Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.
Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.
Bitki hücre duvarı çeşitli bileşenlerine içinde bilgi bir bolluk tutar: lignin, selüloz, hemiselülozlar (ksilan, glucuronoxylan, ksiloglukan, arabinoksilan, karışık bağlantı glukan veya glukomannanı), ve pektin. Histolojik teknikler örgütsel ve hücresel düzeyde ikincil hücre duvarları içinde farklılıklarını inceleyerek önemli görsel ipuçları sağlar. Çeşitli histolojik teknikler geliştirilmiş ve literatürde bulunabilir, ama basit görsel talimatları ile çok detaylı protokoller nadiren hiç varsa, çünkü bu teknikler zor ve zaman alıcı yeni başlayanlar için olabilir. Bu çalışmanın amacı, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek histolojik boyama teknikleri için basit kurallar sağlamaktır.
Kök doku Kesit hücre duvarları ve hücre şekillerde görselleştirilmesi ilk adımdır. El-cut bölümler ucuz ve hazırlamak için daha az zaman alacak olsa da, bir vibratom kullanımı tutarlılığı sunar veyüksek kaliteli görüntü verir. Bir vibratome kullanarak keskin görüntüler üretmek için yardımcı olur ve önemli ölçüde sadece kötü bir örnek hazırlama neden olacağını numuneler arasındaki yanlış farklılıkları üretme riskini azaltır, aynı kalınlıkta, hatta bölümleri üreterek daha iyi veri kalitesini üreten sağlar. Taze örnekleri düzeltmek için reçineler kullanılarak yeni başlayanlar için zor olabilir ve bir şekilde analiz yapılması gerektiğinde hala bile uzmanlar için zaman alıcı olabilir. Buna ek olarak, bir reçine içine gömülü olduğu zaman numunenin herhangi bir biyolojik aktivitesini ölçmek mümkün olur. Agaroz ve ev yapımı bir kalıp kullanır Basit bir tekniktir kök dokuları gömmek için yararlı olduğunu ve aynı zamanda yumuşak dokuların diseksiyonu gerektiren uygulamalarda kullanılabilir. Reçine içinde gömme örnekleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, canlı dokuları tutmak ve örnek manipülasyon azaltma avantajına sahiptir. Bir vibratom yoluyla dokulara Kesit derece hassas ve homojen üretirÇalışmanın amacına bağlı olarak, daha sonra çeşitli boyama teknikleri ile kullanılabilir, lı bölümleri.
Lignin ve diğer aromatik maddelerin görselleştirmek için en basit yöntem, ultraviyole (UV) ışık kullanır. UV ışığı ile aromat bazlı moleküllerin uyarma eski bir tekniktir, ancak yine de lignin görüntülenmesi için hızlı yaklaşımlardan biridir. UV ışık diğer aromatikleri heyecanlandıracak Ancak, UV görselleştirme aslında lignin tespiti için ideal değildir. 1-3: Lignin esas olarak üç yapı, monolinyollere (koniferil alkol, sinapil alkol ve p-kumaril alkol hydroxycinnamyl alkolleri) oluşur. Phloroglucinol leke ksilem, lif, ve trakea dokularda 4 mevcut sinamaldehitler'in ölçüde ipuçları sağlayabilir. Phloroglucinol genel sinamaldehitler'in iyi bir göstergesi olduğunu ve sinamaldehitler'in ve diğer aromatik ayırt edebilirsiniz. Sinapil alkol monomerler algılanabilirve Maule leke kullanılmasıyla ayrılır. Toluidin mavisi O çok renkli bir boya ve bu nedenle farklı renklerde 5,6 hücre duvarının farklı unsurları leke yeteneğine sahiptir. Toluidin mavi O birincil kullanımı pektin ve lignin 5,6 tespit etmektir. Toluidin mavi O kullanmanın avantajı, hücre duvarının birçok unsuru tek bir aşamada görselleştirilebilir olmasıdır. Beyaz Kalkofluor ve Kongo Kırmızı hem de çalışmak için kolay ve selüloz görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz, ve diğer non-değiştirmiş veya zayıf ikame β-Glukan 6-9, kongo kırmızı lekeler, doğrudan özellikle 10,11-β (1 → 4)-Glukan ve selüloz oysa. Bu çalışmanın amacı A. yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yukarıda belirtilen boyama tekniklerinin kullanımı için basit kuralları sağlamaktır thaliana kaynaklanıyor.
A. thaliana sap bölümleri yaygın olarak sekonder hücre duvarındaki hücre organizasyonunu incelemek ve niteliksel olarak vahşi tip ve transjenik bitkiler arasındaki farklılıkları incelemek için kullanılır. Örneklerin kesit için yaygın olarak kullanılan teknikler doğrudan el kesme vardır; numuneleri agaroz veya sabitleyici gömülü olduğunda ya da kesit bir vibratome veya mikrotom ile yapılabilir. Helisli aksine, sadece son iki numune ve düzgün olmayan yüzeyler arasında kalınlık farkl…
The authors have nothing to disclose.
Biz düzenleme yardım için Sabin Russell müteşekkiriz. Bu çalışma (http://www.jbei.org) ABD Enerji Bölümü, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, Ofisi tarafından desteklenen DOE Ortak Biyoenerji Enstitüsü parçası oldu Lawrence Berkeley arasındaki sözleşme DE-AC02-05CH11231 yoluyla Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı.
Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
Hydrochloric Acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ] |
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml) | VWR | 16466-044 | |
Microcentrifuge Tubes (0.6ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer storage |
Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
Micro Cover Glasses, Square, No.1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm. |
Frosted Micro Slides, 1mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm- 1mm |
TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 |