Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

Summary

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. La utilización de la cromatografía en fase normal líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con el cambio de polaridad y un ciclo de trabajo rápido, se describe un protocolo para analizar la composición metabólica polar de material biológico con una alta sensibilidad, precisión y resolución.

Abstract

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. Sin embargo, las actuales plataformas tienen diferentes factores limitantes, como las preparaciones de mano de obra de la muestra, bajos límites de detección, la velocidad de barrido lento, optimización de método intensivo para cada metabolito, y la imposibilidad de medir tanto positiva e iones con carga negativa en los experimentos individuales. Por lo tanto, un nuevo protocolo de la metabolómica podría avanzar los estudios de metabolómica. Cromatografía hidrófilo a base de amida permite el análisis de metabolitos polares sin ninguna derivatización química. MS de alta resolución usando el Q-Exactive (QE-MS) ha mejorado la óptica de iones, aumento de velocidades de exploración (256 ms a una resolución de 70.000), y tiene la capacidad de llevar a cabo el cambio positivo / negativo. Utilizando una estrategia de extracción de metanol frío y acoplar una columna de amida con QE-MS permite la detección robusta de 168 metabolitos y miles polares dirigidos de características adicionales de forma simultánea. Datun procesamiento se lleva a cabo con el software disponible comercialmente en una forma altamente eficiente, y características desconocidas extraídas de los espectros de masas se puede consultar en las bases de datos.

Introduction

La metabolómica, definidas como un experimento que mide varios metabolitos simultáneamente, ha sido un área de intenso interés. La metabolómica proporciona una lectura directa de la fisiología molecular y ha proporcionado conocimientos sobre el desarrollo y la enfermedad como el cáncer de ^1-4. La resonancia magnética nuclear (RMN) y la cromatografía de espectrometría de masas de gases (GC-MS) se encuentran entre los instrumentos más utilizados ^5-9. RMN, especialmente se ha utilizado para los experimentos de flujo desde compuestos marcados de isótopos pesados, tales como ¹³ C etiquetados metabolitos, son RMN-activo ^10,11. Sin embargo, esta estrategia requiere relativamente alta pureza de la muestra y la gran cantidad de la muestra, lo que limita sus aplicaciones en la metabolómica. Mientras tanto, los datos obtenidos de RMN análisis de las necesidades de obra y asignación compuesta de los espectros de RMN complejo es difícil. GC-MS ha sido ampliamente utilizado para los metabolitos polares y los estudios de lípidos, pero requiere compoun volátilds y, por tanto, a menudo la derivación de metabolitos, que a veces implica la química compleja que puede llevar mucho tiempo e introduce ruido experimental.

La cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas de triple cuadrupolo utiliza el primer cuadrupolo para la selección de los iones primarios intactos, que son fragmentados a continuación, en el segundo cuadrupolo, mientras que el tercer cuadrupolo se utiliza para seleccionar fragmentos característicos o iones hija. Este método, que registra la transición de iones primarios a iones secundarios específicos, se denomina monitorización de reacción múltiple (MRM). MRM es un método muy sensible, específico y robusta tanto para moléculas pequeñas y cuantificación de proteínas ^12-15,21. Sin embargo, MRM tiene sus limitaciones. Para lograr una alta especificidad de un método MRM tiene que ser construido para cada metabolito. Este método consiste en la identificación de un fragmento específico y la correspondiente energía de colisión optimizado, que requiere conocimiento previo de la propertes de los metabolitos de interés, como la información de la estructura química. Por lo tanto, con algunas excepciones que implican la pérdida neutra de fragmentos comunes, no es posible identificar metabolitos desconocidos con este método.

En los últimos años, la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) instrumentos han sido puestos en libertad, tales como la serie LTQ-orbitrap y Exactive, el QuanTof y TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS pueden proporcionar una relación masa a carga (m / z) de los iones intactos dentro de un error de unas pocas ppm. Por lo tanto, un instrumento HRMS operado por la detección de todos los iones precursores (es decir, modo de barrido completo) puede obtener información estructural directa de la masa exacta y la composición elemental resultante del analito, y esta información puede ser utilizada para identificar los posibles metabolitos. De hecho, toda la información acerca de un compuesto se puede obtener con una masa exacta, hasta el nivel de los isómeros estructurales. Además, un completométodo de exploración no requiere conocimientos previos de los metabolitos y no requiere la optimización del método. Además, puesto que todos los iones con m / z caer en el rango de exploración pueden ser analizados, HRMS tiene una capacidad casi ilimitada en términos del número de metabolitos que pueden ser cuantificadas en un solo plazo en comparación con el método de MRM. HRMS también es comparable a un MRM de triple cuadrupolo de la capacidad cuantitativa debido al ciclo de trabajo corto que resulta en un número comparable de puntos de datos que se pueden obtener en un análisis completo de MS. Por lo tanto, HRMS proporciona un enfoque alternativo para la metabolómica cuantitativos. Recientemente, una versión mejorada de HRMS denomina espectrometría de masas Q-Exactive (QE-MS) se puede funcionar bajo la conmutación entre los modos positivos y negativos con tiempos de ciclo lo suficientemente rápido en un solo método, que amplía el rango de detección ^19. Aquí describimos nuestra estrategia metabolómica utilizando el QE-MS.

Protocol

1. Preparación de LC-MS Reactivos, Establecimiento de un método de cromatografía, y establecimiento de procedimientos de operación del instrumento Preparación de disolventes LC Preparar 500 ml fases móviles. A es acetato de amonio 20 mM y 15 mM de hidróxido de amonio en 3% de acetonitrilo / agua, pH final 9,0; y B es 100% de acetonitrilo. Sin apretar tapar la botella, colocarlo en un baño de ultrasonido agua, y someter a ultrasonidos durante 10 minutos sin calentamiento adicional. (…

Representative Results

La exactitud de la metabolómica datos depende en gran medida del rendimiento del instrumento LC-QE-MS. Para evaluar si el instrumento está operando en buenas condiciones, y si el método aplicado es adecuada, varios picos LC metabolito conocido se extraen de la cromatografía de iones totales (TIC), como se muestra en la Figura 1. Metabolitos polares, incluyendo aminoácidos, productos intermedios de la glucólisis , intermedios TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, NADP + y así sucesivamente…

Discussion

Los pasos más críticos para el metabolito de perfiles éxito en células utilizando este protocolo son: 1) controlar el medio de crecimiento y cuidadosa extracción de las células; 2) ajustar el método LC basado en configuración de métodos MS para asegurar que hay suficientes generalmente por lo menos 10) puntos de datos (a través de un pico para la cuantificación; 3) hacer una calibración de baja masa antes de ejecutar muestras; 4) la inyección de no más de 5 ml para evitar tiempo de retención desplazamient…

Materials

Positive calibration mix	Thermo Scientific	#88323	It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix	Thermo Scientific	#88324	Store at 4 °C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert	Fisher Scientific	#1303200	This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column	Waters	#186004860	Guard column is recommend to increase column lifetime.