode består i at identificere en specifik fragment og tilsvarende optimeret kollision energi, som kræver forudgående kendskab til properties af metabolitter af interesse, såsom kemiske struktur information. Derfor, med nogle undtagelser, der omfatter det neutrale tab af fælles fragmenter, er det ikke muligt at identificere ukendte metabolitter med denne metode.

I de senere år har høj opløsning massespektrometri (HRMS) instrumenter blevet frigivet, såsom LTQ-orbitrap og Exactive serie, QuanTof og TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS kan give en masse til ladningsforhold (m / z) af intakte ioner inden for en fejl på nogle få ppm. Derfor kan et HRMS instrument betjent ved at detektere alle precursor ioner (dvs. fuld scan mode) få direkte strukturel information fra den nøjagtige masse og den deraf elementært sammensætning af analysanden, og denne information kan bruges til at identificere potentielle metabolitter. Faktisk kan alle oplysninger om en forbindelse opnås med en nøjagtig masse, op til niveauet af strukturelle isomerer. Også en fuldscan metode kræver ikke forudgående kendskab til metabolitter og ikke kræver metode optimering. Da alle ioner med m / z falder i scanning rækkevidde kan analyseres, HRMS har en næsten ubegrænset kapacitet i form af antallet af metabolitter, som kan kvantificeres i et enkelt løb i forhold til MRM metoden. HRMS kan også sammenlignes med en tredobbelt quadrupol MRM i kvantitativ kapacitet på grund af den korte arbejdscyklus resulterer i et sammenligneligt antal datapunkter, der kan opnås i en fuld MS scanning. Derfor HRMS giver en alternativ metode til kvantitative metabolomics. For nylig, en forbedret version af HRMS betegnes Q-Exactive massespektrometri (QE-MS) kan drives under skift mellem positive og negative tilstande med tilstrækkelig hurtig cyklustider i en enkelt metode, som udvider detekteringsområde ^19. Her beskriver vi vores metabolomics strategien under anvendelse af QE-MS.

Protocol

1.. Udarbejdelse af LC-MS reagenser, Etablering af en Chromatography Method, og Etablering af Instrument Operating Procedures Fremstilling af LC Opløsningsmidler Forbered 500 ml mobile faser. A er 20 mM ammoniumacetat og 15 mM ammoniumhydroxid i 3% acetonitril / vand, endelig pH 9,0; og B er 100% acetonitril. Løst låg på flasken, som anbringes i et vandbad sonicator, og sonikeres i 10 min uden ekstra opvarmning. (Dette trin er at sikre, at alle ammoniumsaltene opløses fuldstændigt, og…

Representative Results

Nøjagtigheden af ​​metabolomics data meget afhænger af LC-QE-MS instrument performance. For at vurdere, om instrumentet fungerer i god stand, og om den anvendte metode er korrekt, er der flere kendte metabolit LC toppe udvundet fra samlede ionkromatografi (TIC), som vist i fig. 1. Polar metabolitter, herunder aminosyrer, glycolyse mellemprodukter , TCA mellemprodukter, nukleotider, vitaminer, ATP, NADP + og så videre har god opbevaring om søjlen og god Topformerne i amid kolonnen unde…

Discussion

De mest kritiske skridt for en vellykket metabolit profilering i celler ved hjælp af denne protokol er: 1) at styre mediet vækst og omhyggelig udvinding af cellerne; 2) justering af LC metode baseret på MS metode setup til at sikre, at der er nok (normalt mindst 10) datapunkter på tværs af et højdepunkt for kvantificering; 3) gør en lav masse kalibrering før kører prøver; 4) at indsprøjte mere end 5 ml for at undgå retentionstid skiftende og topforbredning forårsaget af vand; og 5) at forberede og kører pr…

Materials

Positive calibration mix	Thermo Scientific	#88323	It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix	Thermo Scientific	#88324	Store at 4 °C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert	Fisher Scientific	#1303200	This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column	Waters	#186004860	Guard column is recommend to increase column lifetime.