Introduction
植物细胞壁持有大量的信息及其各种部件之内：木质素，纤维素，半纤维素（木聚糖，葡糖醛酸，木葡聚糖，阿拉伯木聚糖，混合联动葡聚糖，或葡甘露聚糖），以及果胶。组织学技术提供学习辅助小区围墙内的差异在组织和细胞水平的重要的视觉线索。不同组织学技术被开发，可在文献中找到，但这些技术可以是具有挑战性和费时的初学者，因为用简单的视觉指示非常详细的协议很少，如果以往任何时候都可用。本研究的目的是为组织学染色技术简单的指引，以获得高质量的图像。
切片的茎组织中的细胞壁和细胞形状可视化的第一步。虽然手工切割的部分是价格便宜，需要较少的准备时间，使用vibratome的提供一致性和得到高品质的图像。使用vibratome允许产生更好的数据质量通过生成具有相同的厚度，这有助于产生清晰的图像和显著降低了生产样品之间不准确的差异，将通过一个坏的样品制备可简单地造成的危险，即使部分。使用树脂来修复新鲜标本可以对初学者是一个挑战，可能仍然是费时即使是专家的分析需要快速完成时。此外，它变得不可能测量任何生物活性与样品时，它已被埋入树脂。一个简单的技术，它采用琼脂糖和一个自制的模具是用于嵌入茎组织中有用，并且它也可以在需要的软组织解剖其它应用程序使用。相比，在树脂包埋的标本，该方法具有保持组织存活和减少样品操作的优点。通过vibratome切片组织是高度精确的，并生成均质项部分，其中，根据不同的研究的目标，然后可以用几种不同的染色技术中使用。
可视化的木质素和其它芳族化合物的最简单的方法，采用紫外线（UV）光。基于芳族化合物的分子被紫外光激发是一个古老的技术，但它仍然是最快的方法对木质素的可视化1。然而，紫外线的可视化其实是不理想的木质素检测，因为紫外线会激发其他芳烃。木质素主要由三个组成部分中，monolignols（hydroxycinnamyl醇：松柏醇，芥子醇，和对 -香豆醇）达1-3。间苯三酚染色可以提供线索，存在于木质部，纤维和气管组织4肉桂醛的程度。间苯三酚是一般的肉桂醛的一个良好指标，肉桂醛和芳香等可以区分。可以被检测到的芥子醇单体并通过区分使用马乌莱污点。甲苯胺蓝O是一个多色染料，因此具有染色细胞壁的不同元素以不同的颜色5,6的能力。主要使用的甲苯胺蓝O是检测果胶和木质素5,6。使用甲苯胺蓝澳的优点在于，细胞壁的许多元件可以在一个步骤中被可视化。这两种钙荧光白，刚果红是易于使用，可用于可视化纤维素。钙荧光白渍纤维素，胼胝质，和其他非取代的或弱取代的β-葡聚糖6-9，而刚果红染色直接向β-（1→4） -葡聚糖，特别是在纤维素10,11。这项研究的目标是提供简单的指引，使用上述染色技术，以从A获得高品质的图像拟南芥的茎。
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Protocol
1，干嵌入
- 使在水中的7％的琼脂糖溶液（7克电泳级琼脂糖在100毫升蒸馏水中）。通过高压灭菌20分钟，或以最低的强度（ 例如 ，10％1250瓦特微波的强度）微波20分钟溶解琼脂糖。
- 准备一个自制的模具嵌入茎用塑料瓶。
- 使用刀片，切断2毫升的螺旋盖离心管（A部分）的锥形底部。用注射器针头，穿刺在管帽上的孔比茎要被嵌入的直径稍大。接着，切0.5厘米了0.6 ml离心管（B部分）的底部。
- 加0.6 ml离心管的截止0.5厘米部分送入预先切割2毫升微量离心管中。密封用封口膜（ 图1）的两个部分。注：该管的底部被切割，以便除去嵌入的样品后琼脂糖凝固。 Ŧ他孔盖将有助于保持稳定的干时干是嵌入在琼脂糖。该模具将有助于保持琼脂糖和嵌入时抱茎笔直。该封口膜将举行两部分，A和B，直到琼脂糖设置和茎被嵌入。
- 用剃刀刀片，从感兴趣的区域（第一杆节间的例如中部）切茎段。注意：理想情况下，阀杆应只是嵌入，以避免破坏脱水前切断。可替换地，杆可以被暂时存储在含有水润湿滤纸的板。该板可以被放置在冰上直至准备将要被嵌入以防止组织脱水和变形。储存干时间超过30分钟没有长高湿度会导致干到干。
- 熔化琼脂糖在微波中在低强度。注意：含琼脂糖的瓶子可能会很热。使用手套拿起瓶子。让熔化的琼脂糖st和在室温下（在20°C和25°C），直到它冷却到约50℃。
- 慢慢吸取5毫升琼脂糖入预制的塑料模具，填补了小瓶。注意：请确保没有气泡的模具。气泡会导致间隙中的琼脂糖模具，并不会完全覆盖干样品，这将最终导致试样的部分的切削不均匀。
- 让琼脂糖冷却30至60秒，成为半固体。用小牙签测试，确保它可以穿透并站起来，但不漂浮，在琼脂糖。注意：如果发现阀杆已放置在琼脂糖仍是热的会损坏样品通过干瘪的干，破坏细胞形态。
- 将阀杆在此琼脂糖填充的小瓶。确保阀杆撑直。将多孔罩，所述阀杆的前端由盖保持这种方式。不要把螺丝帽。有时多于一个茎（单一种类的）可以是EMBEdded在一个小瓶;但在特定情况下，请不要使用上限。注意：如果螺丝帽被打开，阀杆会得到扭曲。
- 离开小瓶在室温或4℃下进行10-30分钟，直到它固化。
- 通过轻轻地向外滑动管子取出模具。打开封口膜。用拇指按压模具的B部分的底部轻轻地从A部分释放凝固的琼脂糖到玻璃显微镜幻灯片。
- 切琼脂糖嵌入阀杆分成三个大致相等的片为1.2厘米的长度。切出，这不是在琼脂糖和丢弃它的杆的一部分。
- 存储这些片断的琼脂糖与嵌入式茎在密闭的暗箱，4℃，直到准备第2 ml离心管中。另外，存储管在4℃下最多一个星期。注：存储是可能的，但实验者需要是嵌入式茎还活着，并根据实验需要注意，文物可能被引入。
2，干切片
- 注意：请阅读vibratome手工精心并遵守所有安全指示。
- 确保样品光盘是干净和完全干燥（无任何固体或液体）。清洁样品盘用刀片从实验前除去任何残余的胶和用水洗涤。再用干纸巾。注意：这将确保粘接效果很好，并结合到琼脂糖标本。如果这个步骤没有正确完成，它是可能的试样不附着到光盘上，并会导致以后的试样切片过程中脱落的圆盘。
- 用软纸擦拭，以从包含标本琼脂糖块中删除任何水分。
- 放置一小滴组织粘合剂在试样圆盘。条纹列的粘接使用粘接瓶的前端覆盖在板的中间区域。很快到位琼脂糖块，以使标本要么垂直于或与板横向或纵向截面，分别平行。允许粘合剂试样固定在试样圆盘在室温或4℃下进行10-30分钟。注意：这是一个对时间敏感的一步。
- 修复到位样品盘上的缓冲盘或波谷。琼脂糖的与部分的块/ s应该是在与刀片平行。填充缓冲区托盘中，在室温蒸馏水，直到样品被完全淹没。
- 切成两半的剃刀刀片，然后修剪的端部用坚固的剪刀，使刀片保持完全平坦的。附加一个半预切割刀片的上刀座。
- 上刀架设置角度为84°时，速度0.90毫米/秒（在vibratome位置8）和频率为50Hz（在vibratome位置5）。切成100微米厚的部分。使用连续模式。 NOTE：该厚度被选择，以确保该组织能够承受在一些染色方法中使用的各种酸和碱处理。对于切片设置窗口，并允许在连续模式下15-20分钟的vibratome节大约1.2厘米琼脂糖块。
- 切片在缓冲液盘过程中使用一次性塑料吸管收集部分。备选地，部分可以从缓冲托盘被转移到一个玻璃烧杯中，然后向一个明确的Petri板上。转几节到2.0 ml离心管中。注意：该标本收集从一个培养皿，因为它是更容易看清一个明确的背景的区域里，因为缓冲区托盘可引为下一个样品。
- 的部分可被存储在一个50毫升管或收集和储存在1.5至2ml微量离心管中，在4℃下进行30至60分钟。注意：存放部分的时间较长，将导致图像质量变差。
3，显微镜和照相机设置成像
- 调整显微镜上的科勒照明。选择一个目标。专注于试样第一。带来的光强度的一半或更低。关闭视场光阑（FD）和孔径（AP）或把它带到在那个特定的目标尽可能低的设置。
- 在放大倍率较高，规模较大的环会。使用聚光调焦旋钮专注领域光圈一针见血越好。
- 慢慢用冷凝器定心旋钮（围绕冷凝器针形螺钉）将视场光圈（六角形小环）的图像的中心。慢慢增加膜片（FD），使得该字段虹膜到达边缘。停止增加FD只是后场虹膜已通过边缘。
- 慢慢地加大光圈（AP）来调整对比度。根据需要调节光的强度。注：科勒照明需要调整为每Õbjective，每一个实验的一天。注意调整为天之后所获得的数字。这些数字将目标得以来回切换的那一天，每次重复使用。
- 调整光圈，强度，曝光时间，增益和如表1中所述的过滤器，该信息应仅作为一个指南。
- 使用高解析度数码相机采用了大尺寸隔行扫描CCD芯片，具有无机械快门来捕捉荧光图像;和一个高解析度，高速摄像机为亮场图像。
- 过程中使用标准软件的幻灯片。装载软件。点击“获取”和“设置摄像头/板”，然后选择要使用的相机。单击“确定”。点击“获取”，其次是“颜色标签”。在“颜色标签”，选择“拜耳法”，其次是“平均四”。添加建议的增益（红，绿，蓝）来回米表1。选择“保存设置”选项卡，并单击其中的图像将被存储的目录。从表1中的建议设置“曝光时间”设置“分级”在“1”和“实时分级”为“1”。专注于感兴趣的区域，然后点击“保存活的。”
- 在相机软件输出的图像是在“TIF”格式。分析的细胞类型的组织化学中的图像。使用标准的计算机软件演讲和出版物的下游用途。
4，紫外线和明场成像
- 用1毫升移液管的移液管尖切，使得部分可以很容易地吸出。轻轻移液管部分到尖端和上至显微镜载玻片。盖上盖玻片的部分。观察在紫外光下或明场照明部分。
5，间苯三酚 -盐酸（威斯纳）染色12
- 溶解0.3克间苯三酚在10毫升无水乙醇中，制成3％的间苯三酚溶液。混合浓盐酸（37 N）的一个容积为两卷乙醇3％间苯三酚的;这个解决方案是间苯三酚 - 盐酸（PH-HCl中）或威斯纳污点。注意：该解决方案是要作出关于染色的天新鲜和不能存储，因为该解决方案会随着时间的推移和染色将变得无效。注意：盐酸具有很强的腐蚀性，所以使用非常谨慎，而处理PH-盐酸污点。
- 转移茎段至2.0ml微量离心管中。加入1 ml的PH-HCl溶液中含有的部分的管子，立即盖住它，因为HCl的pH值 - 盐酸污点是高度腐蚀性的。轻轻移动管，以确保所有的部分都染。对此的一种替换步骤是保持管帽打开，使得PH-HCl溶液中，可以用移液管上下，优选不干扰秒系统蒸发散。注意：要小心，不要将部分吸取到枪头，因为这可能会损坏这些部分。
- 用1毫升移液管的移液管尖切以这样一种方式，该部分可以很容易地吸出无损坏。轻轻吸取部分插入尖端和在显微镜载玻片上。盖上盖玻片的部分。根据观察明场照明部分。注：将pH-HCl溶液干涸在5-10分钟，使试样的劣化。因此，成像，必须在这段时间内完成。
6，马乌莱染色13,14
- 溶解的0.2g高锰酸钾在40毫升蒸馏水中，制成0.5％的高锰酸钾溶液。储存在黑暗的瓶子在室温下最多7天。
- 加入1 ml浓HCl（37 N）至9毫升蒸馏水水（1:10）准备一个3.7％的HCl溶液。准备在一个新鲜的3.7％HCl溶液天实验。确保所使用的37 N的HCl原液是不是太旧了。浓氢氧化铵溶液（14.8 M）应保存在4℃，以防止饱和溶液的摩尔浓度的降低。
- 转移茎段至2.0ml微量离心管中。加入1毫升0.5％的高锰酸钾溶液至含有部分管子。
- 移液器的0.5％高锰酸钾溶液，上下轻轻的，最好不干扰部分。孵育2分钟，并重复移液。让微量离心管支架，直到所有的部分安顿下来。注意：要小心，不要将部分吸取到枪头的部分可能被损坏。这可能是很难看到的茎段作为解决方案是黑暗的，所以保持管与试管架的部分，并允许他们定居2分钟。
- 用1毫升移液管，抽出700微升0.5％的高锰酸钾溶液。加入700μl蒸馏水冲洗出来的高锰酸钾溶液。重复3至4倍，或直至水溶液保持清晰。
- 倒掉水。快速加入1 ml 3％的HCl，直到深褐色的颜色是从部分放电。这可能在3-5分钟发生或可能需要洗涤2次的每次5分钟。吸取了所有的3％HCl溶液，并立即进行下一个步骤。
- 加入1毫升浓氢氧化铵溶液。用1毫升移液管的尖端切割以这样一种方式，该部分可以很容易地吸出无损坏。轻轻吸取部分插入尖端和在显微镜载玻片上。盖上盖玻片的部分。根据观察明场照明部分。注意：由于氢氧化铵是腐蚀性极强，它需要额外的关怀和照顾，以避免造成腐蚀显微镜或镜头的阶段。注：氢氧化铵烟雾会起雾盖玻片，因此很难观察到样品。因此要格外小心加入盖玻片之前。该溶液干涸在5-10分钟，使摄像，必须在这段时间内完成。
7，刚果红染色11,15
- 溶解0.5克刚果红在100毫升蒸馏水中，制成0.5％的刚果红溶液。
- 转移茎段至2.0ml微量离心管中。加入1毫升0.5％的刚果红溶液的管构成。轻轻吸取的0.5％刚果红溶液向上和向下，而不会干扰部分。注意：小心不要吸取了部分成枪头，因为这可能会损坏的部分。
- 在室温下孵育10分钟，并重复移液。跟随孵育在室温下另外3分钟。
- 用1毫升吸管绘制出700微升0.5％刚果红溶液。加入700微升的蒸馏水冲洗出来的刚果红溶液。重复洗涤3至4倍，直到洗涤液是明确的。
- 用1毫升移液管，其前端切以这样一种方式，该部分可以很容易地吸出无损坏。轻轻吸取部分插入尖端和在显微镜载玻片上，用盖玻片覆盖。使用过滤器与560/40带通观察样品下蓝色光激发显微镜幻灯片。注意：不要将水的部分为长之前，微观分析，因为水会洗出的刚果红在10-30分钟。
8，钙荧光白染色9
- 在蒸馏水中制备出0.2％原液10毫升溶解0.02克荧光增白剂28（钙荧光白M2R）。的0.2％的溶液可在4℃下存放在一个黑暗的瓶子6个月通过稀释0.2％的储备溶液的10倍，用蒸馏水制备的0.02％的工作溶液。
- 转移茎段至2.0ml微量离心管中。添加到管1毫升0.02％的calcofluor白色的解决方案。轻轻吸取了0.02％钙荧光白液上下。注意：小心不要吸取了部分成枪头，因为这可能会损坏的部分。
- 在室温下孵育5分钟，并重复移液。孵育部另外3分钟，在室温下进行。注：允许部分沉降到管的底部，以使其更容易吸取出来的溶液，而不会损坏部分。
- 用1毫升吸管绘制出700微升0.02％钙荧光白液，并加入700微升的蒸馏水;等待5分钟，冲洗出来的钙荧光白的解决方案。重复洗涤3至4倍。用1毫升吸管用枪头切如方式，部分可以很容易地吸出无损坏。
- 轻轻吸取部分插入尖端和在显微镜载玻片上并用盖玻片覆盖。观察在紫外灯下的部分。
9，甲苯胺蓝E O染色16,17
- 溶解0.02克甲苯胺蓝O输入100毫升蒸馏水中，制备0.02％溶液。注：甲苯胺蓝O解决方案可以存储两周在黑暗的瓶子在室温下。
- 转移茎段至2.0ml微量离心管中。加入1毫升0.02％的甲苯胺蓝O解决方案到管。轻轻吸取了0.02％甲苯胺蓝O解决方案上下。然后在室温下孵育5分钟，并重复移液一次。注意：小心不要吸取了部分成枪头，因为这可能会损坏的部分。让微量离心管站在原地，直到部分安顿下来。这可能是很难看到，因为该解决方案是黑暗的，所以保持管中的试管架的部分，并允许他们定居2分钟在室温下。
- 用1毫升吸管绘制出700微升0.02％甲苯胺蓝O解决方案。加入700μl蒸馏水冲洗出来的甲苯胺蓝Ø溶胶ution。重复3至4倍，或直至洗涤液是明确的。用1毫升移液管的移液管尖切以这样一种方式，该部分可以很容易地吸出而不损坏它们。
- 轻轻吸取部分插入尖端和在显微镜载玻片上并用盖玻片覆盖。根据观察明场照明部分。
- 调整显微镜上的科勒照明。选择一个目标。专注于试样第一。带来的光强度的一半或更低。关闭视场光阑（FD）和孔径（AP）或把它带到在那个特定的目标尽可能低的设置。
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Representative Results
干嵌入和切片：
使用自制的塑料模具中嵌入的杆在7％琼脂糖证明是快速和容易的（ 图1）。这两个部分（A和B; 图1）嵌入式小瓶系统变得简单轻松地释放嵌入琼脂糖的琼脂糖不会粘到小瓶部分是惰性干，保持系统清洁。小瓶可以多年重复使用多次。存储嵌入式干的便利也使得接下来的步骤更简单。为了节省某个时候，类似的嵌入式茎可以分组（最多3个）在一个切片板切片。
观察芳烃在紫外线的：
的茎段被安装在蒸馏水在玻璃载玻片和在UV光下观察到的。芳族化合物，包括在细胞中的木质素，可通过其自身荧光在UV光下可视化。木质部（XY）和interfascicular纤维（网络连接）在髓（PI）和皮层或表皮（EP）（ 图2）在紫外光照射下，但不表现出自身荧光，因为木质素的芳香族聚合物，在次级细胞壁生物合成的沉积。在某些情况下，当植物积累显著量芳烃在其液泡（ 例如 ，花青素），荧光可以在皮质细胞（数据未示出）观察。茎的横截面进行了5X，10X，20X下进行分析，40X放大倍数（ 图2组件A，B，C和D - E，分别），以更好地可视化细胞壁芳香分布在整个干。
木质素的彩绘与间苯三酚和马乌莱污渍的茎段观察：
血管和纤维和interfascicular纤维组成木质部是茎的木质素污渍（间苯三酚和马乌莱进行染色，唯一的元素）用野生型茎段的样本。间苯三酚染色反应与肉桂醛端基木质素得到粉红色或紫红色的颜色4（ 图3）。作为在UV照射下观察到的，一紫红色着色在木质部和interfascicular纤维观察到，但不存在于髓和皮层或表皮（ 图3）。茎的横截面进行了5X，10X，20X下进行分析，40X放大倍率（ 图3组件A，B，C和D - E，分别），以更好地可视化间苯三酚染色分布在整个茎和分化的主要组织;木质部和interfascicular纤维;髓和皮层;和表皮。一般的颜色的强度与木质化以定性方式的水平-除了当被分析的突变体或转基因异常富集肉桂醛衍生的单元（ 例如 CAD突变体）<燮> 14。马乌莱色斑是在特定的检测紫丁香木质素单位木质部和interfascicular纤维。红色着色表示的紫丁香木质素单元中的木质素的元素的存在（ 图4）18。然而，当与木质部组织这表明，该纤维含有S木质素的更高的水平，而该木质部在G中的单位更丰富更明亮的红色着色观察到在纤维中。如间苯三酚染色后观察到的，一个红的着色是在木质部和interfascicular纤维观察到，但不存在于髓和皮层或表皮（ 图4）。它也关联与木质素分布紫外线下观察（ 图2），并表明紫丁香单元存在于该干样品的每木质化组织。茎的横截面进行了5X，10X，20X下进行分析，40X放大倍数（ 图2图A，B，C，和D - E，分别），以更好地观察整个干马乌莱色斑分布和差异化的主要组织：木质部和interfascicular纤维，髓和皮层和表皮。值得注意的是，量和木质化组织之间的紫丁香单元分配与杆的年龄变化，并且可以不存在于幼茎（数据未示出）是重要的。
观察彩绘与钙荧光白和刚果红渍茎段：
钙荧光白渍纤维素，胼胝质，以及其他未取代或弱取代的β-葡聚糖;而刚果红染色直接向β-（1→4） - 葡聚糖，特别涉及纤维素。沾上钙荧光白干切片在紫外光下观察到6-9。刚果红染色切片使用下一个过滤器与560/40带通蓝光激发观察。这两种钙荧光白，刚果红染色的表皮，皮层和髓部;日是是因为所有这些组织中含有纤维素作为主要的多糖聚合物在它们的细胞壁（ 图5和图6，分别）。与此相反，以更好地钙荧光白，刚果红染色的多糖在木质部和interfascicular纤维和似乎较少受木质素的存在（ 图5和图6）10,11。茎的横截面进行了5X，10X，20X下进行分析，40X放大倍数（图A，B，C和DE，分别如图5和图6），以更好钙荧光白和刚果红染色的分布在整个茎和主要可视化组织（木质部和interfascicular纤维，髓和皮层和表皮）。
观察甲苯胺蓝染色Ø茎段：
因为它与细胞的不同化学成分的不同，结果在反应的甲苯胺蓝O被归类为多色染料一个多彩色的试样（ 图7）。产生的颜色可以提供对细胞和它的墙壁性质的信息。甲苯胺蓝O是阳离子染料结合到带负电荷的基团5。该染料的水溶液是蓝色的，但是当染料与小区6,9不同的阴离子基团结合不同的颜色产生。举例来说，当染料反应与羧基化的多糖，例如果胶酸一略呈粉红的紫色颜色的显示位置;绿色，蓝绿色，或明亮蓝色的聚芳香物质，如木质素和单宁;和紫或偏绿的蓝色与核酸。茎的横截面甲苯胺蓝ö发现木质部和interfascicular纤维木质化，因为它们显示出蓝绿色或蓝色的颜色（ 图7，图C），这是在用UV或Ph-盐酸染色观察（ 图2的协议和3）。与此相反，髓和皮层和表皮组织中显示出蓝绿色或蓝色着色，因为尽管它们不木质化，它们包含在其细胞壁一些果胶聚合物。茎的横截面进行了5X，10X，20X下进行分析，40X放大倍数（ 图7组件A，B，C和D - E，分别），以更好地可视化，甲苯胺蓝染色ø分布在整个茎和分化的主要组织。
图1自制模具用于嵌入茎在左侧; 2毫升螺旋盖离心管（A部分）和0.6 ml离心管（B部分）底部之上。在右侧;的封口膜拿着两部分; A和B以形成最终模具。
A的图2。紫外荧光拟南芥茎的横截面。野生型A的横截面在紫外光下呈现荧光的芳香族化合物，包括木质素，只有在interfascicular纤维和木质部细胞（ - E A）的城墙存在拟南芥茎。表皮层和皮层（EP），interfascicular纤维（网络连接），髓（PI）和木质部（XY）的位置表示。放大倍率：A组：5X，B组 ：10X; C组 ：20X; 面板D和E：40X。巴= 100微米。
图3 A的间苯三酚，盐酸染色拟南芥茎的横截面 。野生型A的间苯三酚，盐酸染色（粉红色或紫红色的颜色）显示在interfascicular纤维和木质部细胞（ - E A）的墙壁正常木质素沉积拟南芥的茎段。表皮层和皮层（EP），interfascicular纤维（网络连接），髓（PI）和木质部（XY）的位置表示。放大倍率：A组：5X，B组 ：10X; C组 ：20X; 面板D和E：40X。巴= 100微米。
图4：A的马乌莱染色拟南芥茎的横截面。野生型A的MAULE染色（红色） 拟南芥</ em>的呈现在interfascicular纤维和木质部细胞（A - E）的墙壁正常木质素沉积的茎段。表皮层和皮层（EP），interfascicular纤维（网络连接），髓（PI）和木质部（XY）的位置表示。放大倍率：A组：5X，B组 ：10X; C组 ：20X; 面板D和E：40X。巴= 100微米。
图5。A的钙荧光白染色野生型A的拟南芥茎横截面。钙荧光白染色呈现在表皮，皮层，髓部，interfascicular纤维，木质部（ - E A）的细胞的细胞壁纤维素沉积拟南芥的茎段。该positi表皮层和皮层（EP）的插件，interfascicular纤维（网络连接），髓（PI）和木质部（XY）表示。放大倍率：A组：5X，B组 ：10X; C组 ：20X; 面板D和E：40X。巴= 100微米。
图6：A.刚果红染色野生型A的拟南芥茎横截面。刚果红染色呈现在表皮，皮层，髓部，interfascicular纤维，木质部（ - E A）的细胞的细胞壁纤维素沉积拟南芥的茎段。表皮层和皮层（EP），interfascicular纤维（网络连接），髓（PI）和木质部（XY）的位置表示。放大倍率：A组：5X; B组 C组 ：20X; 面板D和E：40X。巴= 100微米。
A的图7。甲苯胺蓝O染色野生型A的拟南芥茎横截面。甲苯胺蓝O染色显示在interfascicular纤维和木质部细胞（ - E A）的墙壁正常木质素沉积拟南芥的茎段。表皮层和皮层（EP），interfascicular纤维（网络连接），髓（PI）和木质部（XY）的位置表示。放大倍率：A组：5X，B组 ：10X; C组 ：20X; 面板D和E：40X。巴= 100微米。
表1。显微镜和相机设置成像。指引荧光过滤器和明场成像的工作。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
拟南芥茎段被广泛用于研究细胞在次生壁的组织和定性研究野生型和转基因植物之间的差异。常用的技巧切片标本是直接手工切割;或当试样被嵌入在琼脂糖或固定剂，切片，可以用vibratome或切片进行。而相比之下，手工切割，最后两个允许减少生产样品之间的差异不准确的，将通过所引起的样品和不平坦的表面之间的厚度差的不良样品的制备可以简单地造成的风险。所有这些方法都有各自的优点和缺点。我们选择在琼脂糖包埋，然后用vibratome切片，并且这样做的原因如下：嵌入的容易程度和时间在用琼脂糖略去省去了的新鲜组织精细的加工。此外，我们的自制模具很容易和便宜，使，可容纳日Ë茎直，可使用多年，并能帮助在容易剥离的标本不作乱。以溶解高百分比的琼脂糖，得到均匀的溶液的最佳方式（7克琼脂糖在100毫升不形成大块的颗粒完全溶解）是高压釜，或在最低强度微波它。它切割茎组织新鲜，或者将其存储在一个板置于含有水润湿的滤纸，以防止组织脱水和变形冰是很重要的。储存干时间超过30分钟没有长高湿度会导致干到干。阀杆被嵌入右之前琼脂糖的温度应该在50℃。关键是要检查是否有空气气泡的存在后，将琼脂糖已被倒入小瓶中，因为气泡会引起间隙在模具中，因此切片将是不均匀的。气泡可以迅速通过将溶液在真空下浇注之前被删除它。阀杆应放置在琼脂糖时，它仍然是软的，而不是温度高于50℃。热量会损坏样品通过干瘪的茎，并会破坏细胞形态。如果琼脂糖太冷阀杆不会通过琼脂糖渗透并包埋将是不可能的。琼脂糖包埋后，干的样品可以储存在4℃下最多一周。
使用一个vibratome的，而不是手工切片产量精确切割标本和更好的图像质量。所有的安全指示应仔细阅读并在使用vibratome紧随其后。以确保样品盘是否清洁，干燥，让组织粘合剂大力保持标本的地方，所以它不会切片过程中脱落是很重要的。试样的厚度被指定为承受在染色过程的严酷的酸和碱的处理。在vibratome使用的刀片应是完全平坦的，以确保该部分被切断的EVenly。切片取每个样品约20分钟;为了节省时间，类似的标本可以在组上单个样品板切片。在切片，将切片从缓冲盘调成小培养皿中，使部分更容易看到一个明确的背景和解放缓冲液盘下一个标本。段可立即用于下游染色程序或存储供以后使用。等分的茎段至2.0 ml离心管中有助于中涂底漆的染色程序。在相机与显微镜的正确的调整和设置实现高品质的图像非常关键的。调节柯勒照明是在使用显微镜的最重要的步骤之一。在方法部分所述的孔径和光强的调整，仅作为指引。它们可能需要根据所使用的显微镜和照相机来进行修改。我们使用一个高分辨率数码相机与大画幅隔行扫描CCD芯片和无机械快门紫外成像，钙荧光白，刚果红染色;和高分辨率和高速彩色相机的马乌莱，间苯三酚和甲苯胺蓝O染色亮场图像。图像进行分析，处理和使用标准成像软件组装。
间苯三酚是最常用的染色木质素的决心;它不是一个真实的木质素污垢，因为它会沾污仅肉桂醛端基。的间苯三酚染色，也被称为Weisner污垢，产生在木质部和interfascicular纤维，其中这些醛基存在4特殊性樱桃粉红色或紫红色颜色。粉红色的颜色的强度随木质化程度。虽然细微的差别是很难去观察，很容易发现野生型和突变茎段有变化，其木质素含量19之间的差异。它也是EASy以观察之间的年轻人（向茎尖）和老年人（干基）组织，差异，因为这样的组织之间的木质化程度不同。通常在野生型干，表皮皮层和髓部不含有肉桂醛（因此不要让有色），除非有异位木质化20。 MAULE染色，在另一方面，是特定朝向紫丁香木质素单元，并且可以用来区分在S或G设备不同木质素富集（ 例如纤维与木质部组织）14,18。高锰酸钾与盐酸作用于在木质素在S单元的紫丁香核形成methoxycatechol再到甲氧基 - 邻 - 苯醌以下用氢氧化铵反应。马乌莱染色用于区分缺乏或广泛地贫木质素秒为单位（ 例如在拟南芥突变体F5H和一般裸子植物）突变体的一个很好的指标，马乌莱给黄棕色着色研究所红色的两个木质部和厚壁组织21元首。出于同样的原因，MAULE染色可用于区分被子植物，其中主要含有S木质素从裸子植物通常缺乏对S单元18。由于强酸强碱是间苯三酚和马乌莱染色程序中分别使用，一些实验步骤需要谨慎进行。既浓盐酸和氢氧化铵是强腐蚀性物质;他们能恶化的显微镜载物台和镜头，如果不处理含有PH-HCl和马乌莱染色样品的幻灯片正常。他们还可以干起来快，在5-10分钟，造成标本恶化，因此成像，必须迅速完成。甲苯胺蓝O是一个多色的污垢和污渍的细胞壁中不同颜色的不同的组件，因为它与细胞壁的不同化学成分的反应不同，产生多种颜色的样品。所产生的颜色可以providE资料对细胞的性质。甲苯胺蓝O是还阳离子染料结合到带负电荷的基团5,6。该染料的水溶液是蓝色的，但是当染料与小区不同的阴离子基团结合不同的颜色产生。例如，该颜色是粉红色的紫色，当染料反应与羧基化的多糖，例如果胶;绿色，蓝绿色，或明亮蓝色的芳香物质，如木质素和单宁;和紫或偏绿的蓝色与核酸。染色容易，并可以持续两天。
钙荧光白渍纤维素，胼胝质，和其他未取代的或取代的弱β-葡聚糖6-9，和刚果红染色直接向β-（1→4） -葡聚糖，特别是在纤维素8,10,11。钙荧光白渍出色的表皮，皮层和髓部但辉煌的显著木质部和interfascicular纤维减少。有两个possible解释在很大程度上木质化组织钙荧光白的降低荧光;属性之一到木质素的存在，这将反过来减少钙荧光白色的，通过适当地扩散到多糖的能力。第二种解释点由钙荧光紫外下白激动发出的荧光的部分淬火。相反，钙荧光白，刚果红染色似乎较少受木质素的存在。这可能与钙荧光白和刚果红的荧光性质的差异;刚果更好的扩散能力，通过红比钙荧光白的木质化的组织;或多糖结合性能22略有差异。需要注意的是沾有刚果红的部分不宜存放过久前成像是非常重要的，因为刚果红趋向于水中，得到冲走。
虽然组织化学染色既不是定量也没有绝对的定论，它可以通过视觉线索揭示了大量有关重要性状，如组织或异常的细胞壁沉积和木质化的完整性信息。上述的染色技术很容易执行，并适用于在植物细胞壁的关键元素，如木质素和纤维素。相比之下，需要检测的半纤维素和果胶的各种部件的使用特异性抗血清和单克隆抗体免疫荧光。本报告旨在作为一个入门的初学者谁使用A.次生壁染色领域拟南芥作为模式系统。
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Acknowledgments
我们感谢萨宾罗素编辑协助。 （http://www.jbei.org）支持由美国能源部，科学，生物和环境研究办公室，办公室这项工作是美国能源部联合生物能源研究所的一部分通过合同DE-AC02-05CH11231劳伦斯伯克利之间国家实验室和美国能源部门。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
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