Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Summary

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution.

Abstract

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Toutefois, les plates-formes actuelles ont des facteurs limitants, comme la main-d'œuvre intensive préparation des échantillons, les limites de détection basses, la vitesse de balayage lent, méthode intensive optimisation pour chaque métabolite, et l'incapacité de mesurer à la fois positivement et des ions chargés négativement dans des expériences simples. Par conséquent, un nouveau protocole de métabolomique pourrait faire progresser les études de métabolomique. Chromatographie hydrophile à base d'amide permet l'analyse des métabolites polaire sans dérivation chimique. SM à haute résolution à l'aide du Q-Exactive (QE-MS) a amélioré optique ionique, l'augmentation de la vitesse de balayage (256 ms avec une résolution de 70 000), et a la capacité d'effectuer la commutation positive / négative. En utilisant une stratégie d'extraction de méthanol froid, et le couplage d'une colonne d'amide avec QE-MS permet une détection robuste de 168 metabolites polaires ciblées et beaucoup d'autres fonctions simultanément. Datun traitement est effectué avec le logiciel disponible dans le commerce d'une manière très efficace, et des caractéristiques inconnues extraites à partir des spectres de masse peut être interrogé dans les bases de données.

Introduction

Métabolomique, définis comme une expérience qui mesure plusieurs métabolites simultanément, a été une zone d'intérêt intense. Métabolomique fournit une lecture directe de la physiologie moléculaire et a donné un aperçu dans le développement et la maladie comme le cancer ^1-4. Résonance magnétique nucléaire (RMN) et la chromatographie-spectrométrie de masse gazeuse (GC-MS) sont parmi les instruments les plus couramment utilisés ^5-9. RMN, en particulier a été utilisé pour des expériences de flux depuis composés marqués d'isotopes lourds, tels que ¹³ métabolites C marqués, sont actif en RMN ^10,11. Cependant, cette stratégie nécessite la pureté de l'échantillon relativement élevée et grande quantité de l'échantillon, ce qui limite ses applications en métabolomique. Pendant ce temps, les données recueillies à partir de l'analyse des besoins RMN intensive et l'attribution composé de spectres RMN complexe est difficile. GC-MS a été largement utilisé pour les métabolites polaires et des études de lipides, mais il faut compoun volatileds et donc souvent une dérivatisation de métabolites, ce qui implique parfois chimie complexe qui peut prendre beaucoup de temps et introduit du bruit expérimental.

Chromatographie en phase liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse quadripolaire triple utilise le premier quadrupôle pour la sélection des ions parents intacts, qui sont ensuite fragmentés dans le second quadripôle, tandis que le troisième quadripole est utilisé pour sélectionner des fragments caractéristiques ou des ions fils. Cette méthode, qui enregistre le passage de la ions parents à ions fils spécifiques, est appelé surveillance de réaction multiple (MRM). MRM est une méthode très sensible, spécifique et robuste à la fois petite molécule et la quantification des protéines ^12-15,21. Cependant, MRM a ses limites. Pour obtenir une grande spécificité d'une méthode MRM doit être construit pour chaque métabolite. Cette méthode consiste à identifier un fragment spécifique et l'énergie de collision optimisées, ce qui nécessite une connaissance préalable de la prope correspondantles parties prenantes des métabolites d'intérêt, tels que les informations de structure chimique. Par conséquent, à quelques exceptions impliquant la perte de neutre de fragments communs, il n'est pas possible d'identifier des metabolites inconnus avec cette méthode.

Dans les dernières années, à haute résolution (spectrométrie de masse) HRMS instruments ont été libérés, tels que la série LTQ-Orbitrap et Exactive, la QuanTof, et TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS peuvent fournir un rapport masse sur charge (m / z) des ions intacts à l'intérieur d'une erreur de quelques ppm. Par conséquent, un instrument de gestion des ressources humaines exploité par la détection de tous les ions précurseurs (c'est à dire en mode balayage complet) peut obtenir des informations structurales directe de la masse exacte et la composition élémentaire résultant de l'analyte, et cette information peut être utilisée pour identifier des métabolites potentiels. En effet, toutes les informations sur un composé peut être obtenu avec une masse exacte, au niveau des isomères structuraux. En outre, un pleinméthode d'analyse ne nécessite pas de connaissance préalable de métabolites et ne nécessite pas l'optimisation des méthodes. En outre, étant donné que tous les ions avec m / z tomber dans la plage de balayage peuvent être analysés, HRMS a une capacité presque illimitée en termes de nombre de métabolites qui peuvent être quantifiés en un seul passage par rapport à la méthode de MRM. HRMS est également comparable à un MRM quadripolaire triple de la capacité quantitative due au cycle de service de courte entraîne un certain nombre comparable de points de données qui peuvent être obtenus dans une analyse complète du MS. Par conséquent, HRMS fournit une approche alternative pour la métabolomique quantitative. Récemment, une version améliorée de gestion des ressources humaines appelé Q-Exactive spectrométrie de masse (QE-MS) peut être utilisé sous la commutation entre les modes positifs et négatifs avec des temps de cycle suffisamment rapide en une seule méthode, qui élargit la gamme de détection ^19. Ici, nous décrivons notre stratégie de métabolomique utilisant le QE-MS.

Protocol

1. Préparation de LC-MS réactifs, mise en place d'une méthode de chromatographie, et mise en place de procédures opérationnelles instruments Préparation de solvants LC Préparer 500 ml phases mobiles. A est l'acétate d'ammonium 20 mM et 15 mM d'hydroxyde d'ammonium à 3% d'acétonitrile / eau, pH final de 9,0; et B est à 100% d'acétonitrile. Plafonner de manière lâche la bouteille, placez-le dans un bain sonique de l'eau, et soniquer pendant 10 min…

Representative Results

L'exactitude des données de métabolomique dépend fortement de la performance de l'instrument LC-QE-MS. Afin de déterminer si l'instrument fonctionne dans de bonnes conditions, et si la méthode appliquée est correcte, plusieurs pics LC de métabolites connus sont extraites à partir de la chromatographie ionique total (CIT), comme représenté sur la figure 1. Metabolites polaires, y compris des acides aminés, des produits intermédiaires de la glycolyse , intermédiaires de TCA, les n…

Discussion

Les étapes les plus importantes pour la réussite de profilage des métabolites dans les cellules à l'aide de ce protocole sont: 1) le contrôle du milieu de croissance et l'extraction minutieuse des cellules; 2) l'ajustement de la méthode de LC basée sur MS méthode configuration pour s'assurer qu'il ya suffisamment (habituellement au moins 10) points de données à travers un pic pour la quantification; 3) faire un étalonnage de faible masse avant d'exécuter les échantillons; 4) l'in…

Materials

Positive calibration mix	Thermo Scientific	#88323	It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix	Thermo Scientific	#88324	Store at 4 °C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert	Fisher Scientific	#1303200	This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column	Waters	#186004860	Guard column is recommend to increase column lifetime.