Summary

Histokemisk farvning af<em> Arabidopsis thaliana</em> Sekundært Cell vægelementer

Published: May 13, 2014
doi:

Summary

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Abstract

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Introduction

Plantecellevæggen rummer et væld af oplysninger i sine forskellige komponenter: lignin, cellulose, hemicellulose (xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, blandet kobling glucan eller glucomannan), og pektin. Histologiske teknikker giver vigtige visuelle referencer i at studere forskellene inden for de sekundære cellevægge på organisatoriske og cellulære niveauer. Forskellige histologiske teknikker blev udviklet og kan findes i litteraturen, men disse teknikker kan være udfordrende og tidskrævende for begyndere, da meget detaljerede protokoller med simple visuelle instruktioner er sjældent om nogensinde tilgængelige. Målet med denne undersøgelse er at give enkle retningslinjer for histologiske farvningsteknikker at opnå billeder af høj kvalitet.

Sektionering stilken væv er det første skridt i visualisering af cellevægge og celle figurer. Selvom hånd-cut sektioner er billig og tage mindre tid til at forberede, brug af en vibratome giver konsistens oggiver billeder i høj kvalitet. Ved hjælp af en vibratome tillader at producere en bedre datakvalitet ved at generere endda sektioner med samme tykkelse, som hjælper med at producere skarpe billeder og reducerer risikoen for at producere unøjagtige forskelle mellem prøver, der ville simpelthen forårsaget af en dårlig prøveforberedelse. Brug harpiks til at fastsætte friske prøver kan være en udfordring for begyndere og kan stadig være tidskrævende selv for eksperter, når en analyse skal gøres hurtigt. Desuden bliver det muligt at måle enhver biologisk aktivitet med prøven, når den er indlejret i en harpiks. En simpel teknik, der anvender agarose og en hjemmelavet formen er nyttig for indlejring stamceller væv, og det kan også anvendes i andre applikationer, der kræver dissektion af det bløde væv. Sammenlignet med indlejring prøver i harpiks, har denne fremgangsmåde den fordel, at holde væv i live og reducere prøve manipulation. Sektionering væv via en vibratome er meget præcis og genererer homogenskellige sektioner, som, afhængigt af formålet med undersøgelsen, så kan anvendes med flere forskellige farvningsteknikker.

De enkleste metoder til at visualisere lignin og andre aromater ansætte ultraviolet (UV) lys. Excitation af aromatiske molekyler med UV-lys er en gammel teknik, men det er stadig en af ​​de hurtigste metoder til visualisering af lignin. Men UV visualisering faktisk ikke er ideel til lignin detektion, fordi UV-lys vil excitere andre aromater. Lignin består primært af tre byggesten, de monolignols (hydroxycinnamyl alkoholer: coniferyl alkohol, sinapyl alkohol, og p-coumaryl alkohol) 1-3. Phloroglucinol plet kan give et fingerpeg om omfanget af cinnamaldehydes stede i veddet, fibre og luftrør væv 4.. Phloroglucinol er en god indikator for generelle cinnamaldehydes og kan skelne mellem cinnamaldehydes og andre aromater. De sinapyl alkohol monomerer kan påvisesog differentieres ved anvendelse af Maule pletten. Toluidinblåt O er en polykromatisk farvestof og har derfor evnen til at farve forskellige elementer i cellevæggen i forskellige farver 5,6. Den primære anvendelse af toluidinblåt O er at detektere pektin og lignin 5,6. Fordelen ved anvendelse af toluidinblåt O er, at mange elementer af cellevæggen kan visualiseres i et enkelt trin. Både Calcofluor hvid og congorødt er let at arbejde med og kan anvendes til at visualisere cellulose. Calcofluor hvide pletter cellulose, callose, og andre ikke-substituerede eller svagt substituerede β-glucaner 6-9, mens congorødt pletter direkte til β-(1 → 4)-glucaner og især cellulose 10,11. Målet med denne undersøgelse er at give enkle retningslinjer for brugen af de førnævnte farvningsteknikker at opnå billeder af høj kvalitet fra A. thaliana stængler.

Protocol

1.. Stem Embedding Lav en 7% agaroseopløsning i vand (7 g elektroforese-agarose i 100 ml destilleret vand). Opløses agarosen ved autoklavering i 20 minutter eller ved mikrobølgeovn i 20 minutter ved laveste intensitet (f.eks 10% intensiteten af en 1.250 watt mikrobølgeovn). Forbered en hjemmelavet støbeform for indlejring stænglerne ved hjælp af plast hætteglas. Ved hjælp af et barberblad, afbrød den koniske bund af en 2 ml skruelåg mikrocentrifugerør (del A). Med en ka…

Representative Results

Stem Indlejring og Sektionsinddeling: Brugen af den hjemmelavede plast støber at integrere stænglerne i 7% agarose vist sig at være hurtig og let (figur 1). De to dele (A og B, figur 1) den integrerede hætteglas systemet gør det nemt at nemt slipper stilken indlejret i agarose som agarose ikke klæber til hætteglassets dele, som er inaktiv, holde systemet rent. Hætteglassene kan genbruges flere gange i årevis. Den bekvemmelighed for at lagre den integrerede stilken gør o…

Discussion

A. thaliana stamceller sektioner er almindeligt anvendt til at undersøge organiseringen af cellerne i den sekundære cellevæg og kvalitativt undersøge forskellene mellem vildtype og transgene planter. De almindeligt anvendte teknikker til skæring er prøverne direkte hånd opskæring; eller når prøver er indlejret i agarose eller fiksativ, kan sektionering gøres med en vibratome eller mikrotom. I modsætning til hånd skæring, tillader de to sidste mindske risikoen for at producere unøjagtige forskelle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for Sabin Russell til redigering assistance. Dette arbejde var en del af DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org), støttet af det amerikanske Department of Energy, Office of Science, Kontoret for Biologiske og Miljøforskning gennem kontrakt DE-AC02-05CH11231 mellem Lawrence Berkeley National Laboratory og US Department of Energy.

Materials

 Agarose EMD MERC2125 CAS Number: 9012-36-6
Phloroglucinol Sigma P 3502 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]
Hydrochloric Acid EMD HX0603-75 CAS Number: 7647-01-0
Ammonium hydroxide EMD AX1303-6 CAS Number: 1336-21-6
Toulidine Blue O Sigma T3260 Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] 
Potassium permanganate Sigma 223468 CAS Number 7722-64-7 
Ethanol 190 proof KOPTEC V1401 CAS Number: 64-17-5
Congo Red Sigma  C6277 Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ]
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain Sigma F3543  4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] 
Vibratome Leica Leica Vibrating blade microtome VT1000S http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
Razor American Safety razor company Item # 60-0139-0000  Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml) VWR 16466-044
Microcentrifuge Tubes (0.6ml) Axygen Scientific MCT-060-C
Mitt Bel-Art 380000000 SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue adhesive  Ted Pella Inc 10033 Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer  storage 
Microwave Panasonic NN-SD762S PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive 
Camera with CCD chip with no mechanical shutter  Hamamatsu C4742-95
High speed color camera    QImaging MicroPublisher 5.0 RTV
Camera software   Molecular Devices MetaMorph version 7.7.0.0
Imagining anaylsis  Adobe  Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, Square, No.1 VWR 48366-067 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm. 
Frosted Micro Slides, 1mm VWR 48312-003 75 x 25 mm- 1mm
TX2 Filter cube Leica 11513851/11513885 Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.
Parafilm M Alcan packaging BRNDPM998

References

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  2. Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
  3. Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
  4. Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
  5. Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
  6. Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
  7. Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
  8. Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
  9. Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
  10. Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
  11. Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
  12. Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  13. Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. . The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , (1992).
  14. Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
  15. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
  16. Yeung, E. A beginner’s guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
  17. Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
  18. Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
  19. Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
  20. Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
  21. Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
  22. Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).

Play Video

Cite This Article
Pradhan Mitra, P., Loqué, D. Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements. J. Vis. Exp. (87), e51381, doi:10.3791/51381 (2014).

View Video