Introduction
Den växtcellväggen har en uppsjö av information inom dess olika komponenter: lignin, cellulosa, hemicellulosa (xylan, glukuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, blandad koppling glukan, eller glukomannan), och pektin. Histologiska tekniker ger viktiga visuella ledtrådar i att studera skillnader inom de sekundära cellväggarna på organisatoriska och cellulär nivå. Olika histologiska tekniker har utvecklats och kan hittas i litteraturen, men dessa tekniker kan vara svårt och tidskrävande för nybörjare eftersom mycket detaljerade protokoll med enkla visuella instruktioner är sällan eller aldrig tillgängliga. Målet med denna studie är att ge enkla riktlinjer för histologiska färgningsteknik för att få bilder av hög kvalitet.
Sektioneskaftvävnad är det första steget i visualisering av cellväggar och cellformer. Även handslipade avsnitten är billiga och tar mindre tid att förbereda, användning av en vibratome erbjuder konsekvens ochger bilder med hög kvalitet. Med hjälp av en vibratome tillåter producera bättre datakvalitet genom att generera och med sektioner med samma tjocklek, vilket hjälper till att ge skarpa bilder och minskar signifikant risken för att producera felaktiga skillnader mellan prover som skulle helt enkelt orsakas av en dålig provberedning. Använda hartser att fixa färska prover kan vara en utmaning för nybörjare och kan fortfarande vara tidskrävande även för experter när en analys måste göras snabbt. Dessutom blir det omöjligt att mäta varje biologisk aktivitet med provet när det har inbäddade i ett harts. En enkel teknik som utnyttjar agaros och en hemmagjord gjutform är till hjälp för inbäddning stem vävnader, och den kan också användas i andra tillämpningar som kräver dissektion av mjuka vävnader. Jämfört med inbäddning prover i harts, har denna metod fördelen att hålla vävnaderna vid liv och minska provmanipulation. Sektione vävnader via en vibratome är mycket exakt och ger homogenOU sektioner, som, beroende på målet av studien, då kan användas med flera olika färgningstekniker.
De enklaste metoderna att visualisera lignin och andra aromater använda ultraviolett (UV) ljus. Excitering av aromatiska-baserade molekyler genom UV-ljus är en gammal teknik, men det är fortfarande en av de snabbaste metoder för visualisering av lignin. Men egentligen är UV-visualisering inte idealiskt för lignin upptäckt eftersom UV-ljus kommer att väcka andra aromater. Lignin består huvudsakligen av tre byggstenar, de monolignols (hydroxycinnamyl alkoholer: koniferylalkohol, sinapyl alkohol, och p-kumaryl alkohol) 1-3. Fluoroglucinol fläck kan ge ledtrådar till omfattningen av cinnamaldehydes närvarande i xylem, fibrer och trakeala vävnader 4. Fluoroglucinol är en bra indikator på allmänna cinnamaldehydes och kan skilja mellan cinnamaldehydes och andra aromater. Sinapyl alkohol monomerer De kan upptäckasoch differentieras genom användning av Maule fläcken. Toluidinblå O är en polykromatisk färgämne och har förmågan att färga olika delarna av cellväggen i olika färger 5,6 därför. Den primära användningen av toluidinblå O är att detektera pektin och lignin 5,6. Fördelen med användning av toluidinblått O är att många delar av cellväggen kan visualiseras i ett enda steg. Både kalkofluor vit och congo röd är lätta att arbeta med och kan användas för att visualisera cellulosa. Kalkofluorvit fläckar cellulosa, callose, och andra icke-substituerade eller svagt substituerade β-glukaner 6-9, medan Congo röd fläckar direkt till β-(1 → 4)-glukaner och särskilt till cellulosa 10,11. Målet med denna studie är att ge enkla riktlinjer för användningen av de tidigare nämnda färgningsteknik för att få högkvalitativa bilder från A. thaliana stjälkar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stem inbäddning
- Lägg till en 7%-ig lösning i vatten (7 g elektrofores-grade agaros i 100 ml destillerat vatten). Lös upp agaros genom autoklavering under 20 min eller genom mikrovågsugnen under 20 min vid lägsta intensitet (t ex 10% intensitet av en 1250 watts mikrovågsugn).
- Förbered en hemmagjord gjutform för inbäddning stjälkarna med hjälp av plastflaskor.
- Med hjälp av ett rakblad, skär av den koniska botten av en 2 ml med skruvlock mikrocentrifugrör (Komponent A). Med en sprutnål, punktera ett hål i rörets lock som är något större än diametern hos skaftet som skall bäddas in. Därefter skär 0,5 cm från botten av ett 0,6 ml mikrocentrifugrör (del B).
- Lägg avskärningen 0,5 cm portion av 0,6 ml mikrocentrifugrör i förskurna 2 ml mikrocentrifugrör. Täta de två delarna med Parafilm (Figur 1). OBS: Den nedre delen av röret skärs för att underlätta avlägsnandet av det inbäddade provet efter agarosen stelnat. Than hål i locket kommer att hjälpa till att hålla stammen stadigt när spindeln är inbäddad i agaros. Formen kommer att tjäna till att hålla agaros och håll stammen rakt vid inbäddning. Den Parafilm kommer att hålla de två delar, A och B, tills agaros är inställd och stammen är inbäddad.
- Med hjälp av ett rakblad, skär en stamdel från området av intresse (t.ex. mitten av det första skaftet internoden). OBS: Helst ska stjälken klippas strax innan inbäddning för att undvika förstörelse av uttorkning. Alternativt kan skaftet vara temporärt lagras i en platta innehållande ett filterpapper fuktat med vatten. Denna platta kan placeras på is tills det ska bäddas för att förhindra vävnads uttorkning och deformation. Förvaring av stammen under längre tid än 30 minuter utan hög fuktighet gör att stammen att torka ut.
- Smält agaros i mikrovågsugn vid låg intensitet. VARNING: Flaskan innehåller agaros kan vara het. Använd en karda för att plocka upp flaskan. Låt de smälta agaros stand vid rumstemperatur (mellan 20 ° C och 25 ° C) tills den kyls till omkring 50 ° C.
- Sakta pipett 5 ml av agaros i den färdiga plastform för att fylla flaskan. OBS: Se till att det inte finns några luftbubblor i formarna. Luftbubblor orsakar luckor i agaros mögel och kommer inte att helt täcka stammen provet, som så småningom kommer att leda till ojämn skärning av provsektioner.
- Låt agarosen svalna under 30 till 60 sek för att bli halvfast ämne. Testa med en liten tandpetare, och se till att den kan tränga in och stå upp, men inte flyta, i agaros. OBS: Om stammen är placerad när agaros är fortfarande varmt det kommer att skada provet genom shriveling stammen, förstör cellens morfologi.
- Placera spindeln i denna agaros-fyllda flaskan. Se till att stammen förblir raka. Placera den perforerade locket på ett sådant sätt att spetsen på skaftet hålls av locket. Stäng inte av skruvlock. Någon gång mer än en stam (av ett enda slag) kan vara embedded i en injektionsflaska; men i det särskilda fallet, använd inte locket. OBS: Om skruvlock vrids spindeln får vriden.
- Lämna flaskan vid rumstemperatur eller vid 4 ° C under 10 till 30 min, till dess den stelnar.
- Avlägsna formen genom att försiktigt dra ut den ur röret. Öppna Parafilm. Tryck på undersidan av del B av formen försiktigt med tummen för att frisätta den stelnade agarosen från del A på en glasmikroskopskiva.
- Skär agarosen inbäddad stammen i tre ungefär lika stora bitar av 1,2 cm i längd. Klipp ut en del av stammen som inte var i agaros och kassera den.
- Förvara dessa delar av agaros med den inbäddade stjälkarna i lufttät 2 ml mikrorör i en mörk låda vid 4 ° C tills den ska avsnitt. Alternativt förvara rören vid 4 ° C under högst en vecka. OBS: Lagring är möjlig, men försöksledaren måste vara medveten om att den inbäddade stjälkar är fortfarande vid liv och, beroende av experimentet, Artefakter skulle kunna införas.
2. Stem Sektione
- VARNING: Läs vibratome anvisningen noga och följ alla säkerhetsanvisningar.
- Se till preparatskivan är ren och helt torr (fri från varje fast eller flytande). Rengör preparatskivan med ett rakblad för att avlägsna eventuellt kvarvarande lim från tidigare experiment och tvätta med vatten. Torka sedan med en pappershandduk. NOTERA: Detta kommer att säkerställa att limmet fungerar bra och binder till agarosen provet. Om detta steg inte görs på rätt sätt, är det möjligt att provet inte kan fastna på skivan och kommer senare att leda provet faller av skivan vid snittning.
- Använd mjukt papper servetter för att avlägsna eventuell fukt från agaros block som innehåller proven.
- Placera en liten droppe vävnadsadhesiv på preparatskivan. Serie ut limmet för att täcka området i mitten av plattan med användning av spetsen av den adhesiva flaskan. Snabbt platsagaros blocket så att exemplaren är antingen vinkelrätt eller parallellt med plattan för tvärgående eller längsgående tvärsnitt, respektive. Låt limmet för att fixera provet till preparatskivan vid rumstemperatur eller vid 4 ° C under 10-30 min. OBS: Detta är en tidskänsliga steget.
- Fäst preparatskivan på plats på buffertfacket eller tråg. Blocket / s av agaros med sektionerna ska vara parallellt med rakblad. Fyll buffertfacket med destillerat vatten vid rumstemperatur till dess att proverna helt nedsänkt.
- Skär ett rakblad på mitten och sedan trimma ändarna med en robust sax så att klingan stannar helt platt. Sätt hälften av färdigskurna rakblad på knivhållaren.
- Ställ in vinkeln på knivhållaren till 84 °, hastigheten till 0,90 mm / sek (läge 8 på vibratome) och frekvensen till 50 Hz (position 5 på vibratome). Skär sektioner av 100 | im tjocklek. Använd kontinuerligt läge. NEJTE: Denna tjocklek har valts för att säkerställa att vävnaden kan motstå de olika syra-och bass behandlingar som används i en del av färgningsprotokoll. Ställ in fönstret för sektionering och låt 15-20 min på ett kontinuerligt läge för vibratome avsnitt en agaros block med ca 1,2 cm.
- Samla avsnitten med hjälp av en engångs plastpipetten vid snitt i buffertbrickan. Alternativt kan sektionerna överföras från buffertfacket i en glasbägare och därefter till en klar petriplatta. Överför några avsnitt till 2,0 ml mikrorör. Anmärkning: De prover samlas in från en petriplatta eftersom det är lättare att se avsnitten på en klar bakgrund och eftersom buffertfacket kan primas för nästa prov.
- Sektionerna kan lagras i ett 50 ml rör eller samlas in och lagras i 1,5 till 2 ml mikrocentrifugrör vid 4 ° C under 30 till 60 min. OBS: Lagra sektionerna under längre perioder kommer att resultera i dålig bildkvalitet.
3. Mikroskop och kamera Inställning för Imaging
- Justera Köhler belysning på mikroskopet. Välj ett mål. Fokusera objektet först. Bring ljusintensiteten till en-halv eller lägre. Stäng fältbländaren (FD) och bländare (AP) eller ta med den till lägsta möjliga inställning på just mål.
- Ju högre förstoring, den större ringen kommer att bli. Använd kondensorn fokuseringsratten för att fokusera fält iris så kraftigt som möjligt.
- Långsamt upp bilden av fält iris (hexagon-formad liten ring) till mitten med hjälp av kondensor-centre rattar (stiftformade skruvar som omger kondensorn). Öka långsamt membranet (FD), så att fält iris når kanten. Sluta öka FD strax efter fältet iris har passerat kanten.
- Öka bländaren (AP) för att justera kontrasten. Justera ljusintensitet som krävs. OBS: Koehler belysning behöver justeras för varje oÅL, varje experimentell dag. Notera siffrorna som erhölls efter justering för dagen. Dessa nummer kommer att återanvändas varje gång som mål kopplas fram och tillbaka för just den dagen.
- Justera bländare, intensitet, exponeringstid, förstärkning och filter som beskrivs i tabell 1. Bör Informationen endast användas som vägledning.
- Använda en digitalkamera med hög upplösning med en storformatsinterline CCD-chip med ingen mekanisk slutare för att fånga fluorescens bilder; och en hög upplösning, höghastighetskamera för ljus-fält bilder.
- Bearbeta bilderna med hjälp av standardprogramvara. Ladda programvaran. Klicka på "Hämta" och "Set kamera / styrelse," välj sedan att kameran kan användas. Klicka på "OK." Klicka på "Hämta" följt av "fliken Färg." Under "fliken Färg" välja "Bayer-metoden" följt av "Average fyra." Lägg den föreslagna förstärkningen (röd, grön, blå) from Tabell 1. Välj fliken "Set spara" och klicka på den katalog där bilderna ska sparas. Ställ in "Exponeringstid" från förslagen i Tabell 1. Ställ "Binning" på "1" och "Live binning" på "1." Fokusera på det intressanta området och sedan klicka på "Spara live."
- Utgångs bilder på kamerans mjukvara är i "TIF" format. Analysera bilderna för histokemi av de celltyper. Använd standard programvara för användning av presentation och publicering nedströms.
4. Ultraviolett och Bright-området Imaging
- Använd en 1 ml pipett med pipettspetsen skuren så att sektionerna kan pipetteras ut lätt. Försiktigt pipett sektioner in i spetsen och vidare till ett objektglas. Täck sektioner med ett täckglas. Observera de avsnitt under UV-ljus eller ljusfält belysning.
5. Fluoroglucinol-HCI (Wiesner) Färgning 12
- Lös upp 0,3 g floroglucinol i 10 ml absolut etanol för att framställa en 3% floroglucinol lösning. Blanda en del koncentrerad HCl (37 N) till två volymer av 3% floroglucinol i etanol; denna lösning är floroglucinol-HCl (pH-HCl) eller Wiesner fläcken. OBS: Den här lösningen är att göras färskt på dagen för färgning och kan inte lagras, eftersom lösningen kommer att försämras med tiden och färgning kommer att bli ineffektiv. VARNING: HCI är starkt frätande, så mycket försiktig vid hantering av Ph-HCl-fläcken.
- Överför stjälksegment till en 2,0 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml av den pH-HCl-lösning till röret innehållande sektionerna och kapsyl det omedelbart eftersom HCl i den pH-HCl fläck är starkt frätande. Rör försiktigt röret för att säkerställa att alla sektioner är färgade. Ett alternativ till detta steg är att hålla rörets lock öppet så att pH-HCl-lösning kan pipetterades upp och ner, företrädesvis utan att störa sektioner. OBS: Var noga med att inte pipet sektionerna i pipettspetsen, eftersom det kan skada dessa avsnitt.
- Använd en 1 ml pipett med pipettspetsen skuren på ett sådant sätt att sektionerna kan pipetteras ut enkelt utan skador. Pipettera försiktigt sektioner in i spetsen och på ett objektglas. Täck sektioner med täckglas. Observera de avsnitt i ljusfält belysning. OBS: Det Ph-HCl-lösning torkar upp i 5-10 minuter, vilket orsakar en försämring av exemplaren. Därför har avbildning slutföras inom denna tidsperiod.
6. Maule Färgning 13,14
- Lös upp 0,2 g kaliumpermanganat i 40 ml destillerat vatten för att framställa en 0,5% kaliumpermanganatlösning. Förvara i en mörk flaska vid rumstemperatur under högst 7 dagar.
- Bered en 3,7% HCl-lösning genom att tillsätta 1 ml koncentrerad HCl (37 N) till 9 ml destillerat vatten (01:10). Bered en färsk 3,7% HCl-lösning pådagen för experimentet. Kontrollera att 37 N HCl stamlösning som används inte är för gammal. Koncentrerad ammoniumhydroxidlösning (14,8 M) bör förvaras vid 4 ° C för att förhindra molariteten för den mättade lösningen från att minska.
- Överför stjälksegment till en 2,0 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml av den 0,5% kaliumpermanganatlösning till röret innehållande sektionerna.
- Pipettera 0,5% kaliumpermanganatlösning upp och ner försiktigt, helst utan att störa sektionerna. Inkubera under 2 min och upprepa pipettering. Låt mikrocentrifugrör stå tills alla sektioner lugna ner. OBS: Var noga med att inte pipet sektionerna i pipettspetsen eftersom sektionerna kan skadas. Det kan vara svårt att se de stjälksegment som lösningen är mörkt, så håll tuben med avsnitten om provrörsställ och tillåta dem att bosätta sig i 2 min.
- Med hjälp av en 1 ml pipett, dra ut 700 pl av 0,5% kaliumpermanganatlösning.Lägg till 700 l av destillerat vatten för att skölja ur kaliumpermanganatlösning. Upprepa 3-4x eller tills vattenlösningen förblir klar.
- Kasta bort vatten. Snabbt lägga 1 ml av 3%-ig HCl tills djup brun färg utmatas från sektionerna. Detta kan ske inom 3-5 minuter, eller kan kräva 2 tvättar i 5 minuter vardera. Pipet ut alla 3% HCl-lösning och omedelbart gå vidare till nästa steg.
- Tillsätt 1 ml koncentrerad ammoniumhydroxidlösning. Använd en 1 ml pipett med spetsen skuren på ett sådant sätt att sektionerna kan pipetteras ut enkelt utan skador. Pipettera försiktigt sektioner in i spetsen och på ett objektglas. Täck sektioner med ett täckglas. Observera de avsnitt i ljusfält belysning. VARNING: Eftersom ammoniumhydroxid är extremt frätande, det kräver extra omsorg och uppmärksamhet för att undvika att orsaka korrosion på scenen av mikroskopet eller objektivet. OBS: ammoniumhydroxiden ångor kan dimma täckglas, vilket gör det svårt att observera provet. Därför vara extra försiktig innan du lägger täckglas. Lösningen torkar upp i 5-10 minuter, så bild måste slutföras inom denna tidsperiod.
7. Congo Red Staining 11,15
- Lös upp 0,5 g kongorött i 100 ml destillerat vatten för att framställa en 0,5% kongorött-lösning.
- Överför stjälksegment till en 2,0 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml av den 0,5% kongorött-lösning till röret. Pipett försiktigt 0,5% kongorött lösning upp och ner utan att störa sektionerna. OBS: Var noga med att inte pipet avsnitten i pipettspetsen som detta kan skada delarna.
- Inkubera vid rumstemperatur i 10 min och upprepa pipettering. Följ med en annan 3 minuters inkubation vid rumstemperatur.
- Använd en 1 ml pipett för att dra ut 700 pl av 0,5% kongorött lösning. Lägg till 700 l av destillerat vatten för att skölja ur den kongorött lösningen. Upprepa tvätta 3-4x tills tvättlösningenär tydlig.
- Använd en 1 ml pipett med sin spets skuren på ett sådant sätt att sektionerna kan pipetteras ut enkelt utan skador. Pipett försiktigt sektioner i spetsen och på ett objektglas och täck dem med täckglas. Följ proverna på objektglas under blå-ljus excitation med hjälp av ett filter med ett bandpass på 560/40. OBS: Förvaras avsnitten i vattnet för länge innan den mikroskopiska analysen, eftersom vattnet kommer att tvätta ur kongorött i 10-30 min.
8. Kalkofluorvit Färgning 9
- Lös upp 0,02 g av fluorescerande vitmedel 28 (kalkofluor vit M2R) i 10 ml destillerat vatten för att framställa en 0,2% förrådslösning. Den 0,2% lösning kan lagras i sex månader i en mörk flaska vid 4 ° C. Bered en arbetslösning av 0,02% genom utspädning av 0,2% stamlösning 10x med destillerat vatten.
- Överför stjälksegment till en 2,0 ml mikrocentrifugrör. Lägg till röret 1 ml av 0,02% calcofluor vit lösning. Pipett försiktigt 0,02% kalkofluor vit lösning upp och ner. OBS: Var noga med att inte pipet avsnitten i pipettspetsen som detta kan skada delarna.
- Inkubera vid rumstemperatur under 5 min och upprepa pipettering. Inkubera avsnitt för en annan 3 minuter vid rumstemperatur. OBS: Tillåt sektionerna sedimentera på botten av röret för att göra det lättare att pipettera ut lösningen utan att skada de andra avsnitten.
- Använd en 1 ml pipett för att dra ut 700 l av 0,02% kalkofluor vit lösning och tillsätt 700 l av destillerat vatten; vänta 5 minuter för att skölja ur kalkofluor vit lösning. Upprepa tvätta 3-4x. Använd en 1 ml pipett med pipettspetsen skuren på ett sådant sätt att sektionerna kan pipetteras ut enkelt utan skador.
- Pipettera försiktigt sektioner in i spetsen och på ett objektglas och täcka dem med ett täckglas. Observera de avsnitt under UV-ljus.
9. Toluidine Blue O Färgning 16,17
- Lös 0,02 g toluidinblå O i 100 ml destillerat vatten för att bereda en 0,02% lösning. OBS: toluidinblått O lösning kan lagras under två veckor i en mörk flaska vid rumstemperatur.
- Överför stjälksegment till en 2,0 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml av den 0,02% toluidinblått O lösning till röret. Pipett försiktigt 0,02% toluidinblått O lösningen upp och ner. Därefter inkubera vid rumstemperatur under 5 min och upprepa pipettering gång. OBS: Var noga med att inte pipet avsnitten i pipettspetsen som detta kan skada delarna. Låt mikrocentrifugrör stå stilla tills avsnitten bosätta sig. Detta kan vara svårt att se, eftersom lösningen är mörkt, så håll röret med avsnitten om provrörsställ och tillåta dem att nöja sig med 2 minuter i rumstemperatur.
- Använd en 1 ml pipett för att dra ut 700 l av 0,02% toluidinblått O lösning. Lägg till 700 l av destillerat vatten för att skölja ur toluidinblå O solution. Upprepa 3-4x eller tills tvättlösningen är tydlig. Använd en 1 ml pipett med pipettspetsen skuren på ett sådant sätt att sektionerna kan pipetteras ut enkelt utan att skada dem.
- Pipettera försiktigt sektioner in i spetsen och på ett objektglas och täcka dem med ett täckglas. Observera de avsnitt i ljusfält belysning.
- Justera Köhler belysning på mikroskopet. Välj ett mål. Fokusera objektet först. Bring ljusintensiteten till en-halv eller lägre. Stäng fältbländaren (FD) och bländare (AP) eller ta med den till lägsta möjliga inställning på just mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stem inbäddning och Sektione:
Användningen av den hemgjorda plastform för att bädda in stjälkarna i 7% agaros visat sig vara snabb och enkel (figur 1). De två delar (A och B, Figur 1) av den inbäddade flaskan systemet gör det enkelt att enkelt släppa stammen inbäddade i agaros som agarosen inte hålla sig till de flask delar som är inerta, hålla systemet rent. Ampullerna kan återanvändas flera gånger i flera år. Bekvämligheten att lagra inbäddade stammen gör också nästa steg lättare. För att rädda någon gång, liknande inbäddade stjälkar kan grupperas (upp till 3) på en enda sektioneplatta för sektionering.
Observation av aromatiska ämnen under UV:
De stjälksegment monterades i destillerat vatten på de glasskivor och observerades under UV-ljus. De aromatiska föreningar, innefattande ligninet i cellerna, kan visualiseras genom deras autofluorescens under UV-ljus. Xylem (Xy) och interfascicular fibrer (Fi)visade autofluorescens under UV-belysning, men inte i märg (Pi) och cortex eller epidermis (EP) (figur 2), eftersom lignin, en aromatisk polymer, avsattes under sekundär cellväggs biosyntes. I vissa fall, när växterna ackumulera betydande mängder aromater i sina vakuoler (t.ex. antocyanin), kan observeras fluorescens i kortikala celler (data visas ej). Stem tvärsektioner analyserades i enlighet med 5X, 10X, 20X och 40X förstoring (Figur 2 Paneler A, B, C och D - E, respektive) för att bättre visualisera cellvägg aromatisk fördelning över stammen.
Observation av Lignin i Stem Sektioner färgas med Phloroglucinol och Maule Stains:
Den xylem består av fartyg och fibrer och interfascicular fibrer var de enda delarna av stammen som färgades av lignin fläckar (floroglucinol och Maule) Med användning av en vild typ stamdel provet. Fluoroglucinol fläcken reagerar med kanelaldehyd ändgrupper av lignin för att ge en rosa eller fuchsia färg 4 (figur 3). Såsom observerades under UV-belysning är en fuchsia färgning observeras i xylem och interfascicular fibrer men är frånvarande i märg och cortex eller epidermis (Figur 3). Stem tvärsektioner analyserades i enlighet med 5X, 10X, 20X och 40X förstoring (Figur 3 paneler A, B, C och D - E, respektive) för att bättre visualisera floroglucinol fläck fördelning över skaftet och differentiera de stora vävnader; xylem och interfascicular fibrer; märg och cortex; och epidermis. Vanligtvis är färgintensiteten korrelerar med nivån av lignification på ett kvalitativt sätt - förutom när det analyserade mutant eller transgen är onormalt anrikat på kanelaldehyd härledda enheter (t.ex. cad mutant) <sup> 14. Den Maule fläcken är specifik i att upptäcka de syringyllignin enheterna i xylem och interfascicular fibrer. Röd färg indikerar närvaron av syringyllignin andelar i ligninelementen (fig. 4) 18. Emellertid är en ljusare röd färg observeras i fibrerna jämfört med de xylem vävnader vilket antyder att fibrerna innehåller en högre nivå av S lignin medan xylem är mer berikad i G-enheter. Som observerats efter floroglucinol färgning, är en röd färgning observeras i xylem och interfascicular fibrer men är frånvarande i märg och cortex eller epidermis (Figur 4). Det korrelerar också med lignin fördelning observerades under UV-ljus (fig. 2) och visar att syringyl enheter är närvarande i varje förvedade vävnad av denna stam provet. Stem tvärsektioner analyserades i enlighet med 5X, 10X, 20X och 40X förstoring (Figur 2 Paneler A, B, C ochD - E, respektive) för att bättre visualisera Maule fläck fördelning över stammen och differentiera de stora vävnader: xylem och interfascicular fibrer, märg och cortex och epidermis. Det är viktigt att notera att storleken på och fördelningen av syringyl enheterna mellan förvedade vävnader varierar med ålder av skaftet och kan vara frånvarande i en ung stam (data visas ej).
Observation av Stem Sektioner färgas med kalkofluorvit och Kongo röda fläckar:
Kalkofluor vita fläckar cellulosa, callose och andra osubstituerad eller svagt substituerade β-glukaner; medan Congo röd fläckar direkt till β-(1 → 4)-glukaner och särskilt till cellulosa. Stem sektioner färgade med kalkofluor vita observerades under UV-ljus 6-9. Kongo röd-färgade sektioner observerades under blå-ljus excitation med hjälp av ett filter med ett bandpass på 560/40. Både kalkofluorvit och kongorött färgade epidermis, cortex och märg; thär är därför att alla dessa vävnader innehåller cellulosa som större polysackaridpolymer i deras cellväggar (figur 5 och figur 6, respektive). I motsats till kalkofluorvit, kongorött färgade polysackarider bättre i xylem och interfascicular fibrer och verkar vara mindre påverkad av närvaron av lignin (Figur 5 och Figur 6) 10,11. Stem tvärsektioner analyserades i enlighet med 5X, 10X, 20X och 40X förstoring (Paneler A, B, C, och DE, respektive i figurerna 5 och 6) för att bättre visualisera kalkofluor vit och Congo röd fläck distributioner över stammen och de stora vävnader (xylem och interfascicular fibrer, märg och cortex, och epidermis).
Observation av Stem Sektioner färgas med toluidinblått O:
Toluidinblå O är klassificerad som en polykromatisk färgämne eftersom det reagerar med andra kemiska beståndsdelar av celler på olika sätt och resulterar ien flerfärgade exemplar (Figur 7). Färgerna som genereras kan ge information om vilken typ av cellen och dess väggar. Toluidinblå O är ett katjoniskt färgämne som binder till negativt laddade grupper 5. En vattenhaltig lösning av denna färg är blå, men olika färger alstras när färgen binder med olika anjoniska grupper i cellen 6,9. Till exempel kommer en rosa lila färg visas när färgämnet reagerar med karboxylerade polysackarider såsom pektinsyra; grön, grönblått, eller klarblå med polyaromatiska ämnen som lignin och tanniner; och lila eller grönblått med nukleinsyror. Toluidinblå O av stem tvärsnitt visade att xylem och interfascicular fibrer förvedade eftersom de visar en grönaktigt blå eller blå färg (Figur 7, panel C), vilket är i överensstämmelse med UV och Ph-HCl färgnings observationer (figur 2 och 3). Däremot märgen och cortex och epidermis vävnader visar grönaktigt blå eller blå färg, därför att, även om de inte är förvedade, de innehåller vissa pektin polymerer i deras cellväggar. Stem tvärsektioner analyserades i enlighet med 5X, 10X, 20X och 40X förstoring (Figur 7 Paneler A, B, C och D - E, respektive) för att bättre visualisera Toluidinblå O fläck fördelning över skaftet och för att differentiera de stora vävnader .
. Figur 1 hemgjord gjutform för inbäddning stjälkarna På vänster sida. toppen av 2 ml med skruvlock mikrocentrifugrör (Komponent A) och bottnen från 0,6 ml mikrocentrifugrör (del B). På den högra sidan; Parafilm som håller de två delarna; A och B för bildning av den slutliga formen.
Figur 2. UV Fluorescens av A. thaliana stem tvärsnitt. tvärgående sektioner av en vild typ A. thaliana stam under UV-ljus fluorescens visar närvaron av aromatiska föreningar, innefattande lignin, endast i väggarna av interfascicular fibrer och xylem celler (A - E). Positionerna i överhuden och cortex (EP), interfascicular fibrer (Fi), märg (Pi) och xylem (XY) indikeras. Förstoringar: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D och E: 40X. Streck = 100 um.
Figur 3. Fluoroglucinol-HCl-färgning av A. thaliana stam tvärsnitt. Phloroglucinol-HCI färgning (rosa eller fuchsia färg) i en vild typ A. thaliana stam sektion som visar den normala ligninavsättning i väggarna av interfascicular fibrer och xylem celler (A - E). Positionerna i överhuden och cortex (EP), interfascicular fibrer (Fi), märg (Pi) och xylem (XY) indikeras. Förstoringar: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D och E: 40X. Streck = 100 um.
Figur 4. Maule färgning av A. thaliana stem tvärsnitt. Maule färgning (röd färg) av en vild typ A. thaliana </ Em> skaftsektion som visar den normala ligninavsättning i väggarna av interfascicular fibrer och xylem celler (A - E). Positionerna i överhuden och cortex (EP), interfascicular fibrer (Fi), märg (Pi) och xylem (XY) indikeras. Förstoringar: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D och E: 40X. Streck = 100 um.
Figur 5. Kalkofluor vit färgning av A. thaliana stem tvärsnitt. kalkofluor vit-färgning av en vild typ A. thaliana stam sektion som visar cellulosa avsättning i cellväggarna hos cellerna i överhuden, cortex, märg, interfascicular fibrer och xylem (A - E). Den positions i överhuden och cortex (Ep), är interfascicular fibrer (Fi), märg (Pi) och xylem (Xy) anges. Förstoringar: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D och E: 40X. Streck = 100 um.
Figur 6. Congo röd färgning av A. thaliana stam tvärsnitt. Congo röd färgning av en vild typ A. thaliana stam sektion som visar cellulosa avsättning i cellväggarna hos cellerna i överhuden, cortex, märg, interfascicular fibrer och xylem (A - E). Positionerna i överhuden och cortex (EP), interfascicular fibrer (Fi), märg (Pi) och xylem (XY) indikeras. Förstoringar: Panel A: 5X; Panel B Panel C: 20X; Paneler D och E: 40X. Streck = 100 um.
Figur 7. Toluidinblå O färgning av A. thaliana stem tvärsnitt. Toluidinblå O-färgning av en vild typ A. thaliana stam sektion som visar den normala ligninavsättning i väggarna av interfascicular fibrer och xylem celler (A - E). Positionerna i överhuden och cortex (EP), interfascicular fibrer (Fi), märg (Pi) och xylem (XY) indikeras. Förstoringar: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D och E: 40X. Streck = 100 um.
Tabell 1. Mikroskop och kamerans inställningar för avbildning. Riktlinjer för att arbeta med fluorescensfilter och ljusfält avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A. thaliana stjälksegment används allmänt för att studera organisationen av cellerna i den sekundära cellväggen och för att kvalitativt undersöka skillnaderna mellan vildtyp och transgena växter. De vanligen använda teknikerna för sektionering är proverna direkt hand skärning; eller när prover är inbäddade i agaros eller fixativ kan sektione göras med en vibratome eller mikrotom. I motsats till hands skärning, tillåta de två sista att minska risken för att producera felaktiga skillnader mellan prover som skulle helt enkelt orsakas av en dålig provberedning som orsakas av tjockleks skillnader mellan prov och ojämna ytor. Alla dessa metoder har sina för-och nackdelar. Vi valde att bädda in agaros, följt av sektionering med hjälp av en vibratome, och gjorde det av följande skäl: lättheten att bädda och tid i att använda agaros eliminerar behovet av genomarbetade bearbetning av färsk vävnad. Våra hembakade formar är även enkelt och billigt att tillverka, kan hålla the hejda rak, kan användas under många år, och kan hjälpa till att lätta frisättning av exemplar utan att göra en enda röra. Det bästa sättet att lösa hög procentandel agaros och få en homogen lösning (full upplösning av 7 g agaros i 100 ml utan att bilda chunky granulat) är att autoklav det eller att mikrovågsugn det på den lägsta intensitet. Det är viktigt att skära stammen vävnaden frisk, eller alternativt att förvara den i en platta placeras på is som innehåller ett filterpapper fuktas med vatten för att förhindra att vävnad uttorkning och deformation. Förvaring av stammen under längre tid än 30 minuter utan hög fuktighet gör att stammen att torka ut. Temperaturen på agaros precis innan skaftet är inbäddad bör vara cirka 50 ° C. Det är viktigt att kontrollera om det finns luftbubblor efter agarosen har hällt i flaskan, eftersom luftbubblor orsakar luckor i formen och följaktligen sektione blir ojämn. Luftbubblor kan avlägsnas snabbt och enkelt genom att man placerar lösningen under vakuum före hällden. Stammen bör placeras i agarosen när den fortfarande är mjuk och inte varmare än 50 ° C. Värmen kommer att skada provet genom shriveling skaftet och kommer att förstöra cellmorfologi. Om agaros är för kallt stammen inte kan tränga igenom agaros och inbäddning kommer inte att vara möjlig. Efter agaros inbäddning, kan stamceller proverna förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka.
Användning av en vibratome istället för handsektione ger exakt skära prover och bättre bildkvalitet. Alla säkerhetsinstruktioner ska läsas och följas när du använder en vibratome noggrant. Det är viktigt att säkerställa att den preparatskivan är ren och torr för att tillåta vävnaden lim för att hålla provet starkt på plats så att den inte faller av under snittning. Tjockleken på de prover specificeras för att tåla den hårda syra och bas-behandlingar under färgningsförfaranden. Den rakblad användes i vibratome bör vara helt plan för att säkerställa att den del skärs evenly. Sektione tar cirka 20 minuter per prov; i syfte att spara tid, kan liknande prover ska snittas i grupper på ett enda prov platta. Under snittning är sektionerna överföres från buffertfacket i en liten petriskål för att göra sektionerna lättare att se på en klar bakgrund och för att frigöra buffertmagasin för nästa prov. Sektioner kan omedelbart användas för nedströms färgningsförfaranden eller lagras för senare användning. Alikvotering de stjälksegment till 2,0 ml mikrocentrifugrör hjälper i priming för färgningsförfaranden. Att göra korrekta justeringar och inställningar på kameran och mikroskop är mycket kritiska för att uppnå hög kvalitet. Justering av Kohler belysning är en av de viktigaste stegen i att använda mikroskop. Justeringarna för bländare och ljusintensitet, som beskrivs i avsnittet om metoder, är avsedda endast som en riktlinje. De kan behöva modifieras beroende på mikroskop och kamera utnyttjas. Vi använde en högupplösandedigitalkamera med ett stort format interline CCD-chip och ingen mekanisk slutare för UV-avbildning, kalkofluor vit, och kongorött färgning; och en hög upplösning och hög hastighet färgkamera för ljus-fält bilder av Maule, floroglucinol och toluidinblått O färgning. Bilder analyserades, bearbetas och monteras med hjälp av vanliga bildbehandlingsprogram.
Fluoroglucinol är den vanligast använda fläck för ligninbestämningen; det är inte en sann lignin fläck eftersom det endast färgar kanelaldehyd slutgrupper. Den floroglucinol fläck, även känd som Weisner fläck, ger en karakteristisk körsbär rosa eller fuchsia färg i xylem och interfascicular fibrer när dessa aldehydgrupper finns närvarande fyra. Intensiteten hos den skära färgen varierar med graden av lignifikation. Även subtila skillnader är svårare att observera, är det lätt att upptäcka skillnader mellan vildtyp och mutant stjälksegment som har variationer i deras ligninhalt 19. Det är också EASy för att observera skillnader mellan yngre (mot stammen apex) och äldre (stam bas) vävnader, eftersom lignification nivåer mellan dessa vävnader varierar. Vanligtvis i vildtyp stam, gör cortex epidermis och märg innehåller cinnamaldehydes (alltså inte få färgade) om det inte finns ektopisk lignification 20. Maule fläck, å andra sidan, är specifik mot syringyllignin heter och kan användas för att skilja olika ligninanrikningar i S eller G-enheter (t.ex. fiber kontra xylem vävnad) 14,18. Den kaliumpermanganat och saltsyra akt på syringyl kärnan i S-enhet på lignin för att bilda en methoxycatechol och sedan mot metoxi-o-kinon följande reaktion med ammoniumhydroxid. Den Maule fläcken är en bra indikator för att differentiera mutanter som saknar eller är i stor utsträckning utarmat på S-enheter av lignin (t.ex. i A. thaliana F5H mutanter och allmänna gymnosperm växter), ger Maule gulbrun färg instead rött både i xylem och sclerenchyma 21. Av samma anledning kan Maule färgning användas för att differentiera angiospermer, som främst innehåller S lignin från gymnospermer som typiskt saknar S-enhet 18. Eftersom stark syra och bas används under floroglucinol och Maule färgningsförfaranden respektive experimentella åtgärder måste genomföras med försiktighet. Både koncentrerad HCl och ammoniumhydroxid är starka frätande; de kan försämras mikroskop scenen och lins om bilderna innehåller Ph-HCl och Maule färgade prover inte hanteras korrekt. De kan också torka upp snabbt, inom 5-10 minuter, vilket leder till prover att försämras, så att den avbildning som måste göras snabbt. Toluidinblå O är en polykromatisk färgning och färgar in olika komponenter i cellväggen i olika färger, eftersom det reagerar med olika kemiska komponenter i cellväggarna på olika sätt, vilket ger en flerfärgade prov. Färgerna som genereras kan provide uppgifter om vilken typ av cell. Toluidinblå O är också ett katjoniskt färgämne som binder till negativt laddade grupperna 5,6. En vattenhaltig lösning av denna färg är blå, men olika färger alstras när färgen binder med olika anjoniska grupper i cellen. Till exempel, färgerna är en röd purpur när färgämnet reagerar med karboxylerade polysackarider, såsom pektin; grön, grönblått, eller klarblå med aromatiska ämnen såsom lignin och tanniner; och lila eller grönblått med nukleinsyror. Färgningen är lätt och kan pågå i två dagar.
Kalkofluorvit fläckar cellulosa, callose och andra osubstituerad eller svagt substituerade β-glukaner 6-9 och kongorött fläckar direkt till β-(1 → 4)-glukaner och särskilt till cellulosa 8,10,11. Kalkofluor vita fläckar briljant epidermis, cortex och märg men det briljans minskar avsevärt i xylem och interfascicular fibrer. Det finns två possible förklaringar till den minskade fluorescens av kalkofluor vitt i starkt förvedade vävnader; man tillskriver det till förekomsten av lignin, vilket i sin tur minskar möjligheterna för kalkofluor vitt att sprida rätt igenom till polysackarider. En andra förklaring pekar på en partiell härdning av fluorescens som emitteras av den kalkofluor vita upphetsad under UV. I motsats till kalkofluorvit, Kongo röd färgning verkar påverkas mindre av närvaron av lignin. Det skulle kunna vara relaterad till skillnaden i fluorescensegenskaper mellan kalkofluor vit och kongorött; en bättre spridning förmåga kongorött igenom de förvedade vävnader än kalkofluor vit; eller en liten skillnad i polysackarid bindningsegenskaper 22. Det är viktigt att notera att de sektioner färgade med kongorött inte bör lagras alltför länge innan avbildning, eftersom Congo röd tenderar att få tvättas bort i vatten.
Även histokemisk färgning är varken kvantitativteller helt avgörande, kan den avslöja genom visuella referenser en mängd information om viktiga egenskaper som integritet vävnader eller onormal cellvägg nedfall och lignification. De färgningstekniker som beskrivs ovan är lätt att utföra och är tillämpliga för kritiska element i en växtcellvägg, såsom lignin och cellulosa. Däremot krävs immunofluorescens med hjälp av specifika antisera och monoklonala antikroppar för detektion av olika komponenter av hemicellulosa och pektin. Rapporten är tänkt att fungera som en primer för nybörjare inom sekundär cellvägg färgning som använder A. thaliana som sitt modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Sabin Russell för redigering hjälp. Detta arbete var en del av DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) som stöds av US Department of Energy, Office of Science, kontor för bio-och miljöforskning, genom kontrakt DE-AC02-05CH11231 mellan Lawrence Berkeley National Laboratory och det amerikanska energidepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W.
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
- Adler, E.
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S.
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
