의 조직 화학 염색<em> 애기 장대</em> 차 전지 벽 요소
Summary
Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.
Abstract
Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.
Introduction
식물 세포의 벽은 다양한 구성 요소 내에서 정보의 과다 보유 : 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 (크 실란, glucuronoxylan, 크 실로 글루칸, 아라비, 혼합 결합 글루칸, 또는 글루코), 펙틴을. 조직 학적 기술 조직 및 세포 수준에서 보조 세포 벽 내의 차이를 연구하는 중요한 시각적 단서를 제공한다. 다양한 조직 학적 방법이 개발되었고, 문헌에서 발견 될 수 있지만, 단순한 시각적 지시 매우 상세한 프로토콜이 드물게 이제까지 가능한 경우 없기 때문에 이러한 기술은 어렵고 시간 소모적 초보자 수있다. 본 연구의 목적은 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 조직 학적 염색 기법에 대한 간단한 지침을 제공하는 것이다.
줄기 조직을 구획하는 셀 벽 및 셀의 셰이프 시각화하는 첫 번째 단계이다. 손으로 자른 부분이 저렴하고 준비하는 시간을 줄이고 있지만, vibratome의 사용은 일관성을 제공하며,고품질 이미지를 산출한다. vibratome를 사용하여 선명한 이미지를 생성하는 데 도움이 상당히 간단 나쁜 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 부정확 차이 제조 위험을 줄여 동일한 두께, 심지어 섹션을 생성함으로써 더 나은 데이터 품질을 생산한다. 신선한 표본을 해결하기 위해 수지를 사용하여 초보자를위한 도전이 될 수 있으며, 분석을 신속하게 수행 할 필요가있는 경우에도 여전히 전문가를위한 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 또,이 수지에 포함되었을 때 샘플로 생물학적 활성을 측정하는 것이 불가능해진다. 아가 로스 및 제 금형을 채용 한 간단한 기술은 줄기 조직을 매립 명이이며 또한 부드러운 조직의 절개가 필요한 다른 애플리케이션에 이용 될 수있다. 수지 시험편을 매립에 비해,이 방법은 살아있는 조직을 유지하는 샘플 조작을 감소시키는 이점을 갖는다. vibratome를 통해 조직을 단면은 고정밀 및 homogen를 생성연구의 목적에 따라, 다음 여러 다른 염색 기술과 함께 사용될 수 있으며, OU를 섹션.
리그닌과 다른 방향족 화합물을 시각화하는 가장 간단한 방법은 자외선 (UV) 빛을 사용합니다. UV 빛에 의해 방향족 기반 분자의 여기 오래된 기술이지만, 그것은 여전히 리그닌의 시각화를위한 가장 빠른 방법 중 하나입니다. UV 빛은 다른 방향족 화합물을 자극하기 때문에 그러나, UV 시각화 실제로 리그닌 탐지에 적합하지 않습니다. 1-3 : 리그닌은 주로 세 가지 빌딩 블록, monolignols (coniferyl 알코올, sinapyl 알코올, 및 p-coumaryl 알코올 hydroxycinnamyl 알코올)로 구성되어 있습니다. 플로로 글 루시놀 얼룩 통, 섬유 및 기관의 조직 4에 존재 cinnamaldehydes의 범위에 단서를 제공 할 수 있습니다. 플로로 글 루시놀 일반 cinnamaldehydes의 좋은 지표이며 cinnamaldehydes 및 기타 방향족 화합물을 구별 할 수 있습니다. sinapyl 알코올 단량체를 검출 할 수있다및 마 울레 얼룩의 사용으로 차별화. 톨루이딘 블루 O는 다색 염료이며, 따라서 다른 색 5,6에 칸막이 벽의 다른 요소를 더럽힐 수있는 능력을 갖는다. 톨루이딘 블루 O의 주된 용도는 펙틴 및 리그닌 5,6를 검출하는 것이다. 톨루이딘 블루 O를 사용하는 장점은 세포벽의 많은 요소가 단일 단계로 시각화 할 수 있다는 것이다. 흰색 calcofluor 및 콩고 레드 모두 함께 작동하기 쉽고 셀룰로오스를 시각화 할 수있다. Calcofluor 흰색 얼룩 셀룰로오스, callose 및 기타 비 치환 또는 약하게 치환 된 β-글루칸 6-9, 콩고 붉은 얼룩은 직접 특히 10,11-β (1 → 4) – 글루칸과 셀룰로오스 할 수있는 반면. 본 연구의 목표는 A.에서 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 상기 염색 기법의 사용을 위해 단순한 지침을 제공하는 것이다 장대 줄기.
Protocol
Representative Results
Discussion
A. thaliana의 줄기 부분 널리 이차 세포벽의 세포 조직을 연구하고 질적 야생형 및 트랜스 제닉 식물의 차이를 조사하기 위해 사용된다. 표본을 절편 일반적으로 사용되는 기술은 직접 손으로 절단하다; 표본이 아가로 오스 또는 정착에 포함 된 경우 나, 절편은 vibratome 또는 마이크로톰을 수행 할 수 있습니다. 한편 절단 달리, 마지막 두 단순히 샘플 및 요철 표면 사이의 두께 차이로 인한 잘?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 편집에 도움 세이빈 러셀에 감사드립니다. 이 작품은 (http://www.jbei.org) 미국 에너지 부, 과학, 생물 환경 연구의 사무실, 사무실에서 지원하는 DOE BioEnergy 공동 연구소의 일부였다 로렌스 버클리 사이의 계약 DE-AC02-05CH11231 통해 국립 연구소와 미국 에너지 부.
Materials
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric Acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No.1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm. |
| Frosted Micro Slides, 1mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm- 1mm |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 |
References
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