Bitki hücre duvarı bileşimi doku tipleri arasında farklılık gösterir ve lignin, selüloz, hemiselülozlar ve pektin içerebilir. Hücre tipi düzeyindeki farklılıkları görselleştirmek için çeşitli boyama teknikleri geliştirilmiştir. Bu makale, yaygın olarak kullanılan hücre duvarı boyama tekniklerinin bir derlemesidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Arabidopsis thaliana, bitkilerdeki çeşitli hücresel süreçleri anlamak ve manipüle etmek için yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır ve ikincil hücre duvarı oluşumu çalışmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. İkincil hücre duvarı birikimi, birincil hücre duvarı yerleştirildikten sonra meydana gelir, bu işlem yalnızca damar ve lif dokuları oluşturanlar gibi özel hücreler tarafından gerçekleştirilir. İkincil hücre duvarlarının çoğu selüloz (%40-50), hemiselüloz (%25-30) ve ligninden (%20-30) oluşur. İkincil hücre duvarı biyosentezini etkileyen birkaç mutasyon izole edilmiştir ve karşılık gelen mutantlar, bu mutasyonlar telafi edici yanıtlarla maskelenebileceğinden, belirgin biyokimyasal bileşim değişiklikleri veya görsel fenotipler gösterebilir veya göstermeyebilir. Boyama prosedürleri tarihsel olarak hücresel bazda farklılıklar göstermek için kullanılmıştır. Bu yöntemler yalnızca görsel analiz araçlarıdır; Bununla birlikte, hızlı ve eleştirel analizdeki rolleri büyük önem taşımaktadır. Kongo kırmızısı ve kalkoflor beyazı, polisakkaritleri tespit etmek için kullanılan lekelerdir, oysa Mäule ve phloroglucinol, lignin içindeki farklılıkları belirlemek için yaygın olarak kullanılır ve toluidin mavisi O, polisakkaritleri ve lignini diferansiyel olarak boyamak için kullanılır. Görünüşte basit kesit alma, boyama ve görüntüleme teknikleri yeni başlayanlar için zor olabilir. A. thaliana modelini kullanarak numune hazırlama ile başlayan bu çalışma, bitkilerin ikincil hücre duvarlarında hücre ve doku organizasyonunun gözlemlenmesi için kolayca uygulanabilecek çeşitli boyama metodolojilerinin protokollerini detaylandırmaktadır.
Giriş
Bitki hücre duvarı çeşitli bileşenlerine içinde bilgi bir bolluk tutar: lignin, selüloz, hemiselülozlar (ksilan, glucuronoxylan, ksiloglukan, arabinoksilan, karışık bağlantı glukan veya glukomannanı), ve pektin. Histolojik teknikler örgütsel ve hücresel düzeyde ikincil hücre duvarları içinde farklılıklarını inceleyerek önemli görsel ipuçları sağlar. Çeşitli histolojik teknikler geliştirilmiş ve literatürde bulunabilir, ama basit görsel talimatları ile çok detaylı protokoller nadiren hiç varsa, çünkü bu teknikler zor ve zaman alıcı yeni başlayanlar için olabilir. Bu çalışmanın amacı, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek histolojik boyama teknikleri için basit kuralla....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Gömmeyi Kök
- Su içinde bir% 7 agaroz çözeltisi (distile su, 100 ml dereceli agaroz elektroforezi 7 g) elde edin. 20 dakika için otoklav ile ya da düşük yoğunlukta (1250 watt bir mikrodalga, örneğin,% 10 yoğunluk) 20 dakika boyunca mikrodalga ile agaroz eritilir.
- Plastik şişeleri kullanarak kaynaklanıyor gömmek için bir ev yapımı kalıp hazırlayın.
- Bir jilet kullanarak, bir 2 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüp (Bölüm A) konik alt kesti. , Bir şırınga iğnesi ile, gömülü olarak kök çapından biraz daha büyük boru kap içinde bir delik delinerek. Sonraki, bir 0.6 ml mikrosantrifüj tüp (Bölüm B) alt kısmına 0,5 cm kesti.
- ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gömme ve kesit Kök:
Gömmek için ev yapımı plastik kalıp kullanımı agaroz hızlı ve kolay (Şekil 1) kanıtladı% 7 kaynaklanıyor. İki parça (A ve B; Şekil 1) gömülü flakon sistemin basit kolayca temiz sistemini tutmak, agaroz atıl olan şişe parçaları sopa değil gibi agaroz gömülü kök serbest bırakmak için yapmak. Vialler yıl için birden çok kez tekrar edilebilir. Gömülü kök depolamak kolaylık da sonraki adımları kolaylaştırır. , Bazen gömülü benzer kurtarmak için kaynaklanıyor kesit .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
A. thaliana sap bölümleri yaygın olarak sekonder hücre duvarındaki hücre organizasyonunu incelemek ve niteliksel olarak vahşi tip ve transjenik bitkiler arasındaki farklılıkları incelemek için kullanılır. Örneklerin kesit için yaygın olarak kullanılan teknikler doğrudan el kesme vardır; numuneleri agaroz veya sabitleyici gömülü olduğunda ya da kesit bir vibratome veya mikrotom ile yapılabilir. Helisli aksine, sadece son iki numune ve düzgün olmayan yüzeyler arasında kalınlık farklılıklarından kaynaklanan kötü b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak herhangi bir mali çatışması yoktur.
Teşekkürler
Biz düzenleme yardım için Sabin Russell müteşekkiriz. Bu çalışma (http://www.jbei.org) ABD Enerji Bölümü, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, Ofisi tarafından desteklenen DOE Ortak Biyoenerji Enstitüsü parçası oldu Lawrence Berkeley arasındaki sözleşme DE-AC02-05CH11231 yoluyla Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agaroz | EMD | MERC2125 | CAS Numarası: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihidroksibenzen [CAS Numarası: 108-73-6] |
| Hidroklorik asit | EMD | HX0603-75 | CAS Numarası: 7647-01-0 |
| Amonyum hidroksit | EMD | AX1303-6 | CAS Numarası: 1336-21-6 |
| Toulidin Mavi O | Sigma | T3260 | Bluten klorür, Tolonyum Klorür [CAS Numarası 92-31-9] |
| Potasyum permanganat | Sigma | 223468 | CAS Numarası 7722-64-7 |
| Etanol 190 geçirmez | KOPTEC | V1401 | CAS Numarası: 64-17-5 |
| Kongo Kırmızı | Sigma | C6277 | Disodyum 3,3 '- [[1,1'-bifenil] -4,4'-diylbis (azo)] bis (4-aminonaftalin 1-sülfonat) [CAS Numarası 573-58-0] |
| Floresan Parlatıcı 28 / Calcofluor Beyaz Leke | Sigma | F3543 & nbsp; | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hidroksietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-il]amino]stilben-2,2'-disülfonik asit [CAS Numarası 4404-43-7] |
| Vibratom | Leica | Leica Titreşimli bıçak mikrotom VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | Amerikan Güvenlik tıraş bıçağı şirketi | Ürün # 60-0139-0000 | Paslanmaz Çelik Çift Kenarlı Bıçak (Personna Super) |
| Vidalı Kapaklı Mikrosantrifüj Tüpleri (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Mikrosantrifüj Tüpleri (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Sıcak El Koruyucu Eldiven |
| Doku yapıştırıcısı | Ted Pella Inc | 10033 | 4 & ° C'de saklayın; C veya 20 & derece; 3 ay veya daha uzun süre saklama için C |
| Mikrodalga | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Anında doku yapıştırıcısı |
| Mekanik deklanşörsüz CCD çipli kamera | Hamamatsu | C4742-95 | |
| Yüksek hızlı renkli kamera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Kamera yazılımı | Moleküler Cihazlar | MetaMorph sürüm 7.7.0.0 | |
| Hayal analizi | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Mikro Kapaklı Gözlükler, Kare, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Kapak camları korozyona dayanıklıdır ve eşit kalınlıkta ve düzdür. 1 numaralı kalınlık 0,13 ila 0,17 mm'dir. |
| Buzlu Mikro Kızaklar, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan ambalaj | BRNDPM998 | |
| TX2 Filtre küpü | Leica | 11513851/11513885 | 560/40 bant geçiren Kongo kırmızısı analizi için kullanılan filtre. |
Kaynaklar
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
