Introduction
La paroi de cellule végétale est titulaire d'une pléthore d'informations à l'intérieur de ses divers composants: la lignine, la cellulose, les hémicelluloses (xylane, glucuronoxylane, xyloglucane, arabinoxylane, glucane de liaison mixte, ou glucomannane), et de la pectine. Techniques histologiques fournissent des repères visuels importants dans l'étude des différences dans les parois secondaires au niveau organisationnel et cellulaires. Diverses techniques histologiques ont été développés et peuvent être trouvés dans la littérature, mais ces techniques peuvent être difficiles et fastidieux pour les débutants car protocoles très détaillés avec des instructions visuelles simples sont rarement, voire jamais disponible. Le but de cette étude est de fournir des lignes directrices simples pour les techniques de coloration histologique pour obtenir des images de haute qualité.
Sectionner le tissu de la tige est la première étape dans la visualisation des parois cellulaires et des formes cellulaires. Bien que les sections coupées à la main sont peu coûteux et prennent moins de temps pour se préparer, l'utilisation d'un vibratome offre cohérence etdonne des images de haute qualité. L'utilisation d'un vibratome permet de produire des données de meilleure qualité en générant même des sections avec la même épaisseur, ce qui permet de produire des images nettes et réduit de manière significative le risque de produire des différences entre les échantillons inexactes qui serait tout simplement causés par une mauvaise préparation de l'échantillon. Utilisation de résines pour fixer les échantillons frais peut être un défi pour les débutants et peut-être encore temps, même pour des experts quand une analyse qui doit être fait rapidement. En outre, il devient impossible de mesurer une quelconque activité biologique de l'échantillon lorsqu'il a été noyé dans une résine. Une technique simple qui utilise un moule d'agarose et fait maison est utile pour l'enrobage tissus de la tige, et elle peut également être utilisée dans d'autres applications nécessitant une dissection des tissus mous. Par rapport aux échantillons enrobage dans de la résine, ce procédé présente l'avantage de conserver les tissus vivants et de réduire la manipulation de l'échantillon. Sectionnement des tissus par un vibratome est très précis et génère homogenUO sections, qui, en fonction de l'objectif de l'étude, peuvent ensuite être utilisés avec plusieurs techniques de coloration différents.
Les méthodes les plus simples pour visualiser la lignine et d'autres composés aromatiques emploient les rayons ultraviolets (UV). Excitation des molécules aromatiques à base de lumière UV est une technique ancienne, mais il est encore l'un des plus rapides des approches pour la visualisation de la lignine. Cependant, la visualisation UV n'est effectivement pas idéal pour la détection de la lignine parce que la lumière UV va exciter d'autres composés aromatiques. La lignine est composé principalement de trois blocs de construction, les monolignols (alcools hydroxycinnamyl: alcool coniférylique, alcool sinapylique, et de l'alcool p-coumaryl) 1-3. Phloroglucinol tache peut fournir des indices à la mesure de cinnamaldéhydes présents dans le xylème, de fibres et de tissus de la trachée 4. Phloroglucinol est un bon indicateur de cinnamaldéhydes générales et peut différencier entre cinnamaldéhydes et d'autres composés aromatiques. Les monomères d'alcool sinapylique peuvent être détectéset différenciées par l'utilisation de Mäule taches. le bleu de toluidine O est un colorant polychromatique et a la capacité de colorer les différents éléments de la paroi cellulaire dans des couleurs différentes donc 5,6. La principale utilisation de bleu de toluidine O est de détecter la pectine et de la lignine 5,6. L'avantage d'utiliser le bleu de toluidine O, c'est que de nombreux éléments de la paroi cellulaire peuvent être visualisés en une seule étape. Les deux calcofluor blanc et rouge Congo sont faciles à travailler et peuvent être utilisés pour visualiser la cellulose. Calcofluor taches blanches cellulose, callose, et d'autres β-glucanes non-substitués ou substitués faiblement 6-9, tandis que le congo taches rouges directement à β-(1 → 4)-glucanes et notamment de cellulose 10,11. Le but de cette étude est de fournir des lignes directrices simples pour l'utilisation des techniques de coloration ci-dessus pour obtenir des images de haute qualité à partir de A. thaliana tiges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Souches Embedding
- Préparer une solution d'agarose à 7% dans l'eau (7 g d'agarose à une électrophorèse de qualité dans 100 ml d'eau distillée). Dissoudre la gélose par autoclavage pendant 20 min ou par micro-ondes pendant 20 min à la plus faible intensité (par exemple, une intensité de 1250 watts à micro-ondes de 10%).
- Préparer un moule maison pour intégrer les tiges à l'aide des flacons en plastique.
- En utilisant une lame de rasoir, coupez le fond conique d'un bouchon à vis microtube de 2 ml (partie A). Avec une aiguille de seringue, percer un trou dans le bouchon du tube légèrement plus grand que le diamètre de la tige à être noyée. Ensuite, coupez 0,5 cm du fond d'un tube à centrifuger de 0,6 ml (partie B).
- Ajouter la portion de 0,5 cm de coupure du tube de 0,6 ml à centrifuger dans le tube de ml prédécoupé 2 à centrifuger. Sceller les deux parties à l'aide de Parafilm (figure 1). NOTE: Le fond du tube est coupée pour faciliter l'élimination de l'échantillon incorporé, après la solidification de l'agarose. Til trou dans le bouchon aidera à tenir la tige stable lorsque la tige est ancrée dans agarose. Le moule servira à tenir l'agarose et tenir la ligne droite de la tige lors de l'incorporation. Le Parafilm tiendra les deux parties, A et B, jusqu'à ce que l'agarose est réglé et la tige est noyée.
- En utilisant une lame de rasoir, couper une section de la tige de la zone d'intérêt (par exemple, milieu du premier entre souches). NOTE: Dans l'idéal, la tige doit être coupé juste avant l'incorporation à éviter la destruction par la déshydratation. En variante, la tige peut être stockée temporairement dans une plaque contenant un papier filtre mouillé avec de l'eau. Cette plaque peut être placé sur de la glace avant d'être prêt à être incorporé pour empêcher la déshydratation du tissu et de la déformation. Stockage de la tige pour des périodes de plus de 30 min sans humidité élevée provoque la tige de sécher.
- Faire fondre l'agarose au micro-ondes à basse intensité. ATTENTION: La bouteille contenant de l'agarose peut être chaud. Utilisez un gant pour ramasser la bouteille. Que les s agarose fondutand à température ambiante (entre 20 ° C et 25 ° C) jusqu'à ce qu'elle se refroidit à environ 50 ° C.
- Pipette lentement 5 ml d'agarose dans le moule en plastique de premade pour remplir le flacon. REMARQUE: Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans les moules. Les bulles d'air causer des trous dans le moule d'agarose et ne couvrent pas complètement l'échantillon de la tige, ce qui mènera éventuellement à la coupe inégale des sections échantillons.
- Laissez le agarose refroidir pendant 30 à 60 sec pour devenir semi-solide. Testez avec un petit cure-dent, en s'assurant qu'il peut pénétrer et se tenir debout, mais pas flotter, dans l'agarose. NOTE: Si la tige est placée quand l'agarose est encore chaud, il peut endommager l'échantillon par le flétrissement de la tige, la destruction de la morphologie des cellules.
- Placez la tige dans cette fiole d'agarose-rempli. Assurez-vous que la tige reste droit. Placer le bouchon perforé de manière à ce que l'extrémité de la tige est maintenue par le bouchon. Ne pas tourner le bouchon à visser. Parfois, plus d'une tige (d'un seul type) peut être embedded dans un seul flacon; mais dans ce cas particulier, ne pas utiliser le bouchon. REMARQUE: Si le bouchon à visser est activée, la tige va se tordre.
- Laisser le flacon à température ambiante ou à 4 ° C pendant 10 à 30 min, jusqu'à ce qu'elle se solidifie.
- Retirer le moule en le faisant glisser doucement hors du tube. Ouvrez le Parafilm. Poussez la partie inférieure de la partie B du moule doucement avec le pouce pour libérer l'agarose solidifié de la partie A sur une lame de microscope en verre.
- Couper la tige incorporée agarose en trois parties à peu près égales de 1,2 cm de longueur. Découpez la partie de la tige qui n'était pas dans l'agarose et le jeter.
- Stocker ces morceaux de agarose avec l'intégré tiges dans hermétique 2 ml microtubes dans une boîte noire à 4 ° C jusqu'au moment de section. Sinon, stocker les tubes à 4 ° C pendant un maximum d'une semaine. NOTE: Le stockage est possible, mais l'expérimentateur doit être conscient que les tiges intégré sont encore en vie et, en fonction de l'expérience, Des objets pourraient être introduits.
2. Tige de section
- ATTENTION: Lire le manuel d'vibratome attentivement et suivez toutes les instructions de sécurité.
- Assurez-vous que la platine est propre et complètement sec (libre de tout solide ou liquide). Nettoyez le disque de l'échantillon avec une lame de rasoir pour enlever la colle résiduelle à partir d'expériences antérieures et laver avec de l'eau. Puis sécher avec une serviette en papier. NOTE: Cela permettra d'assurer que la colle fonctionne bien et se lie à l'échantillon d'agarose. Si cette étape n'est pas fait correctement, il est possible que l'échantillon peut ne pas adhérer au disque et seront par la suite provoquer le spécimen à tomber le disque pendant la coupe.
- Utilisez du papier essuie doux pour enlever toute l'humidité du bloc d'agarose contenant les échantillons.
- Placer une petite goutte de colle pour tissus sur le disque de spécimen. Tués sur l'adhésif pour couvrir la zone au milieu de la plaque à l'aide de la pointe de la bouteille d'adhésif. Place rapidementle bloc d'agarose de telle sorte que les échantillons sont soit perpendiculaire ou parallèle à la plaque transversale pour des sections transversales ou longitudinales, respectivement. Laisser l'adhésif pour fixer l'échantillon sur la platine à la température ambiante ou à 4 ° C pendant 10 à 30 min. NOTE: Il s'agit d'un pas de temps sensible.
- Fixer la platine en place sur le plateau de tampon ou creux. Les blocs d'agarose / s avec les sections doivent être en parallèle avec la lame de rasoir. Remplir le bac tampon avec de l'eau distillée à la température ambiante jusqu'à ce que les échantillons sont complètement immergées.
- Couper une lame de rasoir en deux, puis couper les extrémités avec des ciseaux robustes pour que la lame reste plat. Attacher une moitié de la lame de rasoir prédécoupée sur le porte-couteau.
- Régler l'angle du support de couteau à 84 °, la vitesse de 0,90 mm / s (position 8 sur le vibratome) et la fréquence de 50 Hz (position 5 sur le vibratome). Couper des sections de 100 um d'épaisseur. Utilisez le mode continu. NOTE: Cette épaisseur a été choisie pour assurer que le tissu peut supporter les divers traitements à l'acide et de la base utilisés dans certains des protocoles de coloration. Réglez la fenêtre pour la coupe et permettre 15-20 min sur un mode continu pour la vibratome à l'article un bloc d'agarose d'environ 1,2 cm.
- Recueillir les sections à l'aide d'une pipette en plastique jetable pendant la coupe dans le bac tampon. Alternativement, les sections peuvent être transférés dans le bac tampon dans un récipient en verre, puis à une boîte de Pétri clair. Transférer quelques sections les 2,0 ml microtubes. Remarque: Les échantillons sont prélevés à partir d'une boîte de Pétri, car il est plus facile de voir les sections sur un fond clair, et parce que le bac tampon peuvent être apprêtées pour l'échantillon suivant.
- Les sections peuvent être stockés dans un tube de 50 ml ou collectés et stockés dans des tubes de 1,5 à 2 ml de microcentrifugation à 4 ° C pendant 30 à 60 min. NOTE: Le stockage des sections pour de plus longues périodes entraîne une mauvaise qualité d'image.
3. Microscope et Réglage de l'appareil pour l'imagerie
- Régler l'éclairage Koehler sur la loupe. Choisissez un objectif. Focus sur l'échantillon d'abord. Amener l'intensité lumineuse à la moitié ou moins. Fermer le diaphragme de champ (FD) et l'ouverture (AP) ou l'amener au niveau le plus bas possible sur cet objectif particulier.
- Plus le grossissement est élevé, plus l'anneau aura. Utilisez le bouton de mise au point condenseur à concentrer les iris sur le terrain aussi fortement que possible.
- Porter lentement l'image de l'iris sur le terrain (petit anneau en forme de hexagone) au centre en utilisant les boutons condenseur-centrage (vis en forme de broche entourant le condenseur). Augmentez progressivement le diaphragme (FD) de telle sorte que l'iris de terrain atteint le bord. Arrêtez l'augmentation de la FD juste après le diaphragme de champ a passé le bord.
- Lentement augmenter l'ouverture (AP) pour régler le contraste. Réglez l'intensité lumineuse au besoin. REMARQUE: éclairage Koehler doit être ajustée pour chaque objectif, chaque jour expérimental. Notez les numéros obtenus après ajustement pour la journée. Ces chiffres seront réutilisés chaque fois que les objectifs sont mis en arrière pour ce jour particulier.
- Réglez l'ouverture, l'intensité, la durée d'exposition, le gain et filtres tels que décrits dans le Tableau 1. Cette information devrait être utilisé comme un guide.
- Utilisez un appareil photo numérique haute résolution avec un grand capteur CCD format interligne sans obturateur mécanique pour capturer des images de fluorescence; et une haute résolution, appareil photo à haute vitesse pour des images lumineuses-terrain.
- Traiter les lames en utilisant un logiciel standard. Chargez le logiciel. Cliquez sur "Acquire" et "Set caméra / planche", puis sélectionnez l'appareil à utiliser. Cliquez sur "OK". Cliquez sur "acquérir" puis "onglet Couleur." Sous "onglet en couleur," choisir "méthode Bayer" suivi de "moyenne quatre." Ajouter le gain proposé (rouge, vert, bleu) vientm Tableau 1. Sélectionnez l'onglet "Set sauver" et cliquez sur le répertoire où les images doivent être stockées. Réglez "temps d'exposition" à partir des suggestions dans le tableau 1. Set "Regroupement" à "1" et "binning Live" à "1". Mise au point sur la zone d'intérêt, puis cliquez sur "Enregistrer en direct."
- images de sortie sur le logiciel de l'appareil photo sont au format "TIF". Analyser les images pour l'histochimie des types cellulaires. Utilisez un logiciel standard de l'ordinateur pour des utilisations en aval de présentation et de publication.
4. Ultraviolet et brillant champ d'imagerie
- Utiliser une pipette de 1 ml avec la coupe de la pointe de pipette de sorte que les sections peuvent être introduits à la pipette facilement. Doucement sections de pipette dans la pointe et sur une lame de microscope. Couvrir les sections avec une lamelle. Respecter les sections sous lumière UV ou un éclairage lumineux-champ.
5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Coloration 12
- Dissoudre 0,3 g de phloroglucinol dans 10 ml d'éthanol absolu pour obtenir une solution de phloroglucinol de 3%. Mélanger un volume de HCl concentré (37 N) à deux volumes de 3% phloroglucinol dans l'éthanol; cette solution est le phloroglucinol-HCl (Ph-HCl) ou Wiesner taches. NOTE: Cette solution doit être fait frais le jour de la coloration et ne peut pas être stockée, parce que la solution se dégrade au fil du temps et la coloration sera inefficace. ATTENTION: HCl est très corrosif, donc à utiliser une extrême prudence lors de la manipulation de la tache Ph-HCl.
- Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter 1 ml de la solution-Ph HCl dans le tube contenant les sections et couronner le tout de suite car le HCl dans la tache Ph-HCl est très corrosif. Déplacez doucement le tube pour assurer que toutes les sections sont colorées. Une alternative à cette étape est de maintenir le bouchon du tube ouvert de façon que le pH de la solution-HCl peut être introduit à la pipette de haut en bas, de préférence sans perturber le sections. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette, car cela pourrait endommager ces articles.
- Utiliser une pipette de 1 ml avec la coupe de la pointe de pipette de façon à ce que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans dommage. Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope. Couvrir les sections avec lamelle. Respecter les sections sous un éclairage lumineux-champ. NOTE: La solution Ph-HCl sèche en 5-10 min, provoquant une détérioration des échantillons. Par conséquent, l'imagerie doit être complété dans ce délai de temps.
6. Mäule coloration 13,14
- Dissoudre 0,2 g de permanganate de potassium dans 40 ml d'eau distillée pour préparer une solution de permanganate de potassium à 0,5%. Stocker dans une bouteille sombre à la température ambiante pendant un maximum de 7 jours.
- Préparer une solution de HCl à 3,7% par addition de 1 ml de HCl concentré (37 N) à 9 ml d'eau distillée (01:10). Préparer une solution de HCl de 3,7% sur le fraisjour de l'expérience. Assurez-vous que la solution stock HCl 37 utilisé n'est pas trop vieux. Une solution d'hydroxyde d'ammonium concentré (14,8 M) doit être conservé à 4 ° C pour empêcher la molarité de la solution saturée de diminuer.
- Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter 1 ml de la solution à 0,5% de permanganate de potassium dans le tube contenant les sections.
- Pipeter la solution de permanganate de potassium à 0,5% et doucement, de préférence sans perturber les sections. Incuber pendant 2 min et répéter le pipetage. Laissez le microtube reposer jusqu'à ce que toutes les sections s'installent. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette que les sections peuvent être endommagés. Il peut être difficile de voir les sections de souches que la solution est sombre, alors gardez le tube avec les sections sur la grille de tube à essai et leur permettre de se contenter de 2 min.
- L'utilisation d'une pipette de 1 ml, tirer 700 ul de solution de permanganate de potassium à 0,5%.Ajouter 700 ul d'eau distillée pour rincer la solution de permanganate de potassium. Répétez 3-4x ou jusqu'à ce que la solution de l'eau reste claire.
- Jeter l'eau. Ajouter rapidement 1 ml de HCl à 3% jusqu'à ce que la couleur brun foncé est déchargé des sections. Cela peut arriver dans 3-5 min ou peut nécessiter 2 lavages de 5 min chacune. Introduire à la pipette sur toute la solution HCl 3% et procéder immédiatement à l'étape suivante.
- Ajouter 1 ml de solution d'hydroxyde d'ammonium concentré. Utiliser une pipette de 1 ml avec la pointe de coupe de telle sorte que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans dommage. Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope. Couvrir les sections avec une lamelle. Respecter les sections sous un éclairage lumineux-champ. ATTENTION: En raison de l'hydroxyde d'ammonium est extrêmement corrosif, il nécessite des soins et d'attention pour éviter de provoquer la corrosion de la platine du microscope ou objectif. NOTE: Les vapeurs d'hydroxyde d'ammonium peuvent brouillard la lamelle, il est difficile d'observer l'échantillon. Donc être très prudent avant d'ajouter la lamelle. La solution sèche en 5-10 min, afin de l'imagerie doit être terminé dans ce laps de temps.
7. Congo-Rouge coloration 11,15
- Dissoudre 0,5 g de rouge Congo dans 100 ml d'eau distillée pour préparer une solution à 0,5% rouge congo.
- Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter 1 ml de la solution de rouge Congo à 0,5% pour le tube. Pipette doucement la solution rouge de 0,5% congo de haut en bas sans déranger les sections. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette que cela pourrait endommager les sections.
- Incuber à température ambiante pendant 10 minutes et répéter le pipetage. Suivre avec un autre 3 min d'incubation à température ambiante.
- Utilisez une pipette de 1 ml à tirer 700 pi de solution à 0,5% rouge congo. Ajouter 700 ul d'eau distillée pour rincer la solution rouge congo. Répétez le lavage 3-4x jusqu'à ce que la solution de lavageest clair.
- Utiliser une pipette de 1 ml avec sa coupe de la pointe de telle sorte que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans dommage. Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope, et les couvrir avec une lamelle. Respecter les échantillons sur la lame de microscope sous la lumière bleue excitation en utilisant un filtre passe-bande avec un 560/40. NOTE: Ne pas stocker les sections dans l'eau pendant longtemps avant l'analyse microscopique, comme l'eau va laver le rouge congo en 10-30 min.
8. Calcofluor Blanc coloration 9
- Dissoudre 0,02 g d'azurant optique 28 (calcofluor blanc M2R) dans 10 ml d'eau distillée pour préparer une solution stock à 0,2%. La solution à 0,2% peut être stocké pendant six mois dans une bouteille sombre à 4 ° C. Préparer une solution de travail de 0,02% par dilution de la solution à 0,2% du stock 10x avec de l'eau distillée.
- Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter dans le tube 1 ml de 0,02% calcofLuor solution blanc. Pipette doucement la solution blanc 0,02% de calcofluor de haut en bas. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette que cela pourrait endommager les sections.
- Incuber à température ambiante pendant 5 min et répéter le pipetage. Incuber la section pour un autre 3 min à température ambiante. REMARQUE: Laissez les sections à régler sur le fond du tube pour faciliter à la pipette la solution sans endommager les sections.
- Utilisez une pipette de 1 ml à tirer 700 pi de solution blanc 0,02% de calcofluor et ajouter 700 ul d'eau distillée; attendre 5 min pour rincer la solution de blanc d'calcofluor. Répétez le lavage 3-4x. Utiliser une pipette de 1 ml avec la coupe de la pointe de la pipette de telle façon que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans dommage.
- Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope et les recouvrir d'une lamelle. Respecter les sections sous lumière UV.
9. Toluidine Blue O coloration 16,17
- Dissoudre 0,02 g de bleu de O toluidine dans 100 ml d'eau distillée pour préparer une solution à 0,02%. NOTE: La solution de bleu de toluidine O peut être stocké pendant deux semaines dans une bouteille sombre à la température ambiante.
- Transfert sections de tige dans un tube de 2,0 ml à centrifuger. Ajouter 1 ml de la solution de bleu de O toluidine 0,02% d'au tube. Pipette doucement la solution à 0,02% de bleu de toluidine O de haut en bas. Puis incuber à température ambiante pendant 5 min et répéter une fois le pipetage. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire à la pipette les sections dans la pointe de la pipette que cela pourrait endommager les sections. Laissez le microtube rester immobile jusqu'à ce que les sections s'installent. Cela peut être difficile à voir, car la solution est sombre, alors gardez le tube contenant les sections sur la grille de tube à essai et leur permettre de se contenter de 2 min à température ambiante.
- Utilisez une pipette de 1 ml à tirer 700 pi d'une solution à 0,02% de bleu de toluidine O. Ajouter 700 ul d'eau distillée pour rincer le bleu de toluidine O solution. Répétez 3-4x ou jusqu'à ce que la solution de lavage est clair. Utiliser une pipette de 1 ml avec la coupe de la pointe de pipette de façon à ce que les sections peuvent être facilement introduits à la pipette sans les endommager.
- Pipette doucement sections dans la pointe et sur une lame de microscope et les recouvrir d'une lamelle. Respecter les sections sous un éclairage lumineux-champ.
- Régler l'éclairage Koehler sur la loupe. Choisissez un objectif. Focus sur l'échantillon d'abord. Amener l'intensité lumineuse à la moitié ou moins. Fermer le diaphragme de champ (FD) et l'ouverture (AP) ou l'amener au niveau le plus bas possible sur cet objectif particulier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tige inclusion et la coupe:
L'utilisation du moule en matière plastique à incorporer le fait maison tiges dans 7% d'agarose révélée être rapide et facile (figure 1). Les deux parties (A et B; figure 1) du système de flacon intégré le rendent simple pour libérer facilement la tige intégré dans agarose comme l'agarose ne colle pas aux parties des flacons qui sont inertes, maintenir le système propre. Les flacons peuvent être réutilisés plusieurs fois pendant des années. La commodité de stockage de la tige intégré rend également les prochaines étapes faciles. Afin d'économiser le courant, similaire intégré tiges peuvent être regroupés (jusqu'à 3) sur une plaque de découpe unique pour la coupe.
Observation des aromatiques sous UV:
Les sections de tige sont montés dans de l'eau distillée sur les lames de verre et observées sous une lumière UV. Les composés aromatiques, y compris la lignine dans les cellules, peuvent être visualisées par leur autofluorescence sous lumière UV. Xylem (Xy) et fibres interfasciculaires (Fi)montré autofluorescence sous illumination UV, mais pas dans la moelle (Pi) et du cortex ou de l'épiderme (EP) (figure 2), en raison de la lignine, un polymère aromatique, on dépose au cours de secondaire biosynthèse de la paroi cellulaire. Dans certains cas, lorsque les plantes accumulent des quantités importantes de composés aromatiques dans leurs vacuoles (par exemple, anthocyanine), la fluorescence peut être observée dans les cellules corticales (données non présentées). Tige sections transversales ont été analysés sous 5X, 10X, 20X, 40X et un grossissement (Figure 2 Panneaux A, B, C et D - E, respectivement) afin de mieux visualiser la distribution aromatique de la paroi cellulaire à travers la tige.
Observation de la lignine dans les sections souches colorées avec phloroglucinol et Maule Stains:
Le xylème composé de vaisseaux et de fibres et de fibres interfasciculaires étaient les seuls éléments de la tige qui ont été souillés par les taches de lignine (de phloroglucinol et Mäule) En utilisant un type sauvage section de tige échantillon. Phloroglucinol tache réagit avec cinnamaldéhyde groupes terminaux de la lignine pour donner une couleur rose ou de fuchsia 4 (Figure 3). Comme observé sous illumination UV, une coloration fuchsia est observée dans les fibres du xylème et interfasciculaires mais est absent dans la moelle et le cortex ou de l'épiderme (Figure 3). Tige sections transversales ont été analysés sous 5X, 10X, 20X, 40X et un grossissement (Figure 3 Panneaux A, B, C et D - E, respectivement) afin de mieux visualiser la distribution de la tache de phloroglucinol à travers la tige et se différencient les principaux tissus; xylème et fibres interfasciculaires; moelle et le cortex; et l'épiderme. Habituellement l'intensité de la couleur est en corrélation avec le niveau de lignification de manière qualitative - sauf lorsque le mutant ou transgénique analysé est anormalement enrichis en unités de cinnamaldéhyde dérivés (par exemple mutants cad) <sup> 14. La tache Mäule est spécifique à détecter les syringiques unités de lignine dans le xylème et fibres interfasciculaires. Coloration rouge indique la présence d'syringiques unités de lignine dans les éléments de la lignine (figure 4) 18. Toutefois, une coloration rouge brillant est observée dans les fibres par rapport aux tissus de xylème ce qui suggère que les fibres contiennent un niveau plus élevé de la lignine S tandis que le xylème est plus enrichi en unités G. Comme observé après le phloroglucinol coloration, une coloration rouge est observée dans les fibres du xylème et interfasciculaires mais est absent dans la moelle et le cortex ou de l'épiderme (Figure 4). Il est également en corrélation avec la distribution de la lignine observé sous UV (figure 2) et montre que les unités syringiques sont présentes dans tous les tissus lignifiés de cet échantillon de la tige. Tige sections transversales ont été analysés sous 5X, 10X, 20X, 40X et un grossissement (Figure 2 Panneaux A, B, C, etD - E, respectivement) afin de mieux visualiser la répartition des taches Mäule travers la tige et différencier les principaux tissus: fibres xylème et interfasciculaires, moelle et le cortex, et l'épiderme. Il est important de noter que la quantité et la distribution des unités syringiques entre les tissus lignifiés varient avec l'âge de la tige et peuvent être absents dans une jeune tige (données non présentées).
Observation des souches coupes colorées avec Calcofluor blanc et rouge Congo Stains:
Calcofluor taches blanches cellulose, callose, et d'autres β-glucanes non substituées ou faiblement substitués; tandis que le congo taches rouges directement à β-(1 → 4)-glucanes et notamment à la cellulose. sections souches colorées avec du blanc de calcofluor ont été observées sous lumière UV 6-9. Congo sections colorées en rouge ont été observées sous une excitation de lumière bleue en utilisant un filtre avec une bande passante de 560/40. Les deux Calcofluor blanc et rouge Congo souillé l'épiderme, cortex et la moelle; eest parce que tous ces tissus contiennent de la cellulose comme majeur polymère de polysaccharide dans leurs parois cellulaires (figure 5 et la figure 6, respectivement). Contrairement à calcofluor blanc, le congo polysaccharides rouge teinté mieux dans le xylème et fibres interfasciculaires et semble moins affectée par la présence de lignine (figures 5 et 6) 10,11. Souches sections ont été analysés sous 5X, 10X, 20X et 40X (Panneaux A, B, C, et DE, respectivement des figures 5 et 6) de mieux visualiser calcofluor blanc et le congo distributions de tache rouge sur la tige et le majeur tissus (xylème et fibres interfasciculaires, moelle et le cortex, et épiderme).
Observation des souches coupes colorées avec du bleu de toluidine O:
le bleu de toluidine O est classé comme un colorant polychromatique, car il réagit avec les différents composants chimiques des cellules différemment et se traduit parun spécimen multicolores (figure 7). Les couleurs produites peuvent fournir des informations sur la nature de la cellule et ses parois. le bleu de toluidine O est un colorant cationique qui se lie à des groupes à charge négative 5. Une solution aqueuse de ce colorant est le bleu, mais de couleurs différentes sont générées lorsque le colorant se lie avec différents groupes anioniques dans l'6,9 cellulaire. Par exemple, une couleur pourpre rosâtre apparaît lorsque le colorant réagit avec des polysaccharides carboxylés tels que l'acide pectique; vert, bleu verdâtre, ou bleu vif avec des substances aromatiques polycycliques tels que la lignine et les tanins; et violacé ou bleu verdâtre avec des acides nucléiques. O Le bleu de toluidine de souches sections a révélé que les fibres du xylème et interfasciculaires sont lignifiées car ils montrent une coloration bleue ou bleu-vert (graphique 7, partie C), ce qui est en accord avec les UV et observations de coloration Ph-HCl (figures 2 et 3). En revanche, la moelle et tissus du cortex et l'épiderme montrent une coloration bleue ou bleu-vert parce que, même si elles ne sont pas lignifiées, ils contiennent des polymères de pectine dans leurs parois cellulaires. Tige sections transversales ont été analysés sous 5X, 10X, 20X et 40X (figure 7 Panneaux A, B, C et D - E, respectivement) afin de mieux visualiser la distribution de la tache de bleu de O toluidine à travers la tige et à différencier les principaux tissus .
. Figure 1 moule maison pour intégrer les tiges sur le côté gauche.; haut du tube de 2 ml à bouchon à vis centrifuger (Partie A) et le fond du tube de 0,6 ml (partie B). Sur le côté droit; le Parafilm tenant les deux parties; A et B pour former le moule final.
Figure 2. Fluorescence UV de A. souches thaliana sections. sections transversales de type sauvage A. thaliana tige fluorescence sous la lumière UV montrant la présence de composés aromatiques, y compris la lignine, que dans les parois des fibres interfasciculaires et les cellules de xylème (A - E). Les positions de l'épiderme et du cortex (EP), des fibres interfasciculaires (Fi), moelle (Pi), et xylème (XY) sont indiqués. Grossissements: Groupe A: 5X; Groupe B: 10X; Groupe C: 20X; panneaux D et E: 40X. Bar = 100 um.
Figure 3. Phloroglucinol-HCl coloration de A. thaliana souches de sections transversales. Phloroglucinol-HCl coloration (couleur rose ou fuchsia) d'un type sauvage A. la section de tige de thaliana montrant le dépôt de lignine normale dans les parois des fibres interfasciculaires et les cellules de xylème (A - E). Les positions de l'épiderme et du cortex (EP), des fibres interfasciculaires (Fi), moelle (Pi), et xylème (XY) sont indiqués. Grossissements: Groupe A: 5X; Groupe B: 10X; Groupe C: 20X; panneaux D et E: 40X. Bar = 100 um.
Figure 4. Mäule coloration de A. souches thaliana sections. Mäule coloration (couleur rouge) d'un type sauvage A. thaliana </ Em> section de la tige indiquant le dépôt de la lignine normale dans les parois des fibres interfasciculaires et les cellules de xylème (A - E). Les positions de l'épiderme et du cortex (EP), des fibres interfasciculaires (Fi), moelle (Pi), et xylème (XY) sont indiqués. Grossissements: Groupe A: 5X; Groupe B: 10X; Groupe C: 20X; panneaux D et E: 40X. Bar = 100 um.
Figure 5. Calcofluor coloration blanc de A. souches thaliana sections. Calcofluor coloration blanche de type sauvage A. la section de tige de thaliana montrant le dépôt de cellulose dans les parois cellulaires des cellules de l'épiderme, cortex, la moelle, les fibres interfasciculaires et xylème (A - E). La positions de l'épiderme et du cortex (Ep), fibres interfasciculaires (Fi), moelle (Pi), et xylème (Xy) sont indiqués. Grossissements: Groupe A: 5X; Groupe B: 10X; Groupe C: 20X; panneaux D et E: 40X. Bar = 100 um.
Figure 6. Coloration au rouge Congo de A. tige thaliana sections. coloration au rouge Congo d'un type sauvage A. la section de tige de thaliana montrant le dépôt de cellulose dans les parois cellulaires des cellules de l'épiderme, cortex, la moelle, les fibres interfasciculaires et xylème (A - E). Les positions de l'épiderme et du cortex (EP), des fibres interfasciculaires (Fi), moelle (Pi), et xylème (XY) sont indiqués. Grossissements: Groupe A: 5X, Groupe B Groupe C: 20X; panneaux D et E: 40X. Bar = 100 um.
Figure 7. Bleu de toluidine O coloration de A. souches thaliana sections. bleu de toluidine O coloration d'un type sauvage A. la section de tige de thaliana montrant le dépôt de lignine normale dans les parois des fibres interfasciculaires et les cellules de xylème (A - E). Les positions de l'épiderme et du cortex (EP), des fibres interfasciculaires (Fi), moelle (Pi), et xylème (XY) sont indiqués. Grossissements: Groupe A: 5X; Groupe B: 10X; Groupe C: 20X; panneaux D et E: 40X. Bar = 100 um.
Tableau 1. Microscope et réglages de l'appareil pour l'imagerie. Directives d'utilisation des filtres de fluorescence et imagerie à champ lumineux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sections de la tige A. thaliana sont largement utilisés pour étudier l'organisation des cellules dans la paroi de la cellule secondaire et pour examiner les différences entre qualitativement type sauvage et des plantes transgéniques. Les techniques couramment utilisées pour sectionner les spécimens sont coupe de main directe; ou lorsque les spécimens sont intégrés dans agarose ou fixateur, la coupe peut être fait avec un vibratome ou microtome. A la différence de la découpe de la main, les deux derniers permettent de réduire le risque de produire des différences entre les échantillons erronés qui seraient simplement provoqué par une mauvaise préparation des échantillons causée par des différences d'épaisseur entre les échantillons et les surfaces irrégulières. Toutes ces méthodes ont leurs avantages et inconvénients. Nous avons choisi l'intégration dans l'agarose, suivie par la coupe à l'aide d'un vibratome, et l'avons fait pour les raisons suivantes: La facilité d'intégration et le temps passé en utilisant de l'agarose élimine la nécessité d'un traitement complexe de tissu frais. En outre, nos moules sont faits maison facile et pas cher à faire, peut contenir èmee tige droite, peut être utilisé pendant de nombreuses années, et peut aider à la libération facile de spécimens sans faire de dégâts. La meilleure façon de dissoudre haut pourcentage d'agarose et obtenir une solution homogène (la dissolution complète de 7 g d'agarose dans 100 ml sans former granulés morceaux) est à l'autoclave ou au micro-ondes au moment de la plus faible intensité. Il est important de couper le tissu de la tige fraîche, ou encore de le stocker dans une plaque placée sur la glace contenant un papier filtre mouillé avec de l'eau pour prévenir la déshydratation des tissus et de la déformation. Stockage de la tige pour des périodes de plus de 30 min sans humidité élevée provoque la tige de sécher. La température de l'agarose à droite avant de la tige est noyée doit être d'environ 50 ° C. Il est essentiel de vérifier la présence de bulles d'air après la gélose a été versé dans le flacon, car les bulles d'air provoquent des lacunes dans le moule et par conséquent le sectionnement seront inégales. Des bulles d'air peuvent être retirés rapidement en plaçant la solution sous vide avant de verseril. La tige doit être placée dans l'agarose quand il est encore mou et pas supérieure à 50 ° C. La chaleur peut endommager l'échantillon par le flétrissement de la tige et va détruire la morphologie cellulaire. Si l'agarose est trop froid la tige ne va pas pénétrer à travers l'agarose et l'incorporation ne sera pas possible. Après l'incorporation d'agarose, des échantillons de souches peuvent être conservées à 4 ° C jusqu'à une semaine.
Utilisation d'un vibratome au lieu des rendements sectionnement main spécimens et une meilleure qualité d'image avec précision coupé. Toutes les consignes de sécurité doivent être soigneusement lues et suivies tout en utilisant un vibratome. Il est important de veiller à ce que la platine est propre et sec pour permettre à l'adhésif de tissu pour maintenir l'échantillon fortement en place afin qu'il ne tombe pas pendant la coupe. L'épaisseur des éprouvettes est spécifiée pour résister à l'acide dure et les traitements de base au cours de procédures de coloration. La lame de rasoir utilisé dans le vibratome doit être complètement plate, afin que la section est découpée evenly. Sectionnement prend environ 20 min par échantillon; afin de gagner du temps, les échantillons similaires peuvent être sectionnés en groupes sur une plaque de spécimen unique. Pendant la coupe, les sections sont transférés dans le bac tampon dans une petite boîte de Petri à faire les sections plus faciles à voir sur un fond clair et à libérer le plateau de tampon pour l'échantillon suivant. Les sections peuvent être immédiatement utilisés pour des procédures de coloration ou en aval stockés pour une utilisation ultérieure. Aliquotage sections les souches de 2,0 ml microtubes aide à l'amorçage des procédures de coloration. Faire les ajustements et les réglages de l'appareil photo et le microscope sont très critiques pour obtenir des images de haute qualité. Régler l'éclairage Kohler est l'une des étapes les plus importantes dans l'utilisation du microscope. Les ajustements pour l'ouverture et l'intensité lumineuse, comme décrit dans la section des méthodes, sont destinés uniquement à titre indicatif. Ils peuvent avoir besoin d'être modifié en fonction de microscope et de la caméra utilisée. Nous avons utilisé une haute résolutionappareil photo numérique avec un grand format de puce interligne CCD et pas obturateur mécanique pour l'imagerie UV, calcofluor blanc, et coloration au rouge Congo; et une caméra à haute résolution et la couleur à grande vitesse pour des images lumineuses champ de Maule, le phloroglucinol et le bleu de toluidine O coloration. Les images ont été analysées, traitées et assemblées à l'aide de logiciels d'imagerie standard.
Phloroglucinol est la tache la plus couramment utilisée pour la détermination de la lignine; ce n'est pas un vrai tache de la lignine comme il tache cinnamaldéhyde seulement des groupes terminaux. La tache de phloroglucinol, également connu sous le nom Weisner tache, on obtient une caractéristique de cerise rose ou de couleur fuchsia dans le xylème et de fibres interfasciculaires où ces groupes aldéhyde sont présents 4. L'intensité de la couleur rose varie avec le degré de lignification. Bien que des différences subtiles sont plus difficiles à respecter, il est facile de repérer les différences entre les sections de type sauvage et des souches mutantes qui ont des variations de leur teneur en lignine 19. Il est également easy observer les différences entre les jeunes (vers le sommet de la tige) et plus âgés (la base des tiges) tissus, parce que les niveaux de lignification entre ces tissus varient. Habituellement dans le type sauvage tige, épiderme et le cortex moelle ne contiennent pas cinnamaldéhydes (donc ne soyez pas coloré) à moins lignification ectopique 20. Tache Mäule, d'autre part, est spécifique vers syringiques unités de lignine et peut être utilisé pour différencier les différents enrichissements de lignine en S ou G unités (par exemple fibre par rapport xylème) 14,18. Le permanganate de potassium et d'agir de l'acide chlorhydrique sur le noyau syringyle de l'unité de S dans la lignine pour former un méthoxycatéchol, puis au groupe méthoxy-o-quinone qui suit la réaction avec l'hydroxyde d'ammonium. La tache Mäule est un bon indicateur pour différencier les mutants qui manquent ou sont largement épuisées en unités S de lignine (par exemple dans des mutants de F5H A. thaliana et plantes généraux de gymnospermes), Mäule donne une coloration jaune-brun instead de rouge à la fois le xylème et le sclérenchyme 21. Pour la même raison, Mäule coloration peut être utilisée pour différencier les angiospermes, qui contiennent principalement de la lignine S gymnospermes qui manquent typiquement de l'unité de S 18. Parce que l'acide fort et la base sont utilisés pendant le phloroglucinol et procédures de coloration Maule respectivement, des mesures expérimentales doivent être effectuées avec prudence. Les deux HCl concentré et de l'hydroxyde d'ammonium sont corrosives solides; ils peuvent détériorer la platine du microscope et de l'objectif si les diapositives contenant les échantillons colorés Ph-HCl et Maule ne sont pas manipulés correctement. Ils peuvent également se tarir rapidement, dans les 5-10 minutes, provoquant des spécimens de se détériorer, de sorte que le imagerie doit être fait rapidement. le bleu de toluidine O est un colorant polychromatique et colore différents composants de la paroi cellulaire dans des couleurs différentes car il réagit avec les différents composants chimiques des parois cellulaires différemment, produisant un spécimen multicolores. Les couleurs générées peuvent PROVIDe des informations sur la nature de la cellule. bleu de toluidine O est également un colorant cationique qui se lie à des groupes chargés négativement 5,6. Une solution aqueuse de ce colorant est le bleu, mais de couleurs différentes sont générées lorsque le colorant se lie avec différents groupes anioniques dans la cellule. Par exemple, les couleurs sont un rosâtre pourpre lorsque le colorant réagit avec des polysaccharides carboxylés, tels que la pectine; vert, bleu verdâtre, ou bleu vif avec des substances aromatiques telles que la lignine et les tanins; et violacé ou bleu verdâtre avec des acides nucléiques. La coloration est facile et peut durer deux jours.
Calcofluor taches blanches cellulose, callose, et d'autres β-glucanes non substituées ou faiblement substitués 6-9, et le congo taches rouges directement à β-(1 → 4)-glucanes et notamment à la cellulose 8,10,11. Calcofluor taches blanches brillamment l'épiderme, cortex et la moelle, mais cet éclat est significativement réduite dans le xylème et fibres interfasciculaires. Il ya deux pPOSSIBLES explications pour la fluorescence du calcofluor blanc réduite dans les tissus fortement lignifiées; on attribue à la présence de la lignine, ce qui, à son tour, réduire la capacité de blanc de calcofluor pour diffuser correctement à travers les polysaccharides. Un second points d'explication à une trempe partielle de la fluorescence émise par le calcofluor blanc excité sous UV. Contrairement à calcofluor blanc, coloration au rouge Congo semble moins affectée par la présence de lignine. Elle pourrait être liée à la différence entre les propriétés de fluorescence du calcofluor blanc et rouge congo; une meilleure capacité de diffusion du rouge Congo à travers les tissus lignifiés que blanc calcofluor; ou une légère différence dans les propriétés de liaison 22 de polysaccharides. Il est important de noter que les coupes colorées au rouge Congo ne devraient pas être conservés trop longtemps avant de l'imagerie, parce que le Congo rouge a tendance à être emportés dans l'eau.
Bien que la coloration histochimique n'est ni quantitativeni absolument concluante, il peut révéler à travers des repères visuels une mine d'informations sur les caractéristiques importantes telles que l'intégrité des tissus ou des dépôts de la paroi cellulaire anormale et lignification. Les techniques de marquage décrits ci-dessus sont faciles à réaliser et sont applicables à des éléments essentiels dans une paroi de cellule végétale, telles que la lignine et la cellulose. En revanche, l'immunofluorescence en utilisant des antiserums spécifiques et des anticorps monoclonaux est nécessaire pour la détection de divers composants de l'hémicellulose et de la pectine. Ce rapport est destiné à servir d'amorce pour les débutants dans le domaine de la coloration secondaire de la paroi cellulaire qui utilisent A. thaliana comme système modèle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Sabin Russell pour aide à l'édition. Ce travail faisait partie de l'Institut mixte bioénergie DOE (http://www.jbei.org) soutenue par le Département américain de l'énergie, Bureau de la science, Bureau de la recherche biologique et l'environnement, par le biais du contrat DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley National Laboratory et l'US Department of Energy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W.
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
- Adler, E.
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S.
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
