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Biology

के histochemical धुंधला Published: May 13, 2014 doi: 10.3791/51381
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Introduction

संयंत्र सेल दीवार उसके विभिन्न घटकों के भीतर जानकारी के ढेर सारे रखती है: लिग्निन, सेल्यूलोज, hemicelluloses (xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, मिश्रित उठाना glucan, या Glucomannan), और पेक्टिन. Histological तकनीक संगठनात्मक और सेलुलर स्तर पर माध्यमिक सेल दीवारों के भीतर मतभेद का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण दृश्य cues प्रदान करते हैं. विभिन्न ऊतकीय तकनीक विकसित किए गए और साहित्य में पाया जा सकता है, लेकिन साधारण दृश्य के निर्देश के साथ बहुत विस्तृत प्रोटोकॉल शायद ही कभी कभी यदि उपलब्ध हो रहे हैं क्योंकि इन तकनीकों का चुनौतीपूर्ण और समय लेने के लिए शुरुआती किया जा सकता है. इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए ऊतकीय धुंधला तकनीक के लिए सरल दिशा निर्देश प्रदान करना है.

स्टेम ऊतकों सेक्शनिंग सेल दीवारों और सेल आकार के दृश्य में पहला कदम है. हाथ कट वर्गों सस्ती कर रहे हैं और तैयार करने के लिए कम समय लगेगा हालांकि, एक vibratome का उपयोग स्थिरता प्रदान करता है औरउच्च गुणवत्ता के चित्र पैदावार. एक vibratome का उपयोग तेज छवियों का उत्पादन करने में मदद करता है और काफी बस एक बुरा नमूना तैयार करने की वजह से हो जाएगा कि नमूनों के बीच गलत मतभेद उत्पादन के जोखिम को कम कर देता है जो एक ही मोटाई के साथ भी वर्गों उत्पन्न करके बेहतर डेटा गुणवत्ता के उत्पादन की अनुमति देता है. ताजा नमूनों को ठीक करने के लिए रेजिन का प्रयोग शुरुआती के लिए एक चुनौती हो सकती है और एक विश्लेषण जल्दी से किया जाना चाहिए जब अभी भी विशेषज्ञों के लिए समय लेने वाली हो सकती है. इसके अलावा, यह यह एक राल में एम्बेडेड किया गया है जब नमूना के साथ किसी भी जैविक गतिविधि को मापने के लिए असंभव हो जाता है. Agarose और एक घर का बना ढालना है कि रोजगार एक सरल तकनीक स्टेम ऊतकों एम्बेड करने के लिए उपयोगी है, और यह भी नरम ऊतकों के विच्छेदन की आवश्यकता होती है अन्य अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है. राल में नमूनों को एम्बेड की तुलना में, इस विधि जीवित ऊतकों रखने और नमूना हेरफेर को कम करने का लाभ दिया है. एक vibratome के माध्यम से ऊतकों सेक्शनिंग बहुत सटीक है और homogen उत्पन्नअध्ययन के लक्ष्य पर निर्भर करता है, तो कई अलग धुंधला तकनीक के साथ प्रयोग किया जा सकता है, ous वर्गों,.

लिग्निन और अन्य aromatics कल्पना करने के लिए सरल तरीकों में पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश को रोजगार. पराबैंगनी प्रकाश से सुरभित आधारित अणुओं की उत्तेजना एक पुरानी तकनीक है, लेकिन यह अभी भी लिग्निन के दृश्य के लिए तेज तरीकों में से एक है. यूवी प्रकाश अन्य aromatics उत्तेजित होगा क्योंकि हालांकि, यूवी दृश्य वास्तव में लिग्निन का पता लगाने के लिए आदर्श नहीं है. 1-3: लिग्निन मुख्य रूप से तीन ब्लॉकों का निर्माण, monolignols (coniferyl शराब, sinapyl शराब, और पी coumaryl शराब hydroxycinnamyl एल्कोहल) से बना है. Phloroglucinol दाग जाइलम, फाइबर, और सांस की नली ऊतकों 4 में मौजूद cinnamaldehydes की हद तक सुराग दे सकता है. Phloroglucinol जनरल cinnamaldehydes का एक अच्छा संकेत है और cinnamaldehydes और अन्य aromatics के बीच अंतर कर सकते हैं. sinapyl शराब monomers पता लगाया जा सकता हैऔर मौल दाग के उपयोग से भेदभाव. Toluidine नीले हे एक पोलीक्रोमेटिक डाई है और इसलिए अलग अलग रंग 5,6 में सेल की दीवार के विभिन्न तत्वों दाग करने की क्षमता है. toluidine नीला हे की प्राथमिक उपयोग पेक्टिन और लिग्निन 5,6 पता लगाने के लिए है. toluidine नीले o के प्रयोग के लाभ सेल दीवार के कई तत्व एक भी कदम में देखे जा सकते हैं. सफेद calcofluor और कांगो लाल दोनों के साथ काम करने के लिए आसान कर रहे हैं और सेल्यूलोज कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Calcofluor सफेद दाग सेल्यूलोज, callose, और अन्य गैर एवजी या दुर्बलता से प्रतिस्थापित β-glucans 6-9, कांगो लाल दाग सीधे विशेष रूप से 10,11-β (1 → 4) glucans और सेलूलोज़ करने के लिए, जबकि. इस अध्ययन का लक्ष्य ए से उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए aforementioned धुंधला तकनीक के उपयोग के लिए सरल दिशा निर्देश प्रदान करने के लिए है thaliana उपजा है.

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Protocol

1. एम्बेडिंग स्टेम

  1. पानी में एक 7% agarose समाधान (पानी आसुत 100 मिलीलीटर में वैद्युतकणसंचलन ग्रेड agarose की 7 ग्राम) बनाते हैं. 20 मिनट के लिए autoclaving द्वारा या सबसे कम तीव्रता (एक 1250 वाट माइक्रोवेव के जैसे, 10% तीव्रता) पर 20 मिनट के लिए microwaving द्वारा agarose भंग.
  2. प्लास्टिक की शीशियों का उपयोग उपजी एम्बेड करने के लिए एक घर का बना ढालना तैयार करें.
    1. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, एक 2 मिलीलीटर पेंच टोपी microcentrifuge ट्यूब (भाग एक) के शंक्वाकार नीचे काट दिया. एक सिरिंज सुई के साथ, एम्बेड करने के लिए स्टेम के व्यास से थोड़ा बड़ा ट्यूब टोपी में एक छेद पंचर. इसके बाद, एक 0.6 एमएल microcentrifuge ट्यूब (पार्ट बी) के नीचे बंद 0.5 सेमी काटा.
    2. Precut 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 0.6 एमएल microcentrifuge ट्यूब की कट ऑफ में 0.5 सेमी हिस्से जोड़ें. Parafilm (चित्रा 1) का उपयोग करते हुए दो भागों सील. नोट: ट्यूब के नीचे agarose जम गया है के बाद एम्बेडेड नमूना को हटाने की सुविधा के लिए काट रहा है. टीवह टोपी में छेद स्टेम agarose में एम्बेडेड है जब स्टेम स्थिर रखने में सहायता करेगा. ढालना agarose पकड़ और embedding जब स्टेम सीधे पकड़ की सेवा करेंगे. Agarose सेट है और स्टेम एम्बेडेड है जब तक Parafilm, दो भागों, ए और बी का आयोजन करेगा.
    3. एक रेजर ब्लेड का उपयोग करना, ब्याज की क्षेत्र (प्रथम स्टेम Internode के उदाहरण मध्य) से एक स्टेम अनुभाग में कटौती. नोट: आदर्श रूप में, स्टेम सिर्फ निर्जलीकरण द्वारा विनाश से बचने के लिए एम्बेड करने से पहले कटौती की जानी चाहिए. वैकल्पिक रूप से, स्टेम अस्थायी रूप से पानी से गीला एक फिल्टर पेपर युक्त एक थाली में संग्रहित किया जा सकता है. इस थाली ऊतक निर्जलीकरण और विरूपण को रोकने के लिए एम्बेड करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर रखा जा सकता है. उच्च नमी के बिना 30 मिनट से अधिक लंबी अवधि के लिए स्टेम भंडारण के स्टेम बाहर सुखाने के लिए कारण होगा.
  3. कम तीव्रता पर माइक्रोवेव में agarose पिघला. चेतावनी: agarose युक्त बोतल गर्म हो सकता है. बोतल लेने के लिए एक प्रकार का दस्ताना प्रयोग करें. पिघल agarose चलो(20 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस के बीच) कमरे के तापमान पर tand यह लगभग 50 डिग्री सेल्सियस के ठंडा जब तक
  4. धीरे शीशी भरने के लिए premade प्लास्टिक मोल्ड में agarose के 5 एमएल पिपेट. नोट: सुनिश्चित करें कि नए नए साँचे में कोई हवाई बुलबुले हैं. एयर बुलबुले agarose मोल्ड में अंतराल का कारण होगा और पूरी तरह से अंततः नमूना वर्गों के असमान काटने को बढ़ावा मिलेगा जो स्टेम नमूना, कवर नहीं करेंगे.
    1. Agarose semisolid बनने के लिए 30 से 60 सेकंड के लिए शांत हो जाओ. यह घुसना और agarose में, नाव खड़े हो जाओ, लेकिन नहीं कर सकते हैं, यकीन है कि एक छोटे से दंर्तखोदनी के साथ परीक्षण. नोट: agarose यह सेल आकारिकी को नष्ट करने, स्टेम shriveling से नमूना नुकसान होगा अभी भी गर्म है जब स्टेम रखा जाता है.
    2. इस agarose से भरे शीशी में स्टेम रखें. स्टेम सीधे रहता है कि सुनिश्चित करें. स्टेम की नोक टोपी द्वारा आयोजित किया जाता है कि इस तरह से छेदा टोपी रखें. पेंच पर टोपी बारी मत करो. कुछ समय (एक प्रकार) एक स्टेम से अधिक embe हो सकता हैएक एकल शीशी में dded; लेकिन उस विशेष मामले में, टोपी का प्रयोग नहीं करते. नोट: पेंच पर टोपी कर दिया जाता है, स्टेम मुड़ मिल जाएगा.
  5. यह solidifies, जब तक 10-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर शीशी छोड़ दें.
  6. धीरे ट्यूब से बाहर फिसलने से मोल्ड निकालें. Parafilm खोलें. एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर भाग एक से जम agarose जारी करने के लिए अंगूठे के साथ धीरे मोल्ड के भाग ख के नीचे पुश.
  7. लंबाई में 1.2 सेमी की तीन लगभग बराबर टुकड़ों में agarose एम्बेडेड स्टेम काटें. Agarose में नहीं था और इसे त्यागने कि स्टेम का हिस्सा काट दिया.
    1. एम्बेडेड साथ agarose के इन टुकड़ों स्टोर वायुरोधी में अनुभाग के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक काले बॉक्स में 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों उपजा है. वैकल्पिक रूप से, एक सप्ताह की एक अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब की दुकान. नोट: भंडारण संभव है, लेकिन प्रयोगकर्ता एम्बेडेड उपजी अभी भी जीवित हैं और प्रयोग के आधार पर उस बारे में पता करने की जरूरत है, कलाकृतियों संभावित पेश किया जा सकता है.

2. सेक्शनिंग स्टेम

  1. चेतावनी: ध्यान से vibratome मैनुअल पढ़ें और सभी सुरक्षा निर्देशों का पालन करें.
  2. नमूना डिस्क (कोई ठोस या तरल से मुक्त) स्वच्छ और पूरी तरह से सूखा है सुनिश्चित करें. पूर्व प्रयोगों से किसी भी अवशिष्ट गोंद हटाने और पानी से धोने के लिए एक धार के साथ नमूना डिस्क साफ करें. फिर एक कागज तौलिया के साथ सूखी. नोट: यह चिपकने वाला अच्छी तरह से काम करता है और agarose नमूना को बांधता है कि यह सुनिश्चित करेंगे. यह कदम ठीक से नहीं किया जाता है, तो यह नमूना डिस्क का पालन नहीं कर सकते हैं और बाद में नमूना सेक्शनिंग के दौरान डिस्क गिर करने के लिए कारण होगा कि संभव है.
    1. प्रयोग मुलायम कागज नमूनों युक्त agarose ब्लॉक से किसी भी नमी को दूर करने के लिए पोंछे.
    2. नमूना डिस्क पर ऊतक चिपकने की एक छोटी सी बूंद रखें. स्ट्रीक चिपकने वाला बोतल के टिप का उपयोग कर थाली के बीच में क्षेत्र को कवर करने के लिए चिपकने वाला बाहर. जल्दी जगहagarose ब्लॉक नमूनों को सीधा या क्रमशः आड़ा या अनुदैर्ध्य वर्गों, के लिए थाली के साथ समानांतर में या तो कर रहे हैं. चिपकने वाला 10-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना डिस्क के लिए नमूना ठीक करने की अनुमति दें. नोट: यह एक समय के प्रति संवेदनशील कदम है.
  3. बफर ट्रे या गर्त पर जगह में नमूना डिस्क को ठीक करें. वर्गों के साथ agarose के ब्लॉक / एस धार के साथ समानांतर में होना चाहिए. नमूने पूरी तरह से डूबे हुए हैं जब तक कमरे के तापमान पर आसुत जल के साथ बफर ट्रे भरें.
  4. आधे में एक रेजर ब्लेड कटौती और फिर ब्लेड पूरी तरह से फ्लैट रहता है, ताकि एक मजबूत कैंची के साथ समाप्त होता है ट्रिम. चाकू धारक पर precut रेजर ब्लेड का आधा देते हैं.
    1. 84 ° करने के लिए चाकू धारक पर कोण सेट, 50 हर्ट्ज (vibratome पर स्थिति 5) को 0.90 / सेक मिमी (vibratome पर स्थिति 8) और आवृत्ति को गति. 100 माइक्रोन मोटाई के वर्गों में कटौती. सतत मोड का प्रयोग करें. कोईते: यह मोटाई ऊतक धुंधला प्रोटोकॉल में से कुछ में इस्तेमाल किया विभिन्न एसिड और आधार उपचार सामना कर सकते हैं विश्वास दिलाता हूं कि चयनित किया गया था. सेक्शनिंग के लिए खिड़की सेट और खंड लगभग 1.2 सेमी की एक agarose ब्लॉक करने vibratome के लिए एक सतत मोड पर 15-20 मिनट की अनुमति है.
  5. बफर ट्रे में सेक्शनिंग दौरान एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर वर्गों लीजिए. वैकल्पिक रूप से, वर्गों एक गिलास बीकर में बफर ट्रे से तबादला और फिर एक स्पष्ट पेट्री थाली करने के लिए किया जा सकता है. 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूबों के कुछ वर्गों स्थानांतरण. नोट: नमूनों यह एक स्पष्ट पृष्ठभूमि पर वर्गों को देखने के लिए आसान है क्योंकि एक पेट्री थाली से एकत्र कर रहे हैं, और बफर ट्रे अगले नमूना के लिए primed किया जा सकता है.
  6. वर्गों में 30 से 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में संग्रहीत या एकत्र की है और 1.5 से 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में संग्रहित किया जा सकता है. नोट: लंबी अवधि के लिए वर्गों भंडारण गरीब छवि गुणवत्ता में परिणाम होगा.

    इमेजिंग के लिए 3. माइक्रोस्कोप और कैमरा सेटिंग

    1. माइक्रोस्कोप पर कोहलर रोशनी को समायोजित करें. एक उद्देश्य चुनें. पहला नमूना पर ध्यान दें. एक आधा या कम करने के लिए प्रकाश की तीव्रता लाने के लिए. क्षेत्र डायाफ्राम (एफडी) और एपर्चर (एपी) बंद या उस विशेष उद्देश्य पर सबसे कम संभव सेटिंग पर ले आएं.
      1. बढ़ाई उच्च, बड़ा अंगूठी होगा. के रूप में तेजी से संभव के रूप में क्षेत्र आईरिस ध्यान केंद्रित करने के कंडेनसर ध्यान केंद्रित घुंडी का प्रयोग करें.
      2. धीरे धीरे कंडेनसर-एकत्रित knobs (कंडेनसर आसपास पिन के आकार का शिकंजा) का उपयोग करते हुए केन्द्र को क्षेत्र आईरिस (षट्भुज के आकार छोटे अंगूठी) की छवि को ले आओ. धीरे धीरे क्षेत्र आईरिस किनारे तक पहुँच जाता है कि डायाफ्राम (एफडी) इस प्रकार की वृद्धि. क्षेत्र आईरिस बढ़त बीत चुका है बस के बाद एफडी बढ़ती बंद करो.
      3. धीरे धीरे विपरीत समायोजित करने के एपर्चर (एपी) में वृद्धि. आवश्यकता के रूप में प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करें. नोट: कोहलर रोशनी हर ओ के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हैbjective, हर प्रयोगात्मक दिन. दिन के लिए समायोजन के बाद प्राप्त संख्या नोट. ये संख्या उद्देश्यों को उस विशेष दिन के लिए आगे और पीछे बंद कर रहे हैं कि हर बार reused किया जाएगा.
    2. एपर्चर, तीव्रता, समय जोखिम, लाभ, और तालिका 1 में वर्णित के रूप में फिल्टर को समायोजित करें. यह जानकारी एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    3. प्रतिदीप्ति छवियों पर कब्जा करने के लिए कोई यांत्रिक शटर के साथ एक बड़े प्रारूप अस्तर सीसीडी चिप के साथ एक उच्च संकल्प डिजिटल कैमरा का उपयोग करें; और उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के लिए एक उच्च संकल्प, उच्च गति कैमरा.
    4. मानक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्लाइड प्रक्रिया. सॉफ्टवेयर लोड. "प्राप्त" और क्लिक करें "सेट कैमरा / बोर्ड," फिर से इस्तेमाल किया जा करने के लिए कैमरे का चयन करें. "ठीक है." क्लिक के बाद "मोल" क्लिक "रंग टैब." के तहत "रंग टैब," चुन "बायर विधि" के बाद "औसतन चार." का सुझाव दिया लाभ (लाल, हरा, नीला) fro जोड़ेंएम तालिका 1. "सेट को बचाने के" टैब का चयन करें और छवियों को संग्रहीत करने के लिए कर रहे हैं जहां निर्देशिका पर क्लिक करें. तालिका 1 में सुझाव से "एक्सपोज़र समय" निर्धारित करें. "1" में "Binning" सेट और "लाइव binning" हित के क्षेत्र पर "1." फोकस में और फिर क्लिक करें "लाइव बचाओ."
    5. कैमरा सॉफ्टवेयर पर उत्पादन छवियों "TIF" प्रारूप में हैं. सेल प्रकार की ऊतकरसायनविज्ञान के लिए छवियों का विश्लेषण. प्रस्तुति और प्रकाशन के बहाव के उपयोग के लिए मानक कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.

    4. पराबैंगनी और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग

    1. वर्गों आसानी से बाहर pipetted किया जा सकता है, ताकि पिपेट टिप कटौती के साथ एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें. धीरे पिपेट वर्गों टिप में और एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर. एक कवर पर्ची के साथ वर्गों को कवर किया. यूवी प्रकाश या उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश व्यवस्था के तहत वर्गों को ध्यान से देखें.

    5. Phloroglucinol-एचसीएल (विएस्नेर) धुंधला 12

    1. एक 3% phloroglucinol समाधान तैयार करने के लिए 10 मिलीलीटर निरपेक्ष इथेनॉल में phloroglucinol की 0.3 ग्राम भंग. इथेनॉल में 3% phloroglucinol के दो संस्करणों के लिए केंद्रित एचसीएल (37 एन) के एक मात्रा मिलाई; इस समाधान phloroglucinol-एचसीएल (पीएचडी-एचसीएल) या विएस्नेर दाग है. नोट: इस समाधान समाधान समय पर नीचा दिखाना होगा और धुंधला अप्रभावी हो जाएगा क्योंकि, धुंधला के दिन पर ताजा किए जाने के लिए और संग्रहीत नहीं किया जा सकता है. चेतावनी: एचसीएल उच्च संक्षारक है, तो Ph-एचसीएल दाग से निपटने जबकि अत्यधिक सावधानी का उपयोग करें.
    2. एक 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्टेम वर्गों स्थानांतरण. वर्गों युक्त ट्यूब पीएच-एचसीएल समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और पीएच-एचसीएल दाग में एचसीएल उच्च संक्षारक है क्योंकि इसे तुरंत टोपी. धीरे सभी वर्गों दाग रहे हैं विश्वास दिलाता हूं कि ट्यूब चाल है. इस कदम के लिए एक वैकल्पिक Ph-एचसीएल समाधान ऊपर और नीचे pipetted किया जा सकता है, ताकि अधिमानतः सेकंड परेशान बिना, खुला ट्यूब टोपी रखने के लिए हैमाहौल. नोट: यह उन वर्गों नुकसान हो सकता है, पिपेट टिप में वर्गों पिपेट के प्रति सावधान रहें.
      1. वर्गों क्षति के बिना आसानी से बाहर pipetted किया जा सकता है कि इस तरह से पिपेट टिप कटौती के साथ एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें. धीरे टिप में और एक खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों पिपेट. कवर पर्ची के साथ वर्गों को कवर किया. उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश व्यवस्था के तहत वर्गों को ध्यान से देखें. नोट: Ph-एचसीएल समाधान नमूनों की गिरावट के कारण, 5-10 मिनट में सूख जाता है. इसलिए, इमेजिंग समय की अवधि के भीतर पूरा किया जाना है.

    6. मौल धुंधला 13,14

    1. एक 0.5% पोटेशियम परमैंगनेट के घोल तैयार करने के लिए 40 मिलीलीटर आसुत पानी में पोटेशियम परमैंगनेट की 0.2 ग्राम भंग. 7 दिनों की एक अधिकतम के लिए कमरे के तापमान पर एक अंधेरे बोतल में स्टोर.
      1. 9 मिलीलीटर आसुत जल (1:10) 1 एमएल केंद्रित एचसीएल (37 एन) जोड़कर एक 3.7% एचसीएल समाधान तैयार करें. पर एक ताजा 3.7% एचसीएल समाधान तैयारप्रयोग के दिन. उपयोग की जा रही 37 उत्तर एचसीएल शेयर समाधान बहुत पुराना नहीं है कि सुनिश्चित करें. केंद्रित अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (14.8 एम) को कम से संतृप्त समाधान के molarity को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए.
    2. एक 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्टेम वर्गों स्थानांतरण. वर्गों युक्त ट्यूब को 0.5% पोटेशियम परमैंगनेट समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
      1. अधिमानतः वर्गों को परेशान किए बिना, धीरे से ऊपर और नीचे 0.5% पोटेशियम परमैंगनेट समाधान पिपेट. 2 मिनट के लिए सेते हैं और pipetting दोहराएँ. सभी वर्गों बसने तक microcentrifuge ट्यूब खड़े करते हैं. नोट: वर्गों क्षतिग्रस्त हो सकता है के रूप में पिपेट टिप में वर्गों पिपेट के प्रति सावधान रहें. यह समाधान अंधेरा है के रूप में स्टेम वर्गों देखना है, तो टेस्ट ट्यूब रैक पर वर्गों के साथ ट्यूब रखने और उन्हें 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए मुश्किल हो सकता है.
      2. एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग, 0.5% पोटेशियम परमैंगनेट समाधान के 700 μl बाहर निकालना.पोटेशियम परमैंगनेट समाधान बाहर कुल्ला करने के लिए आसुत जल के 700 μl जोड़ें. पानी के घोल स्पष्ट रहता है जब तक 3-4x दोहराने या.
      3. पानी त्यागें. गहरे भूरे रंग वर्गों से छुट्टी दे दी है जब तक जल्दी से 3% एचसीएल के 1 मिलीलीटर जोड़ें. यह 3-5 मिनट के भीतर हो सकता है या 5 मिनट प्रत्येक के 2 washes आवश्यकता हो सकती है. सभी 3% एचसीएल समाधान बाहर पिपेट और तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ें.
      4. केंद्रित अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. वर्गों क्षति के बिना आसानी से बाहर pipetted किया जा सकता है कि इस तरह से टिप कटौती के साथ एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें. धीरे टिप में और एक खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों पिपेट. एक coverslip के साथ वर्गों को कवर किया. उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश व्यवस्था के तहत वर्गों को ध्यान से देखें. चेतावनी: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड बेहद संक्षारक है, क्योंकि यह माइक्रोस्कोप या लेंस के चरण के लिए जंग के कारण से बचने के लिए अतिरिक्त देखभाल और ध्यान देने की आवश्यकता है. नोट: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड धुएं यह मुश्किल नमूना निरीक्षण करने के लिए कर रही है, coverslip कोहरे सकते हैं. इसलिए coverslip जोड़ने से पहले अतिरिक्त सावधान रहना होगा. समाधान 5-10 मिनट में सूख जाता है, तो इमेजिंग समय की अवधि के भीतर पूरा किया जाना है.

    7. कांगो लाल धुंधला 11,15

    1. एक 0.5% कांगो लाल समाधान तैयार करने के लिए आसुत पानी की 100 मिलीलीटर में लाल कांगो 0.5 ग्राम भंग.
    2. एक 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्टेम वर्गों स्थानांतरण. ट्यूब को 0.5% कांगो लाल समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे 0.5% कांगो लाल समाधान पिपेट और नीचे वर्गों परेशान बिना. नोट: इस वर्गों को नुकसान हो सकता पिपेट टिप में वर्गों पिपेट के प्रति सावधान रहें.
      1. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं और pipetting दोहराएँ. कमरे के तापमान पर ऊष्मायन के एक और 3 मिनट के साथ पालन करें.
      2. 0.5% कांगो लाल समाधान के 700 μl बाहर आकर्षित करने के लिए एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें. कांगो लाल समाधान बाहर कुल्ला करने के लिए आसुत जल के 700 μl जोड़ें. धोने के समाधान तक धोने 3-4x दोहराएँस्पष्ट है.
      3. वर्गों क्षति के बिना आसानी से बाहर pipetted किया जा सकता है कि इस तरह से इसकी टिप कटौती के साथ एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें. धीरे टिप में और एक खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों पिपेट, और coverslip के साथ कवर. 560/40 के एक bandpass के साथ एक फिल्टर का उपयोग नीली बत्ती उत्तेजना के तहत खुर्दबीन स्लाइड पर नमूनों का निरीक्षण करें. नोट: पानी में 10-30 मिनट में कांगो लाल बाहर धोने के रूप में, पूर्व सूक्ष्म विश्लेषण करने के लिए लंबे समय के लिए पानी में वर्गों की दुकान नहीं है.

    8. Calcofluor सफेद धुंधला 9

    1. एक 0.2% शेयर समाधान तैयार करने के लिए पानी आसुत 10 मिलीलीटर में (सफेद M2R calcofluor) फ्लोरोसेंट brightener 28 की 0.02 ग्राम भंग. 0.2% समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे बोतल में छह महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है आसुत जल के साथ 0.2% शेयर समाधान 10x गिराए 0.02% की एक काम समाधान तैयार करें.
    2. एक 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्टेम वर्गों स्थानांतरण. 0.02% calcof की ट्यूब 1 मिलीलीटर जोड़ेंluor सफेद समाधान. धीरे से ऊपर और नीचे 0.02% calcofluor सफेद समाधान पिपेट. नोट: इस वर्गों को नुकसान हो सकता पिपेट टिप में वर्गों पिपेट के प्रति सावधान रहें.
      1. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं और pipetting दोहराएँ. कमरे के तापमान पर एक और 3 मिनट के लिए खंड सेते हैं. नोट: वर्गों के लिए यह आसान वर्गों को नुकसान पहुँचाए बिना समाधान बाहर पिपेट को बनाने के लिए ट्यूब के तल पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
      2. 0.02% calcofluor सफेद समाधान के 700 μl बाहर निकालना और आसुत जल के 700 μl जोड़ने के लिए एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें; 5 मिनट calcofluor सफेद समाधान बाहर कुल्ला करने के लिए प्रतीक्षा करें. धोने 3-4x दोहराएँ. वर्गों क्षति के बिना आसानी से बाहर pipetted किया जा सकता है कि इस तरह के तरीके के रूप में पिपेट टिप कटौती के साथ एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें.
      3. धीरे टिप में और एक खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों पिपेट और एक coverslip के साथ कवर. पराबैंगनी प्रकाश के तहत वर्गों को ध्यान से देखें.

    9. Toluidine Bluई ओ धुंधला 16,17

    1. एक 0.02% समाधान तैयार करने के लिए 100 मिलीलीटर आसुत जल में 0.02 जी toluidine नीला हे भंग. नोट: toluidine नीला हे समाधान कमरे के तापमान पर एक अंधेरे बोतल में दो सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है.
    2. एक 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्टेम वर्गों स्थानांतरण. ट्यूब को 0.02% toluidine नीला हे समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे 0.02% toluidine नीला हे समाधान पिपेट. फिर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं और एक बार pipetting दोहराएँ. नोट: इस वर्गों को नुकसान हो सकता पिपेट टिप में वर्गों पिपेट के प्रति सावधान रहें. वर्गों बसने तक microcentrifuge ट्यूब अभी भी खड़े हैं. यह समाधान अंधेरा है, के रूप में देखते हैं, तो टेस्ट ट्यूब रैक पर वर्गों युक्त ट्यूब रखने और उन्हें कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए मुश्किल हो सकता है.
      1. 0.02% toluidine नीला हे समाधान के 700 μl बाहर आकर्षित करने के लिए एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें. Toluidine नीला हे प बाहर कुल्ला करने के लिए आसुत जल के 700 μl जोड़ेंution. 3-4x दोहराने या धोने समाधान जब तक स्पष्ट है. वर्गों नुकसान पहुँचाए बिना उन्हें आसानी से बाहर pipetted किया जा सकता है कि इस तरह से पिपेट टिप कटौती के साथ एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें.
      2. धीरे टिप में और एक खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों पिपेट और एक coverslip के साथ कवर. उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश व्यवस्था के तहत वर्गों को ध्यान से देखें.

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Representative Results

एम्बेड और सेक्शनिंग स्टेम:
एम्बेड करने के लिए घर का बना प्लास्टिक मोल्ड के उपयोग agarose तेज और आसान चित्रा (1) साबित हुई 7% में उगता है. दो भागों (ए और बी, चित्रा 1) एम्बेडेड शीशी प्रणाली की यह सरल आसानी से साफ प्रणाली रखने, agarose निष्क्रिय हैं कि शीशी भागों के लिए छड़ी नहीं है के रूप में agarose में एम्बेडेड स्टेम जारी करने के लिए बनाते हैं. शीशियों साल के लिए कई बार reused किया जा सकता है. एम्बेडेड स्टेम भंडारण की सुविधा भी अगले कदम आसान बना देता है. कुछ देर एम्बेडेड समान को बचाने के क्रम में उपजी सेक्शनिंग के लिए एक एकल सेक्शनिंग प्लेट पर (3 तक) बांटा जा सकता है.

यूवी के तहत एरोमैटिक्स का अवलोकन:
स्टेम वर्गों गिलास स्लाइड पर आसुत जल में बढ़ रहे हैं और पराबैंगनी प्रकाश के तहत मनाया गया. कोशिकाओं में लिग्निन सहित सुरभित यौगिकों, पराबैंगनी प्रकाश के तहत उनके autofluorescence से देखे जा सकते हैं. जाइलम (XY) और इंटरफैसिकुलर फाइबर Fi ()लिग्निन, एक खुशबूदार बहुलक, माध्यमिक सेल दीवार biosynthesis के दौरान जमा किया जाता है, क्योंकि मज्जा (Pi) और प्रांतस्था या epidermis (ईपी) (चित्रा 2) में यूवी रोशनी के तहत नहीं बल्कि autofluorescence दिखाया. पौधों उनके रिक्तिकाएं (जैसे, anthocyanin) में aromatics के महत्वपूर्ण मात्रा में जमा जब कुछ उदाहरणों में, प्रतिदीप्ति cortical कोशिकाओं (नहीं दिखाया डेटा) में देखा जा सकता है. स्टेम पार वर्गों 5X, 10X, 20X के तहत विश्लेषण किया गया, और 40x बढ़ाई (चित्रा 2 पैनलों ए, बी, सी और डी - क्रमशः ई,) बेहतर स्टेम भर में सेल दीवार खुशबूदार वितरण कल्पना करने के लिए.

Phloroglucinol और मौल दाग के साथ दाग स्टेम धारा में Lignin का अवलोकन:
जहाजों और फाइबर और इंटरफैसिकुलर फाइबर से बना जाइलम लिग्निन दाग (phloroglucinol और मौल से दाग रहे थे कि स्टेम के ही तत्वों थे) एक जंगली प्रकार स्टेम अनुभाग नमूना का उपयोग. Phloroglucinol दाग एक गुलाबी या फूहड़ रंग 4 (चित्रा 3) देने के लिए लिग्निन के cinnamaldehyde अंत समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है. यूवी रोशनी के नीचे देखा के रूप में, एक फूहड़ रंगाई जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर में मनाया लेकिन मज्जा और प्रांतस्था या बाह्य त्वचा (चित्रा 3) में अनुपस्थित है. स्टेम पार वर्गों 5X, 10X, 20X के तहत विश्लेषण किया गया, और 40x बढ़ाई (चित्रा 3 पैनलों ए, बी, सी और डी - ई, क्रमशः) बेहतर स्टेम भर phloroglucinol दाग वितरण कल्पना और प्रमुख ऊतकों को अलग करने के लिए; जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर; मज्जा और प्रांतस्था; और एपिडर्मिस. आमतौर पर रंग की तीव्रता एक गुणात्मक ढंग से lignification के स्तर के साथ संबद्ध - विश्लेषण किया उत्परिवर्ती या ट्रांसजेनिक असामान्य cinnamaldehyde व्युत्पन्न इकाइयों (जैसे पाजी उत्परिवर्ती) में समृद्ध है जब सिवाय <> 14 समर्थन. मौल दाग जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर में syringyl लिग्निन इकाइयों का पता लगाने में विशिष्ट है. लाल रंगाई लिग्निन तत्वों में syringyl लिग्निन इकाइयों की उपस्थिति (चित्रा 4) 18 इंगित करता है. जाइलम जी इकाइयों में अधिक समृद्ध है, जबकि फाइबर एस लिग्निन के एक उच्च स्तर होते हैं पता चलता है कि जो जाइलम ऊतकों की तुलना में हालांकि, जब एक उज्जवल लाल रंगाई फाइबर में मनाया जाता है. Phloroglucinol धुंधला के बाद के रूप में मनाया, एक लाल रंगाई जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर में मनाया लेकिन मज्जा और प्रांतस्था या बाह्य त्वचा (चित्रा 4) में अनुपस्थित है. यह भी यूवी के तहत मनाया लिग्निन वितरण (चित्रा 2) के साथ संबद्ध और syringyl इकाइयों इस स्टेम नमूना के हर lignified ऊतकों में मौजूद हैं कि पता चलता है. स्टेम पार वर्गों 5X, 10X, 20X के तहत विश्लेषण किया, और 40x बढ़ाई (चित्रा 2 पैनलों ए, बी, सी, और थेडी - ई, क्रमशः) बेहतर स्टेम पार मौल दाग वितरण कल्पना और प्रमुख ऊतकों को अलग करने के लिए: जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर, मज्जा और प्रांतस्था, और एपिडर्मिस. यह राशि और lignified ऊतकों के बीच syringyl इकाइयों का वितरण स्टेम की उम्र के साथ बदलती हैं और एक युवा स्टेम (नहीं दिखाया डेटा) में अनुपस्थित हो सकता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है.

Calcofluor व्हाइट और कांगो लाल रंग के धब्बे के साथ दाग स्टेम अनुभागों का निरीक्षण:
Calcofluor सफेद दाग सेल्यूलोज, callose, और अन्य nonsubstituted या दुर्बलता से प्रतिस्थापित β-glucans; जबकि कांगो लाल दाग सीधे β-(1 → 4) glucans और विशेष रूप से सेलूलोज़ के लिए. Calcofluor सफेद के साथ दाग स्टेम वर्गों यूवी प्रकाश 6-9 के तहत मनाया गया. कांगो लाल दाग वर्गों 560/40 के एक bandpass के साथ एक फिल्टर का उपयोग नीली बत्ती उत्तेजना के तहत मनाया गया. दोनों सफेद calcofluor और कांगो एपिडर्मिस, प्रांतस्था, और मज्जा दाग लाल; धइन ऊतकों के सभी अपने सेल दीवारों में प्रमुख पोलीसेकेराइड बहुलक (चित्रा 5 और 6 चित्रा, क्रमशः) के रूप में सेल्यूलोज होते हैं क्योंकि है. इसके विपरीत जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर में बेहतर सफेद, कांगो लाल दाग polysaccharides calcofluor और कम करने के लिए लिग्निन की उपस्थिति (चित्रा 5 और 6 चित्रा) 10,11 से प्रभावित लगता है. क्रास सेक्शन 5X, 10X, 20X के तहत विश्लेषण किया गया है, और (6 पैनलों ए, बी, सी और डी, क्रमशः 5 आंकड़े के और) बेहतर स्टेम और प्रमुख भर में सफेद और कांगो लाल दाग वितरण calcofluor 40x बढ़ाई कल्पना करने के लिए स्टेम ऊतकों (जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर, मज्जा और प्रांतस्था, और एपिडर्मिस).

Toluidine ब्लू ओ के साथ दाग स्टेम अनुभागों का निरीक्षण:
यह विभिन्न रासायनिक अलग तरह से कोशिकाओं के घटकों और परिणामों में साथ प्रतिक्रिया करता है क्योंकि Toluidine नीले हे एक पोलीक्रोमेटिक डाई के रूप में वर्गीकृत किया जाता हैएक बहुरंगी नमूना (चित्रा 7). उत्पन्न रंग सेल और इसकी दीवारों की प्रकृति के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. Toluidine नीले हे नकारात्मक 5 समूहों आरोप लगाया कि बांध एक cationic रंजक है. इस डाई के एक जलीय घोल नीला है, लेकिन डाई सेल 6,9 में अलग anionic समूहों के साथ बांधता है जब अलग अलग रंग उत्पन्न कर रहे हैं. डाई ऐसे pectic एसिड के रूप में Carboxylated polysaccharides के साथ प्रतिक्रिया करता है जब उदाहरण के लिए, एक गुलाबी बैंगनी रंग दिखाई देगा; हरे, हरे, नीले, या ऐसे लिग्निन और टैनिन के रूप में पाली सुगन्धित पदार्थ के साथ चमकदार नीली; और थोड़ा बैंगनी या न्यूक्लिक एसिड के साथ हरा नीला. स्टेम पार वर्गों की Toluidine नीले हे जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर वे यूवी और पीएच-एचसीएल धुंधला टिप्पणियों (आंकड़े 2 के साथ समझौते में है जो एक हरे नीले या नीले रंग (चित्रा 7, पैनल सी), दिखाने के बाद lignified कर रहे हैं और पता चला है कि 3). इसके विपरीत, मज्जा और वे lignified नहीं हैं, वे अपने सेल दीवारों में कुछ पेक्टिन पॉलिमर होते हैं, क्योंकि प्रांतस्था और बाह्य त्वचा के ऊतकों हरे नीले या नीले रंग दिखा. स्टेम पार वर्गों 5X, 10X, 20X के तहत विश्लेषण किया गया, और 40x बढ़ाई (चित्रा 7 पैनलों ए, बी, सी और डी - ई, क्रमशः) बेहतर स्टेम भर Toluidine नीले हे दाग वितरण कल्पना करने के लिए और प्रमुख ऊतकों को अलग करने के लिए .

चित्रा 1
.. बाईं तरफ उपजी एम्बेड करने के लिए चित्रा 1 घर का बना मोल्ड; 2 मिलीलीटर पेंच टोपी microcentrifuge ट्यूब (भाग एक) और 0.6 एमएल microcentrifuge ट्यूब (पार्ट बी) से नीचे के ऊपर. सही तरफ; दो भागों पकड़े Parafilm; अंतिम मोल्ड करने के लिए फार्म ए और बी.

ntent "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 2
ए के चित्रा 2. यूवी प्रतिदीप्ति thaliana स्टेम वर्गों पार. एक जंगली प्रकार ए की अनुप्रस्थ वर्गों केवल इंटरफैसिकुलर फाइबर और जाइलम कोशिकाओं (- ई ए) की दीवारों में लिग्निन सहित सुरभित यौगिकों की उपस्थिति दिखा पराबैंगनी प्रकाश प्रतिदीप्ति तहत thaliana स्टेम. एपिडर्मिस और प्रांतस्था (ईपी), इंटरफैसिकुलर फाइबर (Fi), मज्जा (Pi), और जाइलम (xy) की स्थिति संकेत कर रहे हैं. आवर्धन: पैनल: 5X, पैनल बी: 10X, पैनल सी: 20X, पैनलों डी और ई: 40X. बार = 100 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3. ए के Phloroglucinol-एचसीएल धुंधला thaliana स्टेम वर्गों पार. एक जंगली प्रकार ए के Phloroglucinol-एचसीएल धुंधला (गुलाबी या फूहड़ रंग) इंटरफैसिकुलर फाइबर और जाइलम कोशिकाओं (- ई ए) की दीवारों में सामान्य लिग्निन बयान दिखा thaliana स्टेम अनुभाग. एपिडर्मिस और प्रांतस्था (ईपी), इंटरफैसिकुलर फाइबर (Fi), मज्जा (Pi), और जाइलम (xy) की स्थिति संकेत कर रहे हैं. आवर्धन: पैनल: 5X, पैनल बी: 10X, पैनल सी: 20X, पैनलों डी और ई: 40X. बार = 100 माइक्रोन.

चित्रा 4
चित्रा 4. ए के मौल धुंधला thaliana स्टेम वर्गों पार. एक जंगली प्रकार ए के मौल धुंधला हो जाना (लाल रंग) thaliana </ उन्हें> इंटरफैसिकुलर फाइबर और जाइलम कोशिकाओं (ए - ई) की दीवारों में सामान्य लिग्निन बयान दिखा स्टेम अनुभाग. एपिडर्मिस और प्रांतस्था (ईपी), इंटरफैसिकुलर फाइबर (Fi), मज्जा (Pi), और जाइलम (xy) की स्थिति संकेत कर रहे हैं. आवर्धन: पैनल: 5X, पैनल बी: 10X, पैनल सी: 20X, पैनलों डी और ई: 40X. बार = 100 माइक्रोन.

चित्रा 5
चित्रा 5. ए के Calcofluor सफेद धुंधला एक जंगली प्रकार ए के thaliana स्टेम पार वर्गों. Calcofluor सफेद धुंधला एपिडर्मिस, प्रांतस्था, मज्जा, इंटरफैसिकुलर फाइबर, और जाइलम (- ई ए) की कोशिकाओं की कोशिका दीवारों में सेलूलोज़ बयान दिखा thaliana स्टेम अनुभाग. स्थितिएपिडर्मिस और प्रांतस्था (ईपी) की ऑन, इंटरफैसिकुलर फाइबर (Fi), मज्जा (Pi), और जाइलम (xy) संकेत कर रहे हैं. आवर्धन: पैनल: 5X, पैनल बी: 10X, पैनल सी: 20X, पैनलों डी और ई: 40X. बार = 100 माइक्रोन.

चित्रा 6
चित्रा 6. ए के कांगो लाल धुंधला एक जंगली प्रकार ए के thaliana स्टेम पार वर्गों. कांगो लाल धुंधला एपिडर्मिस, प्रांतस्था, मज्जा, इंटरफैसिकुलर फाइबर, और जाइलम (- ई ए) की कोशिकाओं की कोशिका दीवारों में सेलूलोज़ बयान दिखा thaliana स्टेम अनुभाग. एपिडर्मिस और प्रांतस्था (ईपी), इंटरफैसिकुलर फाइबर (Fi), मज्जा (Pi), और जाइलम (xy) की स्थिति संकेत कर रहे हैं. आवर्धन: पैनल: 5X, पैनल बी पैनल सी: 20X, पैनलों डी और ई: 40X. बार = 100 माइक्रोन.

चित्रा 7
ए के चित्रा 7. Toluidine नीले हे धुंधला एक जंगली प्रकार ए के thaliana स्टेम पार वर्गों. Toluidine नीले हे धुंधला इंटरफैसिकुलर फाइबर और जाइलम कोशिकाओं (- ई ए) की दीवारों में सामान्य लिग्निन बयान दिखा thaliana स्टेम अनुभाग. एपिडर्मिस और प्रांतस्था (ईपी), इंटरफैसिकुलर फाइबर (Fi), मज्जा (Pi), और जाइलम (xy) की स्थिति संकेत कर रहे हैं. आवर्धन: पैनल: 5X, पैनल बी: 10X, पैनल सी: 20X, पैनलों डी और ई: 40X. बार = 100 माइक्रोन.

तालिका 1 इमेजिंग के लिए तालिका 1. माइक्रोस्कोप और कैमरा सेटिंग्स. प्रतिदीप्ति फिल्टर और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के साथ काम करने के लिए दिशानिर्देश. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

ए thaliana स्टेम वर्गों में व्यापक रूप से माध्यमिक सेल दीवार में कोशिकाओं के संगठन का अध्ययन करने और गुणात्मक जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक पौधों के बीच मतभेद की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है. नमूनों सेक्शनिंग के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक प्रत्यक्ष हाथ काटने कर रहे हैं; नमूनों agarose या लगानेवाला में एम्बेडेड रहे हैं जब या, सेक्शनिंग एक vibratome या सूक्ष्म के साथ किया जा सकता है. हाथ काटने के विपरीत, पिछले दो बस नमूने और असमान सतहों के बीच मोटाई मतभेद की वजह से एक बुरा नमूना तैयार करने की वजह से हो जाएगा कि नमूनों के बीच गलत मतभेद उत्पादन के जोखिम को कम करने की अनुमति देते हैं. इन तरीकों के सभी उनके पेशेवर और बुरा है. हम एक vibratome का उपयोग सेक्शनिंग द्वारा पीछा किया, agarose में embedding चुना है, और निम्न कारणों से ऐसा किया था: ताजा ऊतक के व्यापक प्रसंस्करण के लिए की आवश्यकता समाप्त एम्बेड करने में आसानी और समय agarose का प्रयोग करने में बिताया. इसके अलावा, हमारे घर का बना molds बनाने के लिए आसान और सस्ते होते हैं, वें पकड़ कर सकते हैंई सीधे स्टेम, कई वर्षों से इस्तेमाल किया जा सकता है, और एक मेस बनाने के बिना नमूनों की आसान रिहाई में मदद कर सकते हैं. उच्च प्रतिशत agarose भंग करने और एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है (chunky कणिकाओं के गठन के बिना 100 मिलीलीटर में agarose के 7 जी का पूरा विघटन) यह आटोक्लेव करने या सबसे कम तीव्रता पर इसे माइक्रोवेव है. यह ताजा स्टेम ऊतकों में कटौती करने के लिए, या वैकल्पिक रूप से ऊतक निर्जलीकरण और विरूपण को रोकने के लिए पानी से गीला एक फिल्टर पेपर युक्त बर्फ पर रखा एक प्लेट में यह स्टोर करने के लिए महत्वपूर्ण है. उच्च नमी के बिना 30 मिनट से अधिक लंबी अवधि के लिए स्टेम भंडारण के स्टेम बाहर सुखाने के लिए कारण होगा. स्टेम एम्बेडेड है ठीक से पहले agarose के तापमान लगभग 50 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए हवाई बुलबुले मोल्ड में अंतराल का कारण है और फलस्वरूप सेक्शनिंग असमान हो जाएगा, क्योंकि यह agarose शीशी में डाल दिया गया है के बाद हवाई बुलबुले की उपस्थिति के लिए जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है. एयर बुलबुले डालने का कार्य पिछले वैक्यूम के अंतर्गत समाधान रखकर जल्दी से हटाया जा सकता हैयह. यह अभी भी नरम नहीं है और गरम से 50 डिग्री सेल्सियस है जब स्टेम agarose में रखा जाना चाहिए गर्मी स्टेम shriveling से नमूना नुकसान होगा और सेल आकारिकी को नष्ट कर देगा. Agarose बहुत ठंड है तो स्टेम agarose के माध्यम से प्रवेश नहीं करेगा और एम्बेडिंग संभव नहीं होगा. Agarose embedding के बाद, स्टेम नमूने एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

बजाय हाथ से सेक्शनिंग पैदावार की एक vibratome का प्रयोग ठीक नमूनों और बेहतर छवि गुणवत्ता में कटौती. सभी सुरक्षा निर्देशों को ध्यान से पढ़ें और एक vibratome का उपयोग करते समय पालन किया जाना चाहिए. यह नमूना डिस्क यह सेक्शनिंग के दौरान गिर नहीं करता है तो ऊतक चिपकने वाला जगह में जोरदार नमूना धारण करने के लिए अनुमति देने के लिए साफ और शुष्क है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. नमूनों की मोटाई धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान कठोर एसिड और आधार उपचार का सामना करने के लिए निर्दिष्ट किया जाता है. vibratome में इस्तेमाल धार खंड EV काट रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से फ्लैट होना चाहिएenly. सेक्शनिंग नमूना प्रति लगभग 20 मिनट लगते हैं; समय बचाने के लिए, इसी तरह के नमूनों को एक भी नमूना थाली पर समूहों में sectioned किया जा सकता है. सेक्शनिंग के दौरान, वर्गों एक स्पष्ट पृष्ठभूमि पर देखने के लिए वर्गों आसान बनाने के लिए और अगले नमूना के लिए बफर ट्रे को आजाद कराने के लिए एक छोटा सा पेट्री डिश में बफर ट्रे से स्थानांतरित कर रहे हैं. धारा तुरंत नीचे की ओर धुंधला प्रक्रियाओं के लिए प्रयोग किया जाता है या बाद में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है. 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्टेम वर्गों aliquoting धुंधला प्रक्रियाओं के लिए भड़काना में मदद करता है. कैमरा और माइक्रोस्कोप पर सही समायोजन और सेटिंग्स बनाने उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं. Kohler रोशनी को एडजस्ट माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक है. तरीकों खंड में वर्णित के रूप में एपर्चर और प्रकाश की तीव्रता के लिए समायोजन,, केवल एक दिशानिर्देश के रूप में होती हैं. वे उपयोग माइक्रोस्कोप और कैमरे के आधार पर संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. हम एक उच्च संकल्प इस्तेमाल कियाएक बड़े प्रारूप अस्तर सीसीडी चिप और कोई यांत्रिक शटर यूवी इमेजिंग के लिए, calcofluor सफेद, और कांगो लाल धुंधला के साथ डिजिटल कैमरा; और मौल, phloroglucinol और toluidine नीला हे धुंधला के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के लिए एक उच्च संकल्प और उच्च गति कैमरा रंग. छवियाँ, विश्लेषण किया संसाधित और मानक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इकट्ठा कर रहे थे.

Phloroglucinol लिग्निन निर्धारण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दाग है; यह केवल cinnamaldehyde अंत समूहों के धब्बे के रूप में यह एक सच लिग्निन दाग नहीं है. भी Weisner दाग के रूप में जाना phloroglucinol दाग, जाइलम और इन एल्डिहाइड समूह 4 मौजूद हैं जहां इंटरफैसिकुलर तंतुओं में एक विशेषता चेरी गुलाबी या फूहड़ रंग पैदावार. गुलाबी रंग की तीव्रता lignification की हद के साथ बदलता रहता है. सूक्ष्म अंतर का निरीक्षण करने के लिए कड़ी मेहनत कर रहे हैं, यह जंगली प्रकार और उनके लिग्निन सामग्री 19 में बदलाव किया है कि उत्परिवर्ती स्टेम वर्गों के बीच मतभेदों को हाजिर करने के लिए आसान है. यह भी ईएएस हैइस तरह के ऊतकों के बीच lignification स्तर भिन्न है, क्योंकि (स्टेम शीर्ष की ओर) छोटे और बड़े (आधार स्टेम) के ऊतकों के बीच मतभेद का निरीक्षण करने के लिए y. आमतौर पर जंगली प्रकार स्टेम में, एपिडर्मिस प्रांतस्था और मज्जा अस्थानिक lignification 20 जब तक कि वहाँ (इस प्रकार के रंग का नहीं मिलता है) cinnamaldehydes शामिल नहीं है. मौल दाग, दूसरे हाथ पर, syringyl लिग्निन इकाइयों की ओर विशिष्ट है और एस या जी इकाइयों में अलग लिग्निन enrichments (जाइलम ऊतकों की तुलना में जैसे फाइबर) 14,18 अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक methoxycatechol फार्म करने के लिए और फिर अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ प्रतिक्रिया निम्न-O-क्विनोन methoxy को लिग्निन में एस इकाई के syringyl नाभिक पर पोटेशियम परमैंगनेट और हाइड्रोक्लोरिक एसिड अधिनियम. मौल दाग की कमी या बड़े पैमाने पर (ए thaliana f5h म्यूटेंट और सामान्य gymnosperm पौधों में उदाहरण के लिए) लिग्निन के एस इकाइयों में समाप्त हो रहे हैं कि म्यूटेंट फर्क के लिए एक अच्छा संकेत है, मौल पीले रंग रंगाई इंस्ट देता हैजाइलम और बादाम आदि का कड़ा ऊपरी आवरण 21 दोनों में लाल रंग का EAD. उसी कारण से, मौल धुंधला हो जाना मुख्य रूप से आम तौर पर एस यूनिट 18 की कमी है कि जिम्नोस्पर्म से एस लिग्निन होते हैं, जो वनस्पतियों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मजबूत एसिड और आधार क्रमशः phloroglucinol और मौल धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान इस्तेमाल कर रहे हैं, कुछ प्रयोगात्मक कदम सावधानी के साथ प्रदर्शन करने की आवश्यकता. केंद्रित एचसीएल और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड दोनों मजबूत corrosives हैं; Ph-एचसीएल और मौल दाग नमूनों युक्त स्लाइड ठीक से संभाला नहीं कर रहे हैं अगर वे खुर्दबीन मंच और लेंस खराब हो सकते हैं. उन्होंने यह भी नमूनों खराब करने के कारण, 5-10 मिनट के भीतर, जल्दी सूख सकता है, तो इमेजिंग तेजी से किया जा सकता है. Toluidine नीले हे एक पोलीक्रोमेटिक दाग है और यह एक बहुरंगी नमूना उत्पादन, अलग ढंग से सेल दीवारों के विभिन्न रासायनिक घटकों के साथ प्रतिक्रिया के रूप में अलग अलग रंग में सेल की दीवार के विभिन्न घटकों के दाग. उत्पन्न रंग सकते हैं प्रदान करतासेल की प्रकृति पर ई जानकारी. Toluidine नीले हे भी नकारात्मक समूहों 5,6 आरोप लगाया कि बांध एक cationic रंजक है. इस डाई के एक जलीय घोल नीला है, लेकिन डाई सेल में अलग anionic समूहों के साथ बांधता है जब अलग अलग रंग उत्पन्न कर रहे हैं. डाई ऐसे पेक्टिन के रूप में Carboxylated polysaccharides के साथ प्रतिक्रिया करता है जब उदाहरण के लिए, रंग एक गुलाबी बैंगनी हैं; हरे, हरे, नीले, या ऐसे लिग्निन और टैनिन के रूप में सुगंधित पदार्थों के साथ चमकदार नीली; और थोड़ा बैंगनी या न्यूक्लिक एसिड के साथ हरा नीला. धुंधला हो जाना आसान है और दो दिनों के लिए पिछले कर सकते हैं.

Calcofluor सफेद दाग सेल्यूलोज, callose, और अन्य nonsubstituted या दुर्बलता से प्रतिस्थापित β-glucans 6-9, और कांगो लाल दाग सीधे (1 → 4) glucans-β के लिए और विशेष रूप से 8,10,11 सेलूलोज़. सफेद दाग Calcofluor बखूबी एपिडर्मिस, प्रांतस्था, और मज्जा लेकिन उस प्रतिभा काफी जाइलम और इंटरफैसिकुलर फाइबर में कम है. दो पी रहे हैंभारी lignified ऊतकों में calcofluor सफेद से कम प्रतिदीप्ति के लिए ossible स्पष्टीकरण; एक, बारी में polysaccharides के माध्यम से ठीक से फैलाना calcofluor सफेद की क्षमता कम होगी, जो लिग्निन की उपस्थिति के लिए इसे जिम्मेदार बताते हैं. यूवी के तहत उत्साहित सफेद calcofluor द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का आंशिक शमन करने के लिए एक दूसरी व्याख्या अंक. इसके विपरीत लाल धुंधला कांगो, सफेद calcofluor को कम लिग्निन की उपस्थिति से प्रभावित लगता है. यह लाल calcofluor सफेद और कांगो के बीच प्रतिदीप्ति गुणों में अंतर से संबंधित हो सकता है; कांगो की एक बेहतर प्रसार क्षमता calcofluor सफेद से lignified ऊतकों के माध्यम से लाल; या पोलीसेकेराइड बाइंडिंग गुण 22 में एक मामूली अंतर है. लाल कांगो पानी में धुल पाने के लिए जाता है, क्योंकि यह लाल कांगो के साथ दाग वर्गों इमेजिंग से पहले भी लंबे समय से जमा नहीं किया जाना चाहिए कि नोट करना महत्वपूर्ण है.

Histochemical धुंधला मात्रात्मक न तो हैऔर न ही पूरी तरह से निर्णायक, यह दृश्य cues के माध्यम से इस तरह के ऊतकों या असामान्य कोशिका दीवार बयान और lignification की अखंडता के रूप में महत्वपूर्ण लक्षण के बारे में जानकारी का खजाना प्रकट कर सकते हैं. ऊपर वर्णित धुंधला तकनीक प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं और इस तरह के लिग्निन और सेलूलोज के रूप में एक संयंत्र सेल दीवार में महत्वपूर्ण तत्व, के लिए लागू कर रहे हैं. इसके विपरीत, विशिष्ट antisera और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग immunofluorescence hemicelluloses और पेक्टिन के विभिन्न घटकों का पता लगाने के लिए आवश्यक है. यह रिपोर्ट ए का उपयोग करने वाले माध्यमिक सेल दीवार धुंधला के क्षेत्र में शुरुआती के लिए एक किताब के रूप में सेवा करने के लिए है उनके मॉडल प्रणाली के रूप thaliana.

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Acknowledgments

हम संपादन सहायता के लिए साबिन रसेल के शुक्रगुजार हैं. यह काम (http://www.jbei.org) अमेरिकी ऊर्जा विभाग, विज्ञान, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय के कार्यालय द्वारा समर्थित डो संयुक्त Bioenergy संस्थान का हिस्सा था लॉरेंस बर्कले के बीच अनुबंध डे-AC02-05CH11231 के माध्यम से राष्ट्रीय प्रयोगशाला और अमेरिकी ऊर्जा विभाग.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose EMD MERC2125 CAS Number: 9012-36-6
Phloroglucinol Sigma P 3502 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]
Hydrochloric acid EMD HX0603-75 CAS Number: 7647-01-0
Ammonium hydroxide EMD AX1303-6 CAS Number: 1336-21-6
Toulidine Blue O Sigma T3260 Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] 
Potassium permanganate Sigma 223468 CAS Number 7722-64-7 
Ethanol 190 proof KOPTEC V1401 CAS Number: 64-17-5
Congo Red Sigma  C6277 Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0]
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain Sigma F3543  4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] 
Vibratome Leica Leica Vibrating blade microtome VT1000S http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
Razor American Safety razor company Item # 60-0139-0000  Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) VWR 16466-044
Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) Axygen Scientific MCT-060-C
Mitt Bel-Art 380000000 SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue adhesive Ted Pella Inc 10033 Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage
Microwave Panasonic NN-SD762S PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive 
Camera with CCD chip with no mechanical shutter  Hamamatsu C4742-95
High speed color camera    QImaging MicroPublisher 5.0 RTV
Camera software   Molecular Devices MetaMorph version 7.7.0.0
Imagining anaylsis  Adobe  Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 VWR 48366-067 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm.
Frosted Micro Slides, 1 mm VWR 48312-003 75 x 25 mm - 1 mm
Parafilm M Alcan packaging BRNDPM998
TX2 Filter cube Leica 11513851/11513885 Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.

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References

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Pradhan Mitra, P., Loqué, D. Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements. J. Vis. Exp. (87), e51381, doi:10.3791/51381 (2014).

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