En strategi för känsliga, storskaliga kvantitativa Metabolomics
Summary
Metabolit profilering har varit en värdefull tillgång i studien av ämnesomsättningen i hälsa och sjukdom. Använda normal faser vätskekromatografi kopplad till högupplösande masspektrometri med polaritet växling och en snabb arbetscykel, beskriver vi ett protokoll för att analysera den polära metaboliska sammansättning av biologiskt material med hög känslighet, noggrannhet och upplösning.
Abstract
Metabolit profilering har varit en värdefull tillgång i studien av ämnesomsättningen i hälsa och sjukdom. Men nuvarande plattformar har olika begränsande faktorer, såsom arbetsintensiva provpreparat, låga detektionsgränser, långsamma skanningshastigheter, intensiv metod optimering för varje metabolit, och oförmågan att mäta både positivt och negativt laddade joner i enstaka experiment. Därför skulle en ny metabolomicsen protokoll avancera metabolomik studier. Amid-baserade hydrofila kromatografi möjliggör polära metabolit analys utan någon kemisk derivatisering. Högupplöst MS med hjälp av Q-Exactive (QE-MS) har förbättrat jon optik, ökad skanningshastigheter (256 ms vid upplösning 70.000), och har förmågan att utföra positiv / negativ omkoppling. Med hjälp av en kall metanolutvinning strategi, och koppling en amid kolonn med QE-MS möjliggör robust detektering av 168 riktade polära metaboliter och tusentals ytterligare funktioner samtidigt. Daten behandling genomförs med kommersiellt tillgänglig programvara på ett mycket effektivt sätt, och okända egenskaper extraherade från masspektra man kan söka i databaser.
Introduction
Metabolomik, definierat som ett experiment som mäter flera metaboliter samtidigt, har varit ett område av stort intresse. Metabolomics ger en direkt avläsning av molekylär fysiologi och har gett insikter i utveckling och sjukdom som cancer 1-4. Kärnmagnetisk resonans (NMR) och gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) är bland de mest använda instrumenten 5-9. NMR, särskilt använts för flödes experiment eftersom tung isotop märkta föreningar, såsom 13 C-märkta metaboliter, är NMR-aktiva 10,11. Detta kräver dock strategi relativt hög prov renhet och stor provmängd, vilket begränsar dess tillämpningar inom metabolomik. Under tiden data från NMR behöver intensiv analys och förening tilldelning av komplexa NMR-spektra är svårt. GC-MS har i stor utsträckning använts för polära metaboliter och lipid studier, men det kräver flyktigt compounDS och därför ofta derivatisering av metaboliter, vilket ibland innebär komplexa kemi som kan vara tidskrävande och introducerar experimentell buller.
Vätskekromatografi (LC) kopplat till trippelkvadrupolmasspektrometer masspektrometri använder den första quadrupol för att välja intakta moderjoner, som sedan splittrade i andra kvadrupol, medan den tredje quadrupol används för att välja karaktäristiska fragment eller dotterjoner. Denna metod, som registrerar övergången från moderjoner till specifika dotterjoner, betecknas flertal reaktionsövervakning (MRM). MRM är en mycket känslig, specifik och robust metod för både småmolekylära och protein kvantifiering 12-15,21. Men MRM har sina begränsningar. För att uppnå hög specificitet ett MRM metod måste byggas för varje metabolit. Denna metod består av att identifiera ett specifikt fragment och motsvarande optimerad kollisionsenergi, som kräver förkunskaper om properties av metaboliter av intresse, såsom kemisk struktur informationen. Därför, är med några undantag som innebär neutrala förlusten av gemensamma fragment det inte möjligt att identifiera okända metaboliter med denna metod.
Under de senaste åren har högupplösande masspektrometri (HRMS) instrument släppts, såsom LTQ-Orbitrap och Exactive serien, QuanTof och TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kan ge en massa till laddningsförhållande (m / z) av intakta joner inom ett fel av några få ppm. Därför kan en HRMS instrument som drivs av att upptäcka alla föregångare joner (dvs fullständig genomsökning läge) få direkt strukturell information från den exakta massan och den resulterande grundämnessammansättningen av analyten, och denna information kan användas för att identifiera potentiella metaboliter. I själva verket kan all information om en förening kan erhållas med en exakt massa, upp till nivån av strukturella isomerer. Också, en fullständigsökmetod inte kräver förkunskaper av metaboliter och inte kräver metod optimering. Eftersom alla joner med m / z falla in i frekvensområde kan analyseras, har HRMS en nästan obegränsad kapacitet i termer av antal metaboliter, som kan kvantifieras i en enda körning jämfört med MRM metoden. HRMS är också jämförbart med en trippelkvadrupol MRM i kvantitativa kapacitet på grund av den korta driftcykel resulterar i ett jämförbart antal datapunkter som kan erhållas i en komplett MS skanna. Därför ger HRMS en alternativ metod för kvantitativa metabolomik. Nyligen, en förbättrad version av HRMS kallas Q-Exactive masspektrometri (QE-MS) kan drivas under omkopplingen mellan positiva och negativa lägen med tillräckligt snabba cykeltider i en enda metod, som expanderar detektionsområdet 19. Här beskriver vi vår metabolomik strategi med hjälp av QE-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrik metabolit profilering i celler med användning av detta protokoll är: 1) reglering av tillväxtmedium och försiktig extraktion av cellerna; 2) justering av LC-metoden bygger på MS-metod setup för att se till att det finns tillräckligt med (vanligen minst 10) datapunkter över en topp för kvantifiering; 3) gör en låg masskalibrering innan du kör prover; 4) insprutning inte mer än 5 ml för att undvika retentionstid skiftande och toppbreddning som orsakas av vatten; och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) och Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) för värdefulla diskussioner om masskalibrering och databehandling. Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute i National Institutes of Health enligt Award Number R00CA168997. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner–semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
