Summary
Metabolit profilering har varit en värdefull tillgång i studien av ämnesomsättningen i hälsa och sjukdom. Använda normal faser vätskekromatografi kopplad till högupplösande masspektrometri med polaritet växling och en snabb arbetscykel, beskriver vi ett protokoll för att analysera den polära metaboliska sammansättning av biologiskt material med hög känslighet, noggrannhet och upplösning.
Abstract
Metabolit profilering har varit en värdefull tillgång i studien av ämnesomsättningen i hälsa och sjukdom. Men nuvarande plattformar har olika begränsande faktorer, såsom arbetsintensiva provpreparat, låga detektionsgränser, långsamma skanningshastigheter, intensiv metod optimering för varje metabolit, och oförmågan att mäta både positivt och negativt laddade joner i enstaka experiment. Därför skulle en ny metabolomicsen protokoll avancera metabolomik studier. Amid-baserade hydrofila kromatografi möjliggör polära metabolit analys utan någon kemisk derivatisering. Högupplöst MS med hjälp av Q-Exactive (QE-MS) har förbättrat jon optik, ökad skanningshastigheter (256 ms vid upplösning 70.000), och har förmågan att utföra positiv / negativ omkoppling. Med hjälp av en kall metanolutvinning strategi, och koppling en amid kolonn med QE-MS möjliggör robust detektering av 168 riktade polära metaboliter och tusentals ytterligare funktioner samtidigt. Daten behandling genomförs med kommersiellt tillgänglig programvara på ett mycket effektivt sätt, och okända egenskaper extraherade från masspektra man kan söka i databaser.
Introduction
Metabolomik, definierat som ett experiment som mäter flera metaboliter samtidigt, har varit ett område av stort intresse. Metabolomics ger en direkt avläsning av molekylär fysiologi och har gett insikter i utveckling och sjukdom som cancer 1-4. Kärnmagnetisk resonans (NMR) och gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) är bland de mest använda instrumenten 5-9. NMR, särskilt använts för flödes experiment eftersom tung isotop märkta föreningar, såsom 13 C-märkta metaboliter, är NMR-aktiva 10,11. Detta kräver dock strategi relativt hög prov renhet och stor provmängd, vilket begränsar dess tillämpningar inom metabolomik. Under tiden data från NMR behöver intensiv analys och förening tilldelning av komplexa NMR-spektra är svårt. GC-MS har i stor utsträckning använts för polära metaboliter och lipid studier, men det kräver flyktigt compounDS och därför ofta derivatisering av metaboliter, vilket ibland innebär komplexa kemi som kan vara tidskrävande och introducerar experimentell buller.
Vätskekromatografi (LC) kopplat till trippelkvadrupolmasspektrometer masspektrometri använder den första quadrupol för att välja intakta moderjoner, som sedan splittrade i andra kvadrupol, medan den tredje quadrupol används för att välja karaktäristiska fragment eller dotterjoner. Denna metod, som registrerar övergången från moderjoner till specifika dotterjoner, betecknas flertal reaktionsövervakning (MRM). MRM är en mycket känslig, specifik och robust metod för både småmolekylära och protein kvantifiering 12-15,21. Men MRM har sina begränsningar. För att uppnå hög specificitet ett MRM metod måste byggas för varje metabolit. Denna metod består av att identifiera ett specifikt fragment och motsvarande optimerad kollisionsenergi, som kräver förkunskaper om properties av metaboliter av intresse, såsom kemisk struktur informationen. Därför, är med några undantag som innebär neutrala förlusten av gemensamma fragment det inte möjligt att identifiera okända metaboliter med denna metod.
Under de senaste åren har högupplösande masspektrometri (HRMS) instrument släppts, såsom LTQ-Orbitrap och Exactive serien, QuanTof och TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kan ge en massa till laddningsförhållande (m / z) av intakta joner inom ett fel av några få ppm. Därför kan en HRMS instrument som drivs av att upptäcka alla föregångare joner (dvs fullständig genomsökning läge) få direkt strukturell information från den exakta massan och den resulterande grundämnessammansättningen av analyten, och denna information kan användas för att identifiera potentiella metaboliter. I själva verket kan all information om en förening kan erhållas med en exakt massa, upp till nivån av strukturella isomerer. Också, en fullständigsökmetod inte kräver förkunskaper av metaboliter och inte kräver metod optimering. Eftersom alla joner med m / z falla in i frekvensområde kan analyseras, har HRMS en nästan obegränsad kapacitet i termer av antal metaboliter, som kan kvantifieras i en enda körning jämfört med MRM metoden. HRMS är också jämförbart med en trippelkvadrupol MRM i kvantitativa kapacitet på grund av den korta driftcykel resulterar i ett jämförbart antal datapunkter som kan erhållas i en komplett MS skanna. Därför ger HRMS en alternativ metod för kvantitativa metabolomik. Nyligen, en förbättrad version av HRMS kallas Q-Exactive masspektrometri (QE-MS) kan drivas under omkopplingen mellan positiva och negativa lägen med tillräckligt snabba cykeltider i en enda metod, som expanderar detektionsområdet 19. Här beskriver vi vår metabolomik strategi med hjälp av QE-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av LC-MS reagenser, Inrättande av en Kromatografi metod, och Etablering av Instrument Operating Procedures
- Beredning av LC Lösningsmedel
- Bered 500 ml mobila faser. A är 20 mM ammoniumacetat och 15 mM ammoniumhydroxid i 3% acetonitril / vatten, slutligt pH 9,0; och B är 100% acetonitril.
- Löst lock flaskan, placera den i ett vattenbad sonicator, och låt ligga i 10 minuter utan extra uppvärmning. (Detta steg är för att säkerställa att alla de ammoniumsalter fullständigt lösa och att det inte finns några kvarvarande luftbubblor.)
- Överför 250 ml av lösningsmedel till en 250 ml glasflaska för LC-MS-användning, och hålla resten vid 4 ° C.
- Förbered låga massområdet kalibreringslösning. Det är viktigt att använda en anpassad low massområde calibration blandningen under metabolomik tillämpningar för att säkerställa att korrekta massorna detekteras vid låga molekylvikter.
- Väg upp 5 mg av både Sodium fluoracetat och homovanillinsyra och lös dem i 5 ml vatten till en slutlig koncentration av 1 mg / ml. Lös upp diazinon i metanol för att göra en slutlig koncentration av 10 mg / ml.
- För att bereda 1 ml negativ låg massa kalibreringslösning, blanda 960 ml av termo negativt kalibreringslösningen med 20 ml natrium fluoroaceate och homovanillinsyra lösning. För att göra 1 ml positiv låg massa kalibreringslösning, blanda 990 ml av termo positiv kalibreringslösning och 10 ml diazinon lösning. (Den kalibreringslösning låg massa skall lagras vid 4 ° C och beredas på nytt var 2 månader.)
- Kalibrering av QE-MS till en låg massområde
- Innan kalibrering låg massområde, genomföra en vanlig masskalibrering (m / z, 150-2,000) i både positiva och negativa lägen baserat på tillverkarens anvisningar.
- När en vanlig masskalibrering passerar, justera avsökning till 60-900 m / z på instrumentkontrollpanelenoch en källa CID av 25 eV för positiva läge och 35 eV för negativa läget används. (Detta kommer att ge robusta signaler av koffeinet fragmentjon och sulfatjon. Avsökningsintervall här är fast, eftersom den sista m / z inte bör vara större än 15x av utgångs m / z)
- När jonkällan är stabil, sedan utföra den anpassade kalibreringen. Anm: En stabil källa definieras som mindre än 10% av den totala jonströmmen variation i positiv mod, och mindre än 15% i negativt läge. De anpassade kalibreringsjoner och motsvarande m / z är angivna i tabell 1.
- Upprätta LC-MS instrument för polära metabolit analys. LC är kopplad till en QE-MS för metaboliten separation och detektion.
- Utrusta QE-MS med en uppvärmd elektrosprayjonisering sond (H-ESI). Ställ de relevanta avstämningsparametrar för sonden enligt listan: värmare temperatur, 120 ° C; slida gas, 30; hjälpgas, 10; svepgas, 3; Spraya spänning, 3,6 kV förpositiva läge och 2,5 kV för negativ läge. Ställ kapillärens temperatur vid 320 ° C och S-lins vid 55.
- Bygga en fullständig genomsökning metod enligt följande: Fullständig avsökning: 60-900 (m / z); upplösning: 70.000; injektion maximal tid: 200 msek med typiska insprutningstider runt 50 ms; automatisk förstärkningsreglering (AGC): 3000000 joner. Dessa inställningar resulterar i en kapacitet på cirka 550 msek för att utföra genomsökningar i både positiv och negativ läge.
- Upprätta kromatografi metoden. Anställ en amid kolonn (100 x 2,1 mm id, 3.5 mm) för föreningen separation vid rumstemperatur 13,15. Den mobila fasen A är såsom beskrivits ovan, och mobil fas B är acetonitril. Använd en linjär gradient som följer: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% B och 20 min, 85% B. Flödeshastigheten är 0,15 ml / minut från 0 till 10 minuter och 15 till 20 min, och 0,3 ml / min 10,5 till 14,5 min.
2. Preparation metabolit Prov
- Förbered en extraktion lösningsmedel. Blanda 40 ml metanol (LC-MS-kvalitet) och 10 ml vatten (LC-MS-kvalitet) i en 50 ml tub, och hålla den i -80 ° C frys under minst 1 timme före användning. OBS: Denna procedur och stegen nedan kan modifieras för utvinning av biologisk vävnad och vätskeprover.
- Kultur coloncancer HCT 8 celler i tre 10 cm skålar eller 6-brunnsplattor med full tillväxtmedium, RPMI 1640 supplementerat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 100.000 enheter / l penicillin och 100 mg / l streptomycin.
- När cellerna når 80% sammanflödet, snabbt avlägsna mediet, och placera skålen eller tallrik ovanpå torris 13,15. Tillsätt 1 ml extraktionslösningsmedel omedelbart (80% metanol / vatten), och överför plattan i -80 ° C frys. För en 10 cm skål, tillsätt 3 ml av extraktionslösningsmedel till varje brunn. (Försök att ta bort mediet så mycket som möjligt för att undvika att jon undertryckande effekt på grund av kvarvarande salter från medium.)
- Låt plattan i 15 min. Ta bort den från frysen, och skrapa cellerna i lösningsmedlet på torris. Överför lösningen till 1,7 ml Eppendorf-rör och centrifugera med en hastighet av 20.000 xg vid 4 ° C under 10 min. (Förbered cell metaboliter från tre olika rätter att göra tre likadana prover. Syftet med att hålla två rör är att ha en som backup.)
- Överför supernatanten till två nya Eppendorf-rör, och torka dem i en hastighet vakuum. Det tar ca 3-6 timmar beroende på vilken hastighet vakuum används. (Proverna kan även torkas över natten under kvävgas.)
- Efter torkning förvara rören av varje prov i -80 ° C frys. När klar, rekonstruera ett prov i 20 ml vatten (LC-MS-grade), och injicera 5 ml för LC-QE-MS för analys.
3. Inställning av prov Sekvens
- När kalibreringen har utförts på rätt sätt på QE-MS, jämvikt LC kolumnen för 5 min med 85% A vid ett flödehastighet av 0,15 ml / min, som är utgångs tillståndet hos LC-gradient.
- Ställ in provsekvens i slumpvis ordning. Anmärkning: På detta sätt fördelar den fluktuationerna införts av LC-MS till varje prov och säkerställer mer korrekt jämförelse mellan olika prover. Varje sex prover, tillsätt en tvätt run, som delar samma MS-metod, med undantag av den LC-gradient är 95% A under 10 minuter och följdes av en 5 min-kolonn jämviktning vid 85% A, med en flödeshastighet av 0,15 ml / min. Lägg blankprover (100% vatten) efter varje tvätt körning för att bedöma systemet bakgrunden och föra över nivåerna.
- Spara sekvensen och när LC-kolumnen visar stabilt tryck, ca 400 psi, starta sekvenskörning. Om det inte finns något annat prov som ska köras efter denna sekvens, tillsätt sedan en stoppbana i slutet av sekvensen, som har en flödeshastighet av 0 ml / min i slutet av gradienten och välj "standby" efter avslutad sekvens.
- Köra om samma urval som 12 timmar efter kalibrering. (Detta har jags för att bedöma mass fel fluktuationer efter kalibrering.)
4. Inlägg Analys Instrument Rengöring och underhåll
- Vid slutet av sekvensen, tvätta kolonnen med 95% A vid en flödeshastighet av 0,2 ml / min under 2 h och vid behov backa kolonnen innan tvätt.
- Ta bort LC kolumnen och direkt ansluta LC till jonkälla med en fackförening. Förbered rengöringslösningsmedel, vatten / metanol / myrsyra (v: v: v, 90:10:0.2) ställer MS den vänteläge och tvätt LC-MS-systemet vid en flödeshastighet av 0,1 ml / min under 1 h för att avlägsna rest utfällda salter eller andra föroreningar. Sänk ned flödeshastigheten om det finns för mycket systemtrycket.
- Ställ kapillärens temperatur vid 50 ° C och avlägsnande av jon bur. Ta försiktigt ut jon sopa konen och jon överföringsröret efter kapillär temperaturen sjunker till 50 ° C. Använd en grov mesh, såsom sandpapper, för att avlägsna föroreningar kvar på ytan av jonen svep kon.
- Placera jonöverföringrör i ett 15 ml Falcon-rör innehållande 10 ml 90% vatten / metanol med 0,1% myrsyra. Efter sonicating röret i ett vattenbad sonicator i 20 min, dekantera lösningsmedlet inuti, ersätta det med 10 ml ren metanol och låt ligga i ytterligare 20 minuter. (Om så är nödvändigt kan sonikering utföras vid 40 ° C eller en ännu högre temperatur för att åstadkomma bättre rengöringsresultat.)
5. Analys av LC-MS-data
- För att säkerställa att provsekvensen löper smidigt, efter att ha avslutat de två första proverna i sekvensen, kolla toppar för okända metaboliter. Använd en csv-fil som listar metabolit namn, neutral kemisk formel och upptäckt läge (antingen positiv eller negativ), som ingångsfilen och utdatafilen innehåller extraherade toppar och massa fel i ppm. Om toppformen är onormal eller massan felet är av med mer än 5 ppm, sedan resten av sekvensen måste stoppas och felsökning som behöver göras.
- Välj den metod för "peak anpassningoch ram utvinning "på kommersiellt tillgänglig programvara. Välj rådata från LC-MS och gruppera dem. Pick prov i mitten av körningen sekvens såsom kromatografi referensprov för maximal justering. Ladda upp en ram frö inklusive kända metaboliter för riktade metaboliter analys med uppgifter som samlats in och motsvarande ram frö.
- Utför dataanalys i positivt och negativt läge separat. Använd standardinställningen för andra parametrar. Stäng av sökfunktionen i databasen och köra arbetsflödet. Exportera data som behandlas som ett Excel-ark som innehåller topparean för varje bildruta. De första uppsättningarna ramar motsvarar metaboliter i den riktade lista. Anm: För en riktad metabolitanalys är informationen metaboliter som erhållits på grundval av de tidigare studier 13,15.
- För en oriktade metabolitanalys, välja den metod för "komponent utvinning". Ladda blankprover för bakgrundssubtraktion. Ställ toppintensitetströskel at 10 5, m / z bredd på 10 ppm och signal-brus-förhållande på 3.
- Använd mänsklig metabolomen databas för okända föreningar identifiering. Använd ett CV-filter för att avlägsna komponenter med stora CV inom replikatprover. Gå manuellt genom varje komponent och plocka dem med väldefinierad topp eller relativt stor skillnad i olika prover typer för databassökning. Exportera data med träffar i databasen. (Peak anpassning skulle kunna kringgås om toppinriktnings värdering är för låg.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Noggrannheten i metabolomik data beror i hög grad på LC-QE-MS instrumentprestanda. För att bedöma om instrumentet används i gott skick, och om den metod som tillämpas är riktig, är flera kända metabolit LC toppar utvinns från den totala jonkromatografi (TIC), som visas i figur 1. Polar metaboliter, inklusive aminosyror, glykolys intermediärer , TCA intermediärer, nukleotider, vitaminer, ATP, NADP + och så vidare har god retention på kolumn och bra topp former i amid kolumnen under rådande LC förhållanden. Samtidigt är en mass fel test gjort inom 24 h efter låg massa kalibrering, såsom illustreras i figur 2. Sex olika koncentrationer av prover i tre exemplar körs två gånger efter kalibrering, och hela tidsområdet täcker nästan 24 timmar. Massan fel bedöms genom att jämföra den detekterade m / z till den teoretiska m / z av riktade metaboliter. Här de riktade metaboliter har ett m / zintervallet 74 (glycin) till 744 (NADP +). Y-axeln representerar här den ackumulativa procentandel av metaboliter inom viss massa felintervall. Den blå kurvan visar resultatet 0-12 timmar, medan den röda kurvan visar data som samlats in från 12 till 24 timmar. Figur 2 visar tydligt att mer än 90% av metaboliter är inom 5 ppm massa fel, vilket innebär att det låg massa intervall kalibreringsmetod som utvecklats här är tillräckligt för att hålla 5 ppm massa fel för låg detektionsmassområde.
En annan fråga som skall behandlas är känsligheten på instrumentet med den nuvarande metoden och instrumentinställningar. En serieutspädning av trippelprover från 10 cm petriskål gjordes 5 gånger med en utspädningsfaktor på sex, att hamna med sex olika koncentrationer av prover. Dessa prover representerar mängden metaboliter extraherade från 10 7, 1,67 x 10 6, 2,78 x 10 5, 4,63 x 10 4, 7,72 x 10 3, och 1,29x 10 3 celler, respektive. Eftersom varje koncentration av prov är upprättad i tre exemplar, är totalt 18 prover analyserats i LC-QE-MS. En riktad lista används för att bedöma hur många metaboliter upptäckts vid för olika koncentration av prov. Resultatet i figur 3 visar att det optimala antalet målinriktade metaboliter detekterats är mellan 2,78 x 10 5 och 1,67 x 10 6 celler, medan 1 x 10 7 celler ger ett färre antal upptäckta metaboliter, vilket beror på jon-undertryckande effekter. Detta resultat indikerar att den optimala mängden av cellerna för att extrahera för denna analys är ungefär den hos en brunn i en 6-brunnsplatta.
För oriktade metabolitanalys är en CV-cutoff på 20% och ett genomsnittligt intensitetsvärde av 10 7 används för att filtrera tabellen komponenter. Dessa styva CV och medelintensiteten tröskelvärden används för denna demonstration mål. För att förbättra reproducerbarheten kan CV cutoff-värden varaökad (till exempel 30%), medan de genomsnittliga intensitetsvärden behöva minskas (till exempel 10 5) att inkludera fler toppar. Efter manuell kontroll toppar, är komponenter med goda former utvalda och sökte i människo metabolomen databasen. Resultaten visas i tabell 2. Tabell 2A listar resultaten från data som insamlats i positiv mod, medan tabell 2B visar resultaten från negativt läge. Några av de metaboliter som identifierats här överlappar de metaboliter i riktad lista, såsom glutation, prolin och så vidare, men under tiden, ytterligare metaboliter frånvarande från den riktade listan utforskas, såsom methyglyoxal, som kan härledas från glykolysen, och 1 -palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin, som påvisas i positivt med en retentionstid av 3,2 min, vilket är en skälig retentionstid för fosfolipider på en amid-kolonn. Ett protokoll om oriktade metabolit databassökning har varit previously rapporterade 20.
Figur 1. Exempel på LC-MS-kromatografiska toppar. Här är den rekonstruerade kromatografi genereras med ett massfönster av 10 ppm (m / z ± 5 ppm). X-axeln visar uppehållstid, medan Y-axeln visar den relativa intensiteten, och toppintensiteten listas ovanför varje metabolit. A visar toppar detekterade från positiva läget, medan B visar toppar från negativt läge. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. 60;. Utvärdering av kalibrerings låg massområde Y-axeln är den kumulativa andelen metaboliter med mass upptäckt felet inom 5 ppm. X-axeln är massan felintervallet i ppm. Blå och röda kurvorna representerar 0-12 timmar och 12-24 timmar, respektive. Klicka här för att visa en större bild.
. Figur 3 Utvärdering av provmängd -. Antal riktade metaboliter upptäckts kontra antalet HCT 8 celler Röda fyrkanter representerar metaboliter upptäckts i positivt läge, blå cirklar menar metaboliter mätt i negativt läge, och de svarta trianglarna är det totala antalet metaboliter från både positivt och negativt läge. X-axeln visar antalet HCT 8 celler.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
| Standarder | M / Z, positivt tillstånd | M / Z, negativt tillstånd | Neutral formel | Neutral massa |
| n-butylamin | 74.096425 | NA | C 4 H 11 N | 73.089149 |
| Koffein-fragmentet | 138.066188 | NA | C 6 H 8 N 3 O | 137.058912 |
| Koffein | 195.087652 | NA | C 8 H 11 N 4 O 2 | 194.080376 |
| Diazinon | 305.108329 | NA | C 12 H 20 N 2 O 3 PS | 304.101053 |
| MRFA peptid | 524.264966 | <td> NAC 23 H 37 N 7 O 5 S | 523,25769 | |
| Fluoracetat | N / A | 77.004432 | C 2 H 3 FO 2 | 78.011708 |
| Sulfat | N / A | 96.960106 | H 2 SO 4 | 97.967382 |
| Homovanillinsyra | N / A | 181.050634 | C 9 H 10 O 4 | 182,05791 |
| Dodecylsulfat | N / A | 265.147906 | C 12 H 26 SO 4 | 266.155182 |
| Taurocholat | N / A | 514.2844 | C 26 H 45 NO 7 S | 515.291676 |
Tabell 1. Låg massa range kalibreringsstandarder och deras exakta m / z.
| CSID | Namn | Formel | Monoisotopisk Mass | Sök Mass | Fel (ppm) | RT (min) |
| 234 | beta-alanin | C 3 H 7 NR 2 | 89,04800 | 89,04805 | 0,62 | 8,08 |
| 1057 | Sarkosin | C 3 H 7 NR 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4,22 | 8,08 |
| 5735 | alanin | C 3 H 7 NR 2 | 89,04768 | 89,04805 | 4,22 | 8,08 |
| 568 | Kreatinin | C 4 H 7 N 3 O | 113,05900 | 113,05889 | 1,00 | 4,41 |
| 128566 | Prolin | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06338 | 0,41 | 7,54 |
| 6050 | L-(+)-valin | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0,18 | 7,42 |
| 7762 | Amylnitrit jag | C 5 H 11 NO 2 | 117,07898 | 117,07896 | 0,18 | 7,42 |
| 135 | 5-amino-valeriansyra | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7,42 |
| 242 | trimetylglycin | C 5 H 11 NO 2 | 117,07900 | 117,07896 | 0,38 | 7,42 |
| 911 | Niacinamid | C6H6N2O | 122,04800 | 122,04793 | 0,55 | 2,60 |
| 1091 | Taurin | C 2 H 7 NO 3 S | 125,01466 | 125,01469 | 0,20 | 7,61 |
| 1030 | Pyrrolin hydroxikarboxylsyra | C 5 H 7 NR 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 7127 | PCA | C 5 H 7 NR 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 90657 | N-Acryloylglycine | C 5 H 7 NR 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 388752 | 5-oxo-D-prolin | C 5 H 7 NR 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 389257 | 3-hydroxi-3 ,4-dihydro-2H-pyrrol-5-karboxylsyra | C 5 H 7 NR 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,02 | 8,51 |
| 8031176 | Pyrrolidonecarboxylic syra | C 5 H 7 NR 3 | 129,04259 | 129,04259 | 0,03 | 8,51 |
| 5605 | Hydroxiprolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | <td> 131,059015,83 | 8,08 | |
| 79449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 167744 | L-glutaminsyra-gamma-semialdehyd | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 388519 | 5-amino-2-oxopentansyra | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05901 | 5,83 | 8,08 |
| 134 | Aminolevulinsyra | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 </ Td> | 7,70 | 8,08 |
| 9312313 | 3-hydroxi-L-prolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05901 | 7,70 | 8,08 |
| 566 | Kreatin | C 4 H 9 N 3 O 2 | 131,06900 | 131,06905 | 0,36 | 8,08 |
| 5880 | L-(+)-leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 6067 | L-(+)-isoleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 19964 | L-norleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 </ Td> |
| 388796 | beta-Leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09455 | 0,68 | 6,96 |
| 548 | Aminokapronsyra | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09455 | 3,48 | 6,96 |
| 6031 | L-(-)-asparagin | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05348 | 0,10 | 8,31 |
| 109 | Ureidopropionsyra | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05348 | 3,71 | 8,31 |
| 6026 | L-ornitin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0,02 | 10,37 |
| 64236 | D-ornitin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08988 | 0,02 | 10,37 |
| 5746 | Glutamin | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 128633 | D-glutamin | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 141172 | Ureidoisobutyric syra | C 5 H 10 N 2 O 3 | 146,06914 | 146,06900 | 0,93 | 8,25 |
| 21436 | N-metyl-<scp> D </ scp>-asparaginsyra | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 21814 | D-(-)-glutaminsyra | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 30572 | L-(+)-glutaminsyra | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 58744 | N-acetyl-L-serin | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05300 | 1,13 | 8,06 |
| 5907 | L-(-)-metionin | C 5 H 11 NO 2 S | 149,05106 | 149,05095 | 0,70 | 7,39 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06940 | 0,48 8,33 | |
| 5910 | L-(-)-fenylalanin | C 9 H 11 NO 2 | 165,07898 | 165,07887 | 0,63 | 6,60 |
| 1025 | Pyridoxin | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 4463 | Oxidopamine [USAN: INN] | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 102750 | 5 - (2-aminoetyl)-Pyrogallol | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 388394 | Noradrenalin | C 8 H 11 NO 3 | 169,07390 | 169,07376 | 0,80 | 3,24 |
| 6082 | L-(+)-arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1,39 | 10,77 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11144 | 1,39 | 10,77 |
| 780 | heteroauxin | C 10 H 9 NO 2 | 175,06300 | 175,06304 | 0,18 | 2,32 |
| 67261 | Indol-3-acetaldehyd, 5-hydroxi- | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1,65 | 2,32 |
| 3574185 | Indol-2-ättiksyra | C 10 H 9 NO 2 | 175,06332 | 175,06304 | 1,65 | 2,32 |
| 5833 | L-(-)-tyrosin | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 389285 | 3-amino-3-(4-hydroxifenyl) propansyra | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 13628311 | L-treo-3-fenylserin | C 9 H 11 NO 3 | 181,07390 | 181,07378 | 0,66 | 7,48 |
| 425 | 4-hydroxi-4-(3-pyridyl) butansyra | C 9 H 11 NO 3 | 181,07401 | 181,07378 | 1,25 | 7,48 |
| 13899 | 3 - (1 H-indol-3-yl) akrylsyra | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0,15 | 6,44 |
| 10607876 | Indolakrylsyra | C 11 H 9 NO 2 | 187,06332 | 187,06330 | 0,15 | 6,44 |
| 389120 | N6, N6, N6-trimetyl-L-lysin | C 9 H 20 N 2 O 2 | 188,15248 | 188,15221 | 1,45 | 10,87 |
| 388321 | 5 "-S-metyl-5"-thioadenosine | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,08957 | 297,08898 | 2,00 | 2,56 |
| 144 | 9 - (5-s-metyl-5-thiopentofuranosyl)-9H-purin-6-amin | C 11 H 15 N 5 O 3 S | 297,09000 | 297,08898 | 3,43 | 2,56 |
| 111188 | Glutation | C 10H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08345 | 1,14 | 8,02 |
Tabell 2A.
| CSID | Namn | Formel | Monoisotopisk Mass | Sök Mass | Fel (ppm) | RT (min) |
| 857 | Metylglyoxal | C 3 H 4 O 2 | 72,02100 | 72,02108 | 1,03 | 7,70 |
| 1057 | Sarkosin | C 3 H 7 NR 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2,33 | 8,19 |
| 5735 | alanin | C 3 H 7 NR 2 | 89,04768 | 89,04747 | 2,33 | 8,19 |
| 234 | beta-alanin | C 3 H 7 NR 2 | 89,04800 | 89,04747 | 5,93 | 8,19 |
| 55423 | R-mjölksyra | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5,12 |
| 61460 | Hydroxipropionsyra | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5,12 |
| 96860 | L-(+)-mjölksyra | C 3 H 6 O 3 | 90,03169 | 90,03143 | 2,91 | 5,12 |
| 592 | Mjölksyra | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5,12 |
| 650 | Dihydroxiaceton | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5,12 |
| 731 | Glyceraldehyd | C 3 H 6 O 3 | 90,03200 | 90,03143 | 6,29 | 5,12 |
| 1086 | Svavelsyra | H 2 O 4 S | 97,96738 | 97,96683 | 5,63 | 8,13 |
| 128566 | Prolin | C 5 H 9 NO 2 | 115,06333 | 115,06302 | 2,67 | 7,78 |
| 1078 | Bärnstenssyra | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 466979 | Erythrono-1 ,4-lakton | C4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 4483398 | D-Erythronic g-lakton | C 4 H 6 O 4 | 118,02661 | 118,02630 | 2,66 | 7,72 |
| 473 | Metylmalonsyra | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5,96 | 7,72 |
| 8527138 | (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-ett | C 4 H 6 O 4 | 118,02700 | 118,02630 | 5,96 | 7,72 |
| 140384 | 2-ketocaproic syra | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 164251 | Methyloxovaleric syra | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 388419 | (3S)-3-metyl-2-oxopentansyra | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 15642233 | Ketoleucine | C 6 H 10 O 3 | 130,06299 | 130,06270 | 2,24 | 2,35 |
| 46 | a-oxo-p-metylvaleriansyra | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2,36 | 2,35 |
| 69 | Alfa-ketoisokapronsyra | C 6 H 10 O 3 | 130,06300 | 130,06270 | 2,36 | 2,35 |
| 134 | Aminolevulinsyra | 131,05800 | 131,05795 | 0,36 | 8,19 | |
| 9312313 | 3-hydroxi-L-prolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05800 | 131,05795 | 0,36 | 8,19 |
| 5605 | Hydroxiprolin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8,19 |
| 7068 | N-Acetylalanin | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8,19 |
| 79449 | Ac-Ala-OH | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8,19 |
| 89122 | Ethylformylglycine | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8,19 |
| 167744 | L-glutaminsyra-gamma-semialdehyd | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8,19 |
| 388519 | 5-amino-2-oxopentansyra | C 5 H 9 NO 3 | 131,05824 | 131,05795 | 2,23 | 8,19 |
| 5880 | L-(+)-leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 6067 | L-(+)-isoleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 19964 | L-norleucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 388796 | beta-Leucin | C 6 H 13 NO 2 | 131,09464 | 131,09419 | 3,39 | 7,09 |
| 548 | Aminokapronsyra | C 6 H 13 NO 2 | 131,09500 | 131,09419 | 6,18 | 7,09 |
| 109 | Ureidopropionsyra | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05299 | 132,05321 | 1,60 | 8,28 |
| 6031 | L-(-)-asparagin | C 4 H 8 N 2 O 3 | 132,05350 | 132,05321 | 2,21 | 8,28 |
| 6026 | L-ornitin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10,36 |
| 64236 | D-ornitin | C 5 H 12 N 2 O 2 | 132,08987 | 132,08961 | 1,98 | 10,36 |
| 193317 | L-(-)-äppelsyra | C4-H 6 O 5 | 134,02153 | 134,02130 | 1,72 | 7,95 |
| 510 | (±)-äppelsyra | C 4 H 6 O 5 | 134,02200 | 134,02130 | 5,25 | 7,95 |
| 133224 | threonic syra | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2,14 | 7,70 |
| 388628 | 2,3,4-Trihydroxybutanoic syra | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2,14 | 7,70 |
| 2061231 | DL-erythronic syra | C 4 H 8 O 5 | 136,03717 | 136,03688 | 2,14 | 7,70 |
| 21436 | N-metyl-<scp> D </ scp>-asparaginsyra | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 21814 | D-(-)-glutaminsyra | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 30572 | L-(+)-glutaminsyra | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 58744 | N-acetyl-L-serin | C 5 H 9 NO 4 | 147,05316 | 147,05299 | 1,16 | 8,05 |
| 6038 | Histidin | C 6 H 9 N 3 O 2 | 155,06947 | 155,06930 | 1,09 | 8,36 |
| 199 | Allantoin | C 4 H 6 N 4 O 3 | 158,04401 | 158,04387 | 0,88 | 4,76 |
| 6082 | L-(+)-arginin | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0,80 | 10,76 |
| 64224 | D-Arg | C 6 H 14 N 4 O 2 | 174,11168 | 174,11154 | 0,80 | 10,76 |
| 58576 | N-acetyl-L-asparaginsyra | C 6 H 9 NO 5 | 175,04807 175,04803 | 0,18 | 7,87 | |
| 996 | Pyrofosforsyra | H 4 O 7 P 2 | 177,94299 | 177,94331 | 1,79 | 8,42 |
| 5589 | Glukos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17893 | Mannos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 58238 | . Beta.-D-glukopyranos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 71358 | . Alfa.-D-glukopyranos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 134838 | 3-deoxi-arabino-hexonic syra | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388332 | L-sorbopyranos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388476 | beta-D-galaktopyranos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388480 | . Alfa.-D-galaktopyranos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 388775 | beta-D-fruktofuranos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 7,53 | |
| 10239179 | Inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 16736992 | Cis-inositol | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216070 | allos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 17216093 | L-sorbos | C 6 H 12 O 6 | 180,06339 | 180,06346 | 0,41 | 7,53 |
| 201 | hexopyranose | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 868 | 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol | C 6 H 12 O 6 | 180,06300 | 180,06346 | 2,53 | 7,53 |
| 2068 | Teofyllin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7,04 | 7,53 |
| 4525 | 1,7-dimetyl-xantin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7,04 | 7,53 |
| 5236 | Teobromin | C 7 H 8 N 4 O 2 | 180,06473 | 180,06346 | 7,04 | 7,53 |
| 1161 | isocitronsyra | C 6 H 8 O 7 | 192,02701 | 192,02704 | 0,15 | 8,18 |
| 305 | Citric syra | C 6 H 8 O 7 | 192,02699 | 192,02704 | 0,23 | 8,18 |
| 963 | pantotensyra | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6,72 |
| 6361 | D-pantotensyra | C 9 H 17 NO 5 | 219,11067 | 219,11049 | 0,84 | 6,72 |
| 960 | palmitinsyra | C 16 H 32 O 2 | 256,23999 | 256,24000 | 0,05 | 1,73 |
| 111188 | Glutation | C 10 H 17 N 3 O 6 S | 307,08380 | 307,08339 | 1,35 | 8,03 |
| 388337 | N-acetylneuraminsyra | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 | |
| 392681 | N-acetyl-alfa-neuraminsyra | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 |
| 392810 | Sialinsyra Neu5Ac | C 11 H 19 NO 9 | 309,10599 | 309,10585 | 0,45 | 7,43 |
Tabell 2B.
. Tabell 2 Förteckning över oriktade metaboliter upptäckts i HCT 8 celler (2.78 x 10 5 celler likvärdighet) Tabell 2A och 2B inkluderar komponenter utvinning uppgifter:. Uppehållstid, m / z och massa fel, och under tiden, sökresultat databas: ChemSpider ID ( CSID), namn, formel, och så vidare. Här de analyserade proverna är ekvationl till metaboliter extraherade från 2,78 x 10 5 celler, och tröskelnivån är 1 x 10 7 för att undvika omständlig resultat för demonstration mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrik metabolit profilering i celler med användning av detta protokoll är: 1) reglering av tillväxtmedium och försiktig extraktion av cellerna; 2) justering av LC-metoden bygger på MS-metod setup för att se till att det finns tillräckligt med (vanligen minst 10) datapunkter över en topp för kvantifiering; 3) gör en låg masskalibrering innan du kör prover; 4) insprutning inte mer än 5 ml för att undvika retentionstid skiftande och toppbreddning som orsakas av vatten; och 5) att förbereda och köra prover för jämförelse i samma parti för att minimera satseffekter.
Standarderna (tabell 1) som valts här för låg massa intervall kalibrering är utbytbara. Varje känd förening med ett m / z som faller i massfrekvensområde, är väluppfostrade i en H-ESI källa, och är löslig i vatten, metanol eller acetonitril är rimliga kandidater för kalibreringsstandarder. Det rekommenderas starkt att lagra all kalibreringslösningar at 4 ° C för att stabilisera koffein och även för att minimera avdunstning av metanol eller acetonitril i kalibreringslösningen så att kalibreringen prestanda kan vara mer reproducerbara. Jämfört med en vanlig massområde, m / z från 150 till 2.000, behöver kalibreras låg massområde som ska göras oftare, minst en gång varannan dag.
Detta arbetsflöde, från utvinning lösningsmedel, beredning lösningsmedel, LC mobil fas, till låga kalibreringsmassområde och MS skanna sortimentet har optimerats för att mäta polära metaboliter. Detta inkluderar aminosyror, acetyl aminosyror, glykolys pathway intermediärer, nukleosider, TCA-cykeln intermediärer, vissa en-kol-metabolism pathway mellanprodukter och så vidare. Men ändringar av detta protokoll för andra grupper av metaboliter, till exempel coenzym A (CoA) arter, folater, fosfolipider är möjliga. Exempelvis CoAs är mer stabila under sura betingelser, så tillsats av en syra till 80% metanol / vatten kommer att vara till hjälp att improve CoA känslighet. Dessutom CoAs och lipider tenderar att ha mycket stora molekylvikt, alltså m / z avsökning behöver justeras 60-900 till rätt sortiment som täcker dessa metaboliter.
Även om några av de oriktade sökresultat databaskomponenten överlappar med den riktade listan, är det fortfarande viktigt att bygga denna riktad lista baserad på prioriterade forskningen. Eftersom metaboliterna i riktad lista är lägre än den genomsnittliga intensitetströskel, kommer information om dessa metaboliter avlägsnas under bearbetningen. Den riktade Listan innehåller retentionstiden informationen, vilket ger oss större förtroende för metabolit identifiering och kvantifiering. En ytterligare fördel med QE-MS inställning är att tandemmasspektrometri kan möjliggöra ytterligare identifiering av metaboliter.
Ett problem i samband med detta arbetsflöde är att H-ESI nål otryggrt är känslig för innehållet i proverna salt, eftersom känsligheten kommer att bli mycket äventyras om det finns höga halter av icke-flyktiga salter. Därför kommer minimera saltinnehåll från prover och normal rengöring av kolonnen och H-ESI nål insats vara till hjälp för att säkerställa uppgifter av god kvalitet och att öka kolumnens livstid.
Sammanfattningsvis använder detta protokoll LC-QE-MS för att framgångsrikt analysera polära metaboliter från odlade celler, med minimal provberedningssteg och snabb datainsamling. Små ändringar i provberedningen kan utföras för att erhålla data från andra biologiska källor såsom serum och vävnader. Till exempel, eftersom ren metanol kan tillsättas till flytande serum sattes för att göra en slutlig metanolkoncentration 80% för polära metaboliter extraktion. För vävnadsprover, är noggrann omrörning och blandning krävs för att uppnå bättre extraktionseffektivitet. Vanligtvis 10 ml serum eller1 mg vävnad är tillräckligt för metaboliter analys. Rådata kan analyseras både i riktad läge, om det finns kända metaboliter i proven, och i en FN-målinriktat sätt följt av HRMS databassökning. HRMS baserade metabolomik är fortfarande i sin linda. För framtida framsteg, kan de experimentella tekniker optimeras ytterligare, kompletterande metabolit HRMS information och MS / MS-fragmenteringsmönster kommer att vara användbara och relevanta algoritmer, som topp inriktning, topp integration, isotop klustring och så vidare, kan förbättra effektiviteten och noggrannheten i databehandling. I slutändan, men många av de frågor som våra labb adresser i metabolismen begränsas av försiktig tolkning av data efter bearbetning. Med dessa storskaliga metabolomik tekniker, är vi ofta begränsade av vår tolkning av data och utvärdering av hypoteser som genereras. Därför behöver alla metabolomik experiment formuleras kring specifika frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) och Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) för värdefulla diskussioner om masskalibrering och databehandling. Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute i National Institutes of Health enligt Award Number R00CA168997. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
