Introduction
Bitki hücre duvarı çeşitli bileşenlerine içinde bilgi bir bolluk tutar: lignin, selüloz, hemiselülozlar (ksilan, glucuronoxylan, ksiloglukan, arabinoksilan, karışık bağlantı glukan veya glukomannanı), ve pektin. Histolojik teknikler örgütsel ve hücresel düzeyde ikincil hücre duvarları içinde farklılıklarını inceleyerek önemli görsel ipuçları sağlar. Çeşitli histolojik teknikler geliştirilmiş ve literatürde bulunabilir, ama basit görsel talimatları ile çok detaylı protokoller nadiren hiç varsa, çünkü bu teknikler zor ve zaman alıcı yeni başlayanlar için olabilir. Bu çalışmanın amacı, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek histolojik boyama teknikleri için basit kurallar sağlamaktır.
Kök doku Kesit hücre duvarları ve hücre şekillerde görselleştirilmesi ilk adımdır. El-cut bölümler ucuz ve hazırlamak için daha az zaman alacak olsa da, bir vibratom kullanımı tutarlılığı sunar veyüksek kaliteli görüntü verir. Bir vibratome kullanarak keskin görüntüler üretmek için yardımcı olur ve önemli ölçüde sadece kötü bir örnek hazırlama neden olacağını numuneler arasındaki yanlış farklılıkları üretme riskini azaltır, aynı kalınlıkta, hatta bölümleri üreterek daha iyi veri kalitesini üreten sağlar. Taze örnekleri düzeltmek için reçineler kullanılarak yeni başlayanlar için zor olabilir ve bir şekilde analiz yapılması gerektiğinde hala bile uzmanlar için zaman alıcı olabilir. Buna ek olarak, bir reçine içine gömülü olduğu zaman numunenin herhangi bir biyolojik aktivitesini ölçmek mümkün olur. Agaroz ve ev yapımı bir kalıp kullanır Basit bir tekniktir kök dokuları gömmek için yararlı olduğunu ve aynı zamanda yumuşak dokuların diseksiyonu gerektiren uygulamalarda kullanılabilir. Reçine içinde gömme örnekleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, canlı dokuları tutmak ve örnek manipülasyon azaltma avantajına sahiptir. Bir vibratom yoluyla dokulara Kesit derece hassas ve homojen üretirÇalışmanın amacına bağlı olarak, daha sonra çeşitli boyama teknikleri ile kullanılabilir, lı bölümleri.
Lignin ve diğer aromatik maddelerin görselleştirmek için en basit yöntem, ultraviyole (UV) ışık kullanır. UV ışığı ile aromat bazlı moleküllerin uyarma eski bir tekniktir, ancak yine de lignin görüntülenmesi için hızlı yaklaşımlardan biridir. UV ışık diğer aromatikleri heyecanlandıracak Ancak, UV görselleştirme aslında lignin tespiti için ideal değildir. 1-3: Lignin esas olarak üç yapı, monolinyollere (koniferil alkol, sinapil alkol ve p-kumaril alkol hydroxycinnamyl alkolleri) oluşur. Phloroglucinol leke ksilem, lif, ve trakea dokularda 4 mevcut sinamaldehitler'in ölçüde ipuçları sağlayabilir. Phloroglucinol genel sinamaldehitler'in iyi bir göstergesi olduğunu ve sinamaldehitler'in ve diğer aromatik ayırt edebilirsiniz. Sinapil alkol monomerler algılanabilirve Maule leke kullanılmasıyla ayrılır. Toluidin mavisi O çok renkli bir boya ve bu nedenle farklı renklerde 5,6 hücre duvarının farklı unsurları leke yeteneğine sahiptir. Toluidin mavi O birincil kullanımı pektin ve lignin 5,6 tespit etmektir. Toluidin mavi O kullanmanın avantajı, hücre duvarının birçok unsuru tek bir aşamada görselleştirilebilir olmasıdır. Beyaz Kalkofluor ve Kongo Kırmızı hem de çalışmak için kolay ve selüloz görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz, ve diğer non-değiştirmiş veya zayıf ikame β-Glukan 6-9, kongo kırmızı lekeler, doğrudan özellikle 10,11-β (1 → 4)-Glukan ve selüloz oysa. Bu çalışmanın amacı A. yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yukarıda belirtilen boyama tekniklerinin kullanımı için basit kuralları sağlamaktır thaliana kaynaklanıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Gömmeyi Kök
- Su içinde bir% 7 agaroz çözeltisi (distile su, 100 ml dereceli agaroz elektroforezi 7 g) elde edin. 20 dakika için otoklav ile ya da düşük yoğunlukta (1250 watt bir mikrodalga, örneğin,% 10 yoğunluk) 20 dakika boyunca mikrodalga ile agaroz eritilir.
- Plastik şişeleri kullanarak kaynaklanıyor gömmek için bir ev yapımı kalıp hazırlayın.
- Bir jilet kullanarak, bir 2 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüp (Bölüm A) konik alt kesti. , Bir şırınga iğnesi ile, gömülü olarak kök çapından biraz daha büyük boru kap içinde bir delik delinerek. Sonraki, bir 0.6 ml mikrosantrifüj tüp (Bölüm B) alt kısmına 0,5 cm kesti.
- Önceden kesilmiş 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine 0.6 ml mikrosantrifüj tüpü cut-off 0.5 cm kısmını ekleyin. Parafilm (Şekil 1) kullanılarak, iki parça kapatın. NOT: Tüpün alt Agaroz katılaşmış sonra gömülü numunenin çıkarılmasını kolaylaştırmak için kesilir. To kap içinde bir delik kök agaroz gömüldüğünde kök sabit tutulmasına yardımcı olur. Kalıp agaroz tutun ve gömerken kök düz tutmak için hizmet edecektir. Agaroz ayarlanır ve kök gömülü kadar Parafilm, iki parça, A ve B yapacak.
- Bir jilet kullanarak, ilgi alanı, (ilk kök boğum örneğin orta) bir kök bölümü kesti. NOT: İdeal olarak, kök sadece dehidratasyon yıkımı önlemek için gömmeden önce kesilmelidir. Seçenek olarak ise, sap geçici olarak su ile ıslatılmış filtre kağıdı içeren bir plaka saklanabilir. Bu plaka, doku su kaybını ve deformasyonunu önlemek için gömülü olması için hazır olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir. Yüksek nem olmadan 30 dakika daha uzun süreler için kök saklama kök kurumasına neden olur.
- Düşük yoğunlukta mikrodalgada agaroz eritin. DİKKAT: agaroz içeren şişe sıcak olabilir. Şişe almak için de eldiven kullanın. Erimiş agaroz diyelim(20 ° C ve 25 ° C arasında), oda sıcaklığında tand yaklaşık 50 ° C'ye soğuyana kadar
- Yavaş yavaş şişeyi doldurmak için önceden hazırlanmış plastik kalıp içine agaroz 5 ml pipetle. NOT: Emin kalıplar içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları agaroz kalıp boşlukları neden olur ve tamamen sonunda numune bölümlerinin düzensiz kesme yol açacaktır kök örneği, kapsamaz.
- Agaroz yarı katı olmak için 30 ila 60 saniye boyunca soğumaya bırakın. Nüfuz ve agaroz, yüzer ayağa olamaz, ama emin, küçük bir kürdan ile test edin. NOT: agaroz o hücre morfolojisi yok, kök aksatmanın tarafından örnek zarar verecektir hala sıcak olduğu zaman kök yerleştirilir ise.
- Bu agaroz dolu şişe içinde kök yerleştirin. Gövdesi düz kalır emin olun. Kök ucu, kapak tarafından düzenlenen bir şekilde delikli kapağı yerleştirin. Vidalı kapağı açmayın. Bazen (tek bir tür) bir kök daha embe olabilirTek bir şişede dded; ama bu özel durumda, kap kullanmayın. NOT: vidalı kapak açıksa, kök bükümlü alacak.
- Sertleşene kadar, 10-30 dakika süre ile, oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de şişeyi bırakın.
- Yavaşça tüpün dışına kaydırarak kalıp çıkarın. Parafilm açın. Bir cam mikroskop lamı üzerine Kısım A katılaşmış agaroz serbest bırakmak için parmak ile hafifçe kalıbın Kısım B alt itin.
- 1.2 cm uzunluğunda üç eşit parçaya agaroz gömülü kök kesilir. Agaroz değildi ve atın kök kısmını kesip.
- Gömülü olan agaroz bu parçaları Mağaza hava geçirmez bölüme hazır olana kadar 4 ° C'de bir siyah kutu içinde 2 ml mikrosantrifüj tüpleri kaynaklanıyor. Seçenek olarak ise, bir haftalık bir süre için 4 ° C'de tüpler saklayın. NOT: Depolama mümkündür, ama deneyci gömülü kaynaklanıyor hala hayatta ve deney olarak farkında olması gerekir, Eserler potansiyel tanıtıldı olabilir.
2.. Kesit alma Kök
- DİKKAT: dikkatle vibratome kılavuzunu okuyun ve tüm emniyet talimatlarını izleyin.
- Numune disk (herhangi bir katı veya sıvı ücretsiz) temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun. Önceki deneylerden herhangi bir kalıntı tutkal ve suyla yıkamak için bir traş makinesi bıçak ile numune diski temizleyin. Sonra bir kağıt havlu ile kurulayın. Not: Bu yapıştırıcı iyi çalışır ve agaroz numune bağlanan sağlayacaktır. Bu adımı düzgün yapılmazsa ise, numune diske uygun olmayabilir ve daha sonra numune kesit sırasında diske devrilmesine neden olasıdır.
- Kullanın yumuşak kağıt örnekler içeren agaroz blok herhangi bir nemi çıkarmak için mendil.
- Örnek disk üzerinde doku yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Çizgi yapışkan şişenin ucu kullanılarak plakanın ortasına bir alanı kapsayacak şekilde, yapışkan var. Çabuk yerAgaroz blok numuneler dik ya da sırasıyla, çapraz veya uzunlamasına kesitlerde, için plaka paralel olarak ya da olduğu kadar. Yapışkan 10-30 dakika için oda sıcaklığında ya da 4 ° C'de numune diske örnek düzeltmek için izin verin. NOT: Bu bir zaman duyarlı bir adımdır.
- Tampon tepsiye veya çukur üzerinde yerinde numune diski düzeltmek. Bölümleri ile agaroz blok / s jilet paralel olmalıdır. Örnekler tamamen gömülü olduğu kadar oda sıcaklığında damıtılmış su ile tampon tepsi doldurun.
- Yarısında jilet kesmek ve daha sonra bıçak tamamen düz kalır, böylece sağlam bir makasla uçlarını kesin. Bıçak tutucu üzerine önceden kesilmiş jilet yansım takın.
- 84 ° bıçak tutucuya açısını ayarlamak, 50 Hz (Vibratome pozisyon 5) 0.90 / sn mm (Vibratome pozisyon 8) ve frekans hızı. 100 um kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. Sürekli modunu kullanın. HAYIRTE: Bu kalınlık, doku boyama protokollerini kullanılan çeşitli asit ve baz tedavi dayanabilir emin olmak için seçildi. Kesit için pencere ayarlayın ve bölüm yaklaşık 1.2 cm'lik bir agaroz blok için Vibratome için sürekli bir modda 15-20 dk bekleyin.
- Tampon tepsisine kesit boyunca bir tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bölümleri toplayın. Alternatif olarak, kısımlar, bir cam kabın içine tampon tepsiden aktarılır ve daha sonra berrak bir Petri levhaya edilebilir. 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerine birkaç bölümleri aktarın. Not: numuneler saydam bir zemin üzerine bölümlerine bakınız daha kolay olduğu için, bir Petri plakasından toplanan ve tampon, tepsi bir sonraki numune için hazır olarak kabul edilebilir.
- Kesitler, 30-60 dakika boyunca 4 ° C de, 50 ml bir tüp içinde saklanan ya da toplandı ve 1,5-2 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde saklanabilir. NOT: Daha uzun süreler için bölümleri saklanması kötü görüntü kalitesine yol açacaktır.
Görüntüleme için 3. Mikroskop ve Kamera Ayarı
- Mikroskop Koehler aydınlatma ayarlayın. Bir hedef seçin. İlk numune odaklanın. Bir buçuk veya daha düşük bir ışık yoğunluğunu getirin. Alanında diyafram (FD) ve diyafram (AP) kapatın veya belirli bir hedef üzerinde mümkün olan en düşük ayara getirin.
- Büyütme kadar yüksek olursa, o kadar büyük halkası olacaktır. Gibi keskin mümkün olduğunca alan iris odaklanmak için kondansatör odaklanarak düğmeyi kullanın.
- Yavaşça kondansatör-merkezleme topuzlarını (Kondansörü çevreleyen iğne şeklindeki vida) kullanılarak merkeze alan iris (altıgen şekilli, küçük halka) resim getirecektir. Yavaşça alan iris kenarına ulaşır diyafram (FD) bu tür artış. Alan iris kenarını geçtikten hemen sonra FD artan durdurun.
- Yavaşça kontrastını ayarlamak için açıklığı (AP) artar. Gerektiği gibi ışık yoğunluğunu ayarlayın. NOT: Koehler aydınlatma her o için ayarlanması gerekiyorbjective, her deney gün. Gün için düzeltme yapıldıktan sonra elde edilen numaralarını not edin. Bu rakamlar hedefler o gün için ileri ve geri açıldığında her defasında yeniden edilecektir.
- Diyafram, şiddeti, maruz kalma süresi, kazanç, ve Tablo 1'de açıklandığı gibi filtreleri ayarlayın. Bu bilgiler sadece bir rehber olarak kullanılmalıdır.
- Floresan görüntü yakalamak için hiçbir mekanik obtüratör ile bir geniş format CCD çipi ile yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf makinesi kullanın; ve aydınlık alan görüntüler için yüksek çözünürlüklü, yüksek hızlı kamera.
- Standart yazılımı kullanarak slaytlar işleyin. Yazılımı yükleyin. "Al'ı" ve tıklayın "Set kamera / ütü masası," daha sonra kullanılacak kamera seçin. "Tamam" düğmesine tıklayın. Ardından "Al" Click "Renk sekmesinde." Altında "Renk sekmesinde," seçim "Bayer metodu" ve ardından "ortalama dört." Önerdi kazancı (kırmızı, yeşil, mavi) sağa sola eklem Tablo 1. "Set kaydetmek" sekmesini seçin ve görüntülerin saklanacağı dizinde tıklayın. Tablo 1'de önerileri "Pozlama süresi" olarak ayarlayın. "1" "binning" olarak ayarlayın ve "Canlı binning" ilgi bölgeye "1"., Odak ve sonra tıklayın "canlı kaydedin."
- Kamera yazılımı çıkış görüntüleri "TIF" formatında bulunmaktadır. Hücre tipleri için histokimyasal görüntüleri analiz edin. Sunum ve yayın aşağı kullanımlar için standart bilgisayar yazılımı kullanın.
4.. Ultraviyole ve Parlak alan Görüntüleme
- Bölümler kolayca pipetle böylece pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça pipet bölümler ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine. Bir kapak kayma bölümleri kapsayacak. UV ışığı veya parlak ışık altında alan bölümleri gözlemlemek.
5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Boyama 12
- % 3 phloroglucinol çözeltisi hazırlamak için, 10 ml mutlak etanol içinde 0.3 g floroglukinol çözülür. Etanol% 3 floroglukinol iki hacim için konsantre HCI (37 N), bir hacim karıştırın; Bu çözeltiye, phloroglucinol-HCl (Ph-HCI) veya Wiesner leke. NOT: Bu çözüm çözüm zamanla düşer ve boyama etkisiz hale gelecektir çünkü, boyamanın gününde taze yapılacak ve saklanabilir olamaz. DİKKAT: HCl oldukça yıpratıcıdır, Ph-HCl leke tutarken çok dikkatli kullanın.
- Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe Ph-HCl çözeltisi 1 ml ilave edilir ve Ph-HCl leke olarak HCl oldukça aşındırıcı, çünkü hemen kap. Yavaşça tüm bölümleri boyanır sağlamak için tüp hareket ettirin. Bu aşama için bir alternatif, Ph-HCl çözeltisi yukarı ve aşağı pipetle böylece tercihen saniye bozmadan, açık boru kap tutmaktırTIONS. NOT: Bu, bu bölümleri zarar verebileceğinden, pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun.
- Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Kapak kayma bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. NOT: Ph-HCl çözüm örneklerinin bir bozulmaya neden, 5-10 dakika içinde kurur. Bu nedenle, görüntüleme bu süre içinde tamamlanması gerekmektedir.
6.. Maule Boyama 13,14
- % 0.5 'lik bir potasyum permanganat solüsyonu hazırlamak için, 40 ml damıtılmış su içerisinde potasyum permanganat, 0.2 g çözülür. 7 günlük bir süre boyunca oda sıcaklığında karanlık şişe içinde depolayın.
- 9 ml saf su (1:10) ile, 1 ml konsantre HCI (37 N) ilavesiyle, bir% 3.7 HCI solüsyonu hazırlayın. Taze bir% 3.7 HCl çözeltisi hazırlayınDeney günü. Kullanılan 37 N HCI stok çözümü çok eski olmadığından emin olun. Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi (14.8 M) azalan gelen doymuş çözeltisi molaritesini önlemek için 4 ° C'de depolanmalıdır.
- Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 1 ml ilave edilir.
- Tercihen bölümleri bozmadan, yavaşça yukarı ve aşağı% 0.5 potasyum permanganat çözüm pipetle. 2 dakika boyunca inkübe edin ve pipetleme tekrarlayın. Tüm bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp bekletin. NOT: bölümleri zarar verebilir gibi pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bu çözüm karanlık olduğu gibi kök bölümlere bakın, bu yüzden tüp rafa bölümleri ile tüp tutmak ve onları 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir.
- 1 ml pipet kullanarak,% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 700 ul çekmek.Potasyum permanganat solüsyonu çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Su çözeltisi berrak kalana kadar 3-4x tekrarlayın ya.
- Su atın. Derin bir kahverengi renk bölümlerde taburcu kadar hızlı% 3 HCl 1 ml ekleyin. Bu, 3-5 dakika içinde ortaya çıkabilir veya 5 dakika her 2 yıkar gerektirebilir. Tüm% 3 HCl çözümü Pipet ve hemen bir sonraki adıma geçin.
- Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi 1 ml ilave edilir. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde uç kesim ile 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Bir lamel ile bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. DİKKAT: amonyum hidroksit derece aşındırıcı olduğundan, mikroskop veya mercek aşamasına korozyona neden önlemek için ekstra bakım ve dikkat gerektirir. NOT: amonyum hidroksit dumanlar zor örneği gözlemlemek için yapım, lamel sis olabilir. Bu nedenle lamel eklemeden önce ekstra dikkatli olun. Çözelti 5-10 dakika içinde kurur, bu yüzden görüntüleme o süre içinde tamamlanması gerekmektedir.
7. Kongo Kırmızı Boyama 11,15
- % 0.5 'lik Kongo kırmızı bir çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 100 ml kırmızı Kongo 0.5 g çözülür.
- Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0.5 Kongo kırmızısı çözeltisi 1 ml ilave edilir. Yavaşça% 0.5 kongo kırmızı çözümü pipet ve aşağı bölümleri bozmadan. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında kuluçkalama bir diğer 3 dakika ile izleyin.
- % 0.5 kongo kırmızı solüsyon 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Kongo kırmızı bir çözelti çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Yıkama çözeltisi kadar yıkama 3-4x Tekraraçıktır.
- Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde kendi ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet, ve kapak örtün. 560/40 bir bant geçiren bir filtre kullanılarak mavi ışık uyarma altında mikroskop lamı üzerine örnekleri gözlemlemek. NOT: Su 10-30 dakika içinde kongo kırmızı yıkayın gibi, önce mikroskopik analiz için uzun süre suda bölümleri tutmayın.
8. Kalkofluor Beyazı Boyama 9
- % 0,2 'lik bir stok çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 10 ml (beyaz Kalkofluor M2R'den) fluoresan parlatıcı 28 0.02 g çözülür. % 0.2 'lik çözelti, 4 ° C de karanlık bir şişe içinde, altı ay boyunca saklanabilir Damıtılmış su ile% 0.2 'lik stok çözeltisi 10x seyreltilerek% 0.02' lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. % 0.02 calcof en boru 1 ml ekleluor beyaz çözelti. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% calcofluor beyaz çözüm pipetle. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında bir diğer 3 dakika için bölümü inkübe edin. NOT: bölümleri daha kolay bölümlere zarar vermeden çözüm pipetle yapmak için tüpün dibine çökmesine izin verilmektedir.
- % 0.02 calcofluor beyaz solüsyon 700 ul çekmek ve distile su 700 ul eklemek için 1 ml pipet kullanın; 5 dk calcofluor beyaz çözümü çalkalamak için bekleyin. Yıkandıkları 3-4x tekrarlayın. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle olabilir Bu şekilde olarak pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın.
- Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. UV ışık altında bölümleri gözlemlemek.
9. Toluidine Blue O Boyama 16,17
- A% 0.02 çözeltisi hazırlamak için 100 ml damıtılmış su içinde 0.02 g toluidin mavi O çözülür. NOT: toluidin mavi O çözelti, oda sıcaklığında karanlık şişe iki hafta içinde saklanabilir.
- Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0,02 toluidin mavi O solüsyonun 1 ml ilave edilir. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% toluidin mavisi O çözüm pipetle. Daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve bir kez tekrar pipetleme. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp hala bekletin. Bu çözüm karanlık olduğu gibi, görmek, bu yüzden tüp rafa bölümleri içeren tüp tutmak ve onları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir.
- % 0.02 toluidin mavisi O çözeltisi 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Toluidin mavi O sol dışarı durulama için distile su 700 ul ekleyinution. 3-4x tekrarlayın veya yıkama solüsyonu kadar açıktır. Bölümler onlara zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın.
- Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek.
- Mikroskop Koehler aydınlatma ayarlayın. Bir hedef seçin. İlk numune odaklanın. Bir buçuk veya daha düşük bir ışık yoğunluğunu getirin. Alanında diyafram (FD) ve diyafram (AP) kapatın veya belirli bir hedef üzerinde mümkün olan en düşük ayara getirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gömme ve kesit Kök:
Gömmek için ev yapımı plastik kalıp kullanımı agaroz hızlı ve kolay (Şekil 1) kanıtladı% 7 kaynaklanıyor. İki parça (A ve B; Şekil 1) gömülü flakon sistemin basit kolayca temiz sistemini tutmak, agaroz atıl olan şişe parçaları sopa değil gibi agaroz gömülü kök serbest bırakmak için yapmak. Vialler yıl için birden çok kez tekrar edilebilir. Gömülü kök depolamak kolaylık da sonraki adımları kolaylaştırır. , Bazen gömülü benzer kurtarmak için kaynaklanıyor kesit için tek bir kesit tabakta (3'e kadar) toplanabilir.
UV altında Aromatlar Gözlem:
Kök bölümler cam slaytlar üzerine damıtılmış su içinde monte edilmiş ve UV ışığı altında gözlemlenmiştir. Hücrelerdeki lignin içeren aromatik bileşiklerin, UV ışığı altında otofloresansı ile görselleştirilebilir. Ksilem (Xy) ve interfasiküler lifler (Fi)lignin, bir aromatik polimer, ikincil hücre çeperi biyosentezi sırasında biriken, çünkü özü (Pi) ve korteks veya epidermis (Ep) (Şekil 2) UV ışıması altında değil otoflüoresanı gösterdi. Bitkiler vaküol (örneğin, antosiyanin) aromatiklerin önemli miktarda birikirse Bazı durumlarda, floresan kortikal hücrelerinin (veriler gösterilmemiştir) de gözlenebilir. Kök kesitleri 5X, 10X, 20X altında analiz edildi ve 40X büyütme (Şekil 2 Panel A, B, C, ve D - sırasıyla E,), daha çok kök hücre duvarı üzerinde bir aromatik dağıtım görselleştirmek için.
Phloroglucinol ve Maule boyalar ile boyanmıştır Kök bölümlerde Lignin Gözlem:
Damar ve lifler ve liflerden oluşan interfasiküler ksilem lignin lekeler (phloroglucinol ve Maule ile boyandı sapının sadece unsurları olduğunu), Vahşi tip kök bölümünde örnek kullanılmıştır. Phloroglucinol leke bir pembe ya da Fuchsia renk 4 (Şekil 3) vermek üzere lignin sinamaldehit uç-grupları ile reaksiyona girer. UV ışıması altında görüldüğü gibi, bir fuşya renklenmesi ksilem ve interfasiküler elyaf gözlenmiştir fakat özü ve korteks veya epidermis (Şekil 3) mevcut olmasıdır. Kök kesitler 5X, 10X, 20X altında analiz edildi ve 40X büyütme (Şekil 3 Paneller A, B, C, ve D - E, sırasıyla) daha sap genelinde floroglusinol leke dağılımını görselleştirmek ve büyük dokuları ayırt etmek; ksilem ve interfasiküler elyaflar; öz ve korteks; ve epidermis. Genellikle Rengin yoğunluğu, bir niteliksel şekilde Lignifikasyon seviyesi ile ilişkilidir - analiz edilen mutant ya da transgenik anormal sinamaldehit türetilmiş birim (örneğin cad mutant) içinde zenginleştirilmiş olan dışında <> 14 sup. Maule leke ksilem ve interfasiküler liflerde syringli linyin 'birimleri tespit özeldir. Kırmızı renklenmesi lignin elemanları syringli linyin 'birimlerinin varlığı (Şekil 4) 18 göstermektedir. Ksilem G birimlerde daha zengin iken liflerin S lignin yüksek bir seviyede içerdiğini göstermektedir ksilem dokulara kıyasla Ancak, daha parlak bir kırmızı rengi elyaflar gözlenmektedir. Floroglusinol boyama sonrası görülen gibi, kırmızı renklenmesi ksilem ve interfasiküler elyaf görülen ama lif özü ve korteks veya epidermis (Şekil 4) mevcut olmasıdır. Ayrıca, UV altında gözlenen lignin dağılımı (Şekil 2) ile ilişkilidir ve syringly birimler, bu kök örneğin her Odunlaşmış dokusunda mevcut olduğunu göstermektedir. Kök kesitleri 5X, 10X, 20X altında incelenmiştir ve 40X büyütme (Şekil 2 Panel A, B, C, ve edilmiştirD - E, sırasıyla) daha sap genelinde MAULE leke dağılımını görselleştirmek ve büyük dokuları ayırt etmek için: ksilem ve interfasiküler lifler, öz ve korteks ve epidermis. Bu miktar ve Odunlaşmış dokular arasında syringly ünitelerinden dağılımı sapının yaşma ve genç sap (veri gösterilmemiştir) mevcut olabilir dikkat etmek önemlidir.
Kalkofluor Beyaz ve Kongo Kırmızı lekeler ile Vitray Kök Kesitleri Gözlem:
Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz ve diğer ikamesiz veya zayıf ikame β-glukan; oysa Kongo kırmızı lekeler doğrudan β-(1 → 4)-glukanlar ve özellikle de selüloz. Kalkofluor Beyazı ile boyanmış kök bölümleri UV ışığı altında gözlemlenmiştir 6-9. Congo kırmızısı ile boyanmış kesitler 560/40 bir bant geçiren bir filtre kullanılarak mavi ışık uyarma altında gözlendi. Hem beyaz Kalkofluor ve kongo epidermis, korteks, ve ilik lekeli kırmızı; inciBu dokuların bütün hücre duvarları büyük polisakarit polimer (Şekil 5 ve Şekil 6, sırasıyla) ve selüloz içeren nedeni olduğunu. Bunun aksine ksilem ve interfasiküler liflerin daha iyi beyaz, Kongo kırmızı lekeli polisakaritler Kalkofluor ve daha az lignin mevcudiyetinde (Şekil 5 ve Şekil 6) 10,11 etkilenir görünmektedir. Kesitleri 5X, 10X, 20X altında analiz edildi, ve (6 Paneller A, B, C, ve DE, sırasıyla Şekil 5 ve) daha iyi bir kök ve büyük üzerinde beyaz ve Kongo Kırmızı leke dağılımları Kalkofluor 40X büyütme görselleştirmek Kök dokuların (ksilem ve interfasiküler elyaf, özü ve korteks ve epidermis).
Toluidin Blue O ile Vitray Kök Kesitleri Gözlem:
Farklı kimyasal farklı hücre bileşenleri ve sonuçlar ile reaksiyona girer, çünkü Toluidin mavisi O polikromatik bir boya olarak sınıflandırılırçok renkli bir numunesi (Şekil 7). Üretilen renk ve hücre duvarları doğası hakkında bilgi sağlayabilir. Toluidin mavisi O 5 negatif yüklü gruplar bağlanan katyonik bir boyadır. Bu boyanın sulu bir çözeltisi, mavi, ama boya hücre 6,9 farklı anyonik grup ile bağlar farklı renk oluşturulur. Boya gibi pektik asit gibi karboksilatlı polisakkaritler ile reaksiyona girdiğinde, örneğin, bir pembemsi mor renk görünecektir; yeşil, yeşilimsi mavi, ya da lignin ve tanen gibi poli aromatik maddeler ile parlak mavi; ve morumsu veya nükleik asitler ile yeşilimsi mavi. Kök kesitlerinin Toluidin mavisi O ksilem ve interfasiküler elyaflar UV ve Ph-HCl boyama gözlemler, (Şekil 2 ile uyum içinde olan, yeşilimsi mavi veya mavi renklenme (Şekil 7, Panel C) gösterir bu yana lignified ve ortaya çıkarmıştır 3). Buna karşılık olarak, öz ve onlar lignified olmasa da, onların hücre duvarlarında bazı pektin polimerler içerir, çünkü korteks ve epidermis dokular yeşilimsi mavi veya mavi renklenme gösterir. Kök kesitleri 5X, 10X, 20X altında analiz edildi ve 40X büyütme (Şekil 7 Panel A, B, C, ve D - E, sırası ile) daha iyi bir kök üzerinde Toluidin mavisi O leke dağıtım görselleştirmek için ve büyük dokuları ayırt etmek için .
.. Sol tarafta kaynaklanıyor gömmek için Şekil 1 Homemade kalıp; 2 ml vidalı kapak mikrosantrifüj tüpü (Kısım A) ve 0.6 ml mikrosantrifüj tüpü (Bölüm B) alt üst. Sağ tarafta; iki parça tutan Parafilm; Nihai kalıp oluşturmak için A ve B.
A. Şekil 2,. UV floresan thaliana kök kesitleri. vahşi tip A. enine kesitler Sadece interfasiküler elyaf ve ksilem hücrelerinde (- E A) duvarlarında lignin içeren aromatik bileşiklerin, varlığını gösteren UV ışığı floresan altında thaliana kök. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron.
Şekil 3,. A. Phloroglucinol-HCl boyama thaliana kök kesitleri. Bir vahşi tip A. Phloroglucinol-HCl boyama (pembe ya da fuşya renkli) interfasiküler elyaf ve ksilem hücrelerinde (- E A) duvarlarında normal lignin birikmesini arası thaliana kök bölümü. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron.
Şekil 4,. A. Maule boyama thaliana kök kesitler. vahşi tip A. Maule boyama (kırmızı renk) thaliana </ Em> interfasiküler elyaflar ve ksilem hücrelerinde (A - E) duvarlarında normal lignin birikmesini gösterilen sap bölümü. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron.
Şekil 5,. A. Kalkofluor beyaz boyama Bir vahşi tip A. thaliana kök kesitleri. Kalkofluor beyaz boyama epidermis, korteks, özü, interfasiküler lifler ve ksilem (- E A) hücrelerin hücre duvarlarında selüloz birikmesini gösteren thaliana kök bölümü. Positiepidermis ve korteks (AP) ons, interfasiküler lifler (Fi), öz (Pi) ve ksilem (Xy) gösterilir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron.
Şekil 6,. A. Kongo kırmızı boyama Bir vahşi tip A. thaliana kök kesitleri. Congo kırmızı boyama epidermis, korteks, özü, interfasiküler lifler ve ksilem (- E A) hücrelerin hücre duvarlarında selüloz birikmesini gösteren thaliana kök bölümü. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron.
A. Şekil 7. Toluidin mavisi O lekeleme Bir vahşi tip A. thaliana kök kesitleri. Toluidin mavisi O lekeleme interfasiküler elyaf ve ksilem hücrelerinde (- E A) duvarlarında normal lignin birikmesini arası thaliana kök bölümü. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron.
Görüntüleme için Tablo 1. Mikroskop ve kamera ayarları. Floresan filtreleri ve aydınlık alan görüntüleme ile çalışmak için yönergeler. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A. thaliana sap bölümleri yaygın olarak sekonder hücre duvarındaki hücre organizasyonunu incelemek ve niteliksel olarak vahşi tip ve transjenik bitkiler arasındaki farklılıkları incelemek için kullanılır. Örneklerin kesit için yaygın olarak kullanılan teknikler doğrudan el kesme vardır; numuneleri agaroz veya sabitleyici gömülü olduğunda ya da kesit bir vibratome veya mikrotom ile yapılabilir. Helisli aksine, sadece son iki numune ve düzgün olmayan yüzeyler arasında kalınlık farklılıklarından kaynaklanan kötü bir numune hazırlama neden olur numuneleri arasındaki farklar eksik üretme riskini azaltır izin verir. Bütün bu yöntemler kendi artıları ve eksileri var. Bir vibratome kullanarak kesit ardından, agaroz içinde gömme seçtik ve aşağıdaki nedenlerle yaptı: taze doku ayrıntılı işleme ihtiyacını ortadan kaldırır gömme kolaylığı ve zaman agaroz kullanılarak geçirdi. Ayrıca, bizim ev yapımı kalıpları yapmak kolay ve ucuz, th tutabilire düz kök, uzun yıllar kullanılabilir, ve bir karmaşa yapmadan örneklerin kolay açıklamasında yardımcı olabilir. Yüksek yüzdeli agaroz çözülür ve homojen bir çözelti elde etmek için en iyi yolu (tıknaz granülleri oluşturan olmadan 100 ml agaroz 7 g tam çözülme) bunu otoklav veya düşük yoğunlukta mikrodalga için olduğunu. Taze kök doku kesmek için, ya da alternatif olarak, doku su kaybını ve deformasyonu önlemek için, su ile ıslatılmış filtre kağıdı içeren buz üzerine yerleştirilmiş bir plaka içinde depolamak için önemlidir. Yüksek nem olmadan 30 dakika daha uzun süreler için kök saklama kök kurumasına neden olur. Kök gömülü olduğu hemen önce agaroz sıcaklığı yaklaşık 50 ° C olmalıdır Hava kabarcıkları kalıp boşlukları neden olabilir ve bunun sonucu olarak düzgün olmayan kesit olacaktır, çünkü agaroz şişe içine döküldükten sonra hava kabarcıklarının varlığı kontrol etmek çok önemlidir. Hava kabarcıkları dökme önce vakum altında hızlı bir şekilde yerleştirerek çözeltisi temizlenebiliro. Hala yumuşak ve sıcak 50 ° C olduğu zaman kök agaroz yerleştirilmelidir Isı kök aksatmanın tarafından örnek zarar verir ve hücre morfolojisi yok edecektir. Agaroz çok soğuk ise kök agaroz nüfuz olmayacak ve gömme mümkün olmayacaktır. Agaroz gömülen, kök örnekleri, bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
Yerine el-kesit verimleri bir vibratom kullanılması tam örneklerini ve daha iyi görüntü kalitesi kesti. Tüm güvenlik talimatları dikkatlice okuyun ve bir Vibratome kullanırken takip edilmelidir. Bu örnek disk, kesit sırasında düşmek değil bu yüzden doku yapıştırıcı yerde güçlü örnek tutmasını sağlamak için temiz ve kuru olduğundan emin olmak için önemlidir. Örneğin kalınlığı, boyama işlemleri sırasında sert asit ve baz tedavi dayanacak şekilde belirtilir. Vibratome kullanılan traş makinesi bıçak bölümünde EV kesilir sağlamak için tamamen düz olmalıdırEnly. Kesit numune başına yaklaşık 20 dakika sürer; Zaman kazanmak için, benzer örnekler tek bir örnek plaka üzerinde gruplar halinde kesitli olabilir. Kesitlere ayırma esnasında bölümler açık bir arka plan üzerinde yer görmek için bölümleri daha kolay hale getirmek için ve bir sonraki numune için tampon kaseti serbest bırakmak için, küçük bir Petri kabı içine tampon tepsiye aktarılır. Bölümler hemen aşağı boyama işlemleri için kullanılan ya da daha sonra kullanmak için saklanabilir. 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerine kök bölümleri aliquoting boyama işlemleri için prime yardımcı olur. Kamera ve mikroskop doğru ayarların yapılmasını yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için çok önemlidir. Kohler aydınlatma ayarlanması mikroskop kullanımında en önemli adımlardan biridir. Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi diyafram ve ışık yoğunluğu için ayarlamalar, sadece bir kılavuz olarak içindir. Onlar kullanılan mikroskop ve kamera bağlı olarak modifiye edilmesi gerekebilir. Biz yüksek çözünürlük kullanılmışbir geniş format CCD çipi ve hiçbir mekanik obtüratör UV görüntüleme için, calcofluor beyaz ve kongo kırmızı boyanması ile dijital kamera; ve Maule, floroglukinol ve toluidin mavisi O boyama parlak alan görüntüler için yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızlı renkli kamera. Görüntüler, analiz edilir, işlenir ve standart görüntüleme yazılımı kullanılarak monte edilmiştir.
Phloroglucinol lignin tayini için en sık kullanılan leke olduğunu; sadece sinamaldehit uç gruplara lekeleri gibi gerçek bir lignin leke değildir. Ayrıca Weisner leke olarak bilinen floroglusinol leke, ksilem ve bu aldehit grupları 4 mevcut interfasiküler lifler karakteristik bir kiraz pembe ya da fuşya rengi verir. Pembe rengin yoğunluğu Lignifikasyon ölçüde değişir. Ince farklılıkları gözlemlemek için zor olsa da, bu vahşi tip ve lignin içeriği 19 varyasyonlara sahip mutant kök bölümleri arasındaki farkları kolaydır. Ayrıca, EASBu tür dokular arasında odunlaşma düzeyleri değişir çünkü, (kök apeks yönünde) daha genç ve daha yaşlı (baz kök) dokular arasındaki farklılıkları gözlemlemek için y. Genellikle vahşi tip sapı, epidermis korteks ve öz ektopik odunlaşma 20 olmadıkça (böylece renkli alamadım) sinamaldehitler'in içermez. Maule leke, diğer taraftan, syringli linyin adet karşı spesifiktir ve S ya da G birimlerde farklı lignin zenginleşmeler (ksilem dokulara göre örneğin fiber) 14,18 ayırt etmek için kullanılabilir. Bir methoxycatechol oluşturmak için ve daha sonra amonyum hidroksit ile reaksiyonu takiben-o-kinon metoksi için lignin S biriminin syringly çekirdeği üzerinde, potasyum permanganat ve hidroklorik asit hareket ederler. Maule leke eksikliği ya da yoğun (A. thaliana F5H mutantlar ve genel gimnospermdir bitkilerde örneğin) lignin S birimlerinde tükenmiş olan mutantlar ayırt etmek için iyi bir gösterge olduğunu, Maule sarı-kahverengi renklenme Öğr verirksilem ve sertdokular 21 hem de kırmızı ead. Aynı nedenle, Maule esas boyama tipik olarak S birimi 18 eksikliği açıktohumlu ikinci S lignin ihtiva eden, kapalı-tohumlu ayırt etmek için kullanılabilir. Kuvvetli asit ve baz sırasıyla floroglukinol ve MAULE boyama işlemleri sırasında kullanılan olduğundan, bazı deneysel adımlar dikkatle yapılması gerekir. Konsantre HCl ve amonyum hidroksit hem de güçlü aşındırıcılar vardır; Ph-HCl ve MAULE lekeli örneklerini içeren slaytlar düzgün ele değilse onlar mikroskop sahne ve lens bozulabilir. Ayrıca numuneler bozulmaya neden 5-10 dakika içinde, çabuk kurur, böylece görüntüleme hızlı yapılmalıdır. Toluidin mavisi O bir çok renkli leke ve bir çok renkli numune üreten, farklı hücre duvarlarının farklı kimyasal bileşenler ile reaksiyona giren farklı renklerde hücre duvarının farklı bileşenlerinin boyar. Oluşturulan renkler provid olabilirhücrenin tabiatına e bilgiler. Toluidin mavisi O da negatif yüklü gruplar, 5,6 bağlanan katyonik bir boyadır. Bu boyanın sulu bir çözeltisi, mavi, ama boya hücreye farklı anyonik grup ile bağlar farklı renk oluşturulur. Boya pektin gibi karboksilatlı polisakkaritler ile reaksiyona Örneğin, pembemsi bir renk mor; yeşil, yeşilimsi mavi, ya da lignin ve tanen gibi aromatik maddeler ile parlak mavi; ve morumsu veya nükleik asitler ile yeşilimsi mavi. Boyama kolaydır ve iki gün boyunca sürebilir.
Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz ve diğer ikamesiz veya zayıf ikame β-glukanlar 6-9 ve Kongo kırmızı lekeler doğrudan doğruya (1 → 4)-β-glukan ve özellikle 8,10,11 selüloz. Beyaz lekeler Kalkofluor parlak epidermis, korteks ve öz ancak parlaklık önemli ölçüde ksilem ve interfasiküler liflerde azalır. İki p vardırağır Odunlaşmış dokularda calcofluor beyaz azaltılmış floresan için ossible açıklamalar; bir, sırayla polisakaritler üzerine düzgün bir şekilde yayılması için Kalkofluor beyaz kabiliyetini azaltacak, lignin varlığı için bağlıyor. UV altında heyecan beyaz Kalkoflorla tarafından yayılan flüoresans kısmi söndürülmesi için ikinci bir açıklama sayı. Bunun aksine, kırmızı boyama Kongo beyaz Kalkofluor daha az lignin varlığında etkilenir görünmektedir. Kırmızı calcofluor beyaz ve kongo arasındaki floresan özellikleri farkı ile ilgili olabilir; kongo daha iyi bir difüzyon kapasitesi calcofluor beyaz daha Odunlaşmış dokular aracılığıyla kırmızı; veya polisakarit bağlanma özelliklerine 22 çok az bir fark. Kongo kırmızı suyla yıkanıp almak eğilimindedir çünkü, Kongo kırmızısı ile boyanmış kesitler görüntüleme önce çok uzun saklanmamalıdır dikkat etmek önemlidir.
Histokimyasal boyama kantitatif de olsane kesinlikle kesin, görsel ipuçları ile bu dokuların veya anormal hücre duvarı birikimi ve Lignifikasyon bütünlüğü gibi önemli özellikleri hakkında bilgi hazinesi ortaya çıkarabilir. Yukarıda anlatılan boyama teknikleri uygulaması kolay olan ve bu tür lignin ve selüloz gibi bir bitki hücresi duvarı kritik elemanları, için de geçerlidir. Buna, spesifik anti-serumlar ve monoklonal antikorlar kullanılarak imüno-hemiselülozlar ve pektin çeşitli bileşenlerin tespiti için gereklidir. Bu rapor, A kullanın ikincil hücre duvarı boyama alanında yeni başlayanlar için bir astar olarak hizmet etmek içindir onların modeli sistem olarak thaliana'nın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz düzenleme yardım için Sabin Russell müteşekkiriz. Bu çalışma (http://www.jbei.org) ABD Enerji Bölümü, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, Ofisi tarafından desteklenen DOE Ortak Biyoenerji Enstitüsü parçası oldu Lawrence Berkeley arasındaki sözleşme DE-AC02-05CH11231 yoluyla Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W.
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
- Adler, E.
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S.
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
