Histokemisk farvning af<em> Arabidopsis thaliana</em> Sekundært Cell vægelementer

Summary

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Abstract

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Introduction

Plantecellevæggen rummer et væld af oplysninger i sine forskellige komponenter: lignin, cellulose, hemicellulose (xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, blandet kobling glucan eller glucomannan), og pektin. Histologiske teknikker giver vigtige visuelle referencer i at studere forskellene inden for de sekundære cellevægge på organisatoriske og cellulære niveauer. Forskellige histologiske teknikker blev udviklet og kan findes i litteraturen, men disse teknikker kan være udfordrende og tidskrævende for begyndere, da meget detaljerede protokoller med simple visuelle instruktioner er sjældent om nogensinde tilgængelige. Målet med denne undersøgelse er at give enkle retningslinjer for histologiske farvningsteknikker at opnå billeder af høj kvalitet.

Sektionering stilken væv er det første skridt i visualisering af cellevægge og celle figurer. Selvom hånd-cut sektioner er billig og tage mindre tid til at forberede, brug af en vibratome giver konsistens oggiver billeder i høj kvalitet. Ved hjælp af en vibratome tillader at producere en bedre datakvalitet ved at generere endda sektioner med samme tykkelse, som hjælper med at producere skarpe billeder og reducerer risikoen for at producere unøjagtige forskelle mellem prøver, der ville simpelthen forårsaget af en dårlig prøveforberedelse. Brug harpiks til at fastsætte friske prøver kan være en udfordring for begyndere og kan stadig være tidskrævende selv for eksperter, når en analyse skal gøres hurtigt. Desuden bliver det muligt at måle enhver biologisk aktivitet med prøven, når den er indlejret i en harpiks. En simpel teknik, der anvender agarose og en hjemmelavet formen er nyttig for indlejring stamceller væv, og det kan også anvendes i andre applikationer, der kræver dissektion af det bløde væv. Sammenlignet med indlejring prøver i harpiks, har denne fremgangsmåde den fordel, at holde væv i live og reducere prøve manipulation. Sektionering væv via en vibratome er meget præcis og genererer homogenskellige sektioner, som, afhængigt af formålet med undersøgelsen, så kan anvendes med flere forskellige farvningsteknikker.

De enkleste metoder til at visualisere lignin og andre aromater ansætte ultraviolet (UV) lys. Excitation af aromatiske molekyler med UV-lys er en gammel teknik, men det er stadig en af ​​de hurtigste metoder til visualisering af lignin. Men UV visualisering faktisk ikke er ideel til lignin detektion, fordi UV-lys vil excitere andre aromater. Lignin består primært af tre byggesten, de monolignols (hydroxycinnamyl alkoholer: coniferyl alkohol, sinapyl alkohol, og p-coumaryl alkohol) ^1-3. Phloroglucinol plet kan give et fingerpeg om omfanget af cinnamaldehydes stede i veddet, fibre og luftrør væv ^4.. Phloroglucinol er en god indikator for generelle cinnamaldehydes og kan skelne mellem cinnamaldehydes og andre aromater. De sinapyl alkohol monomerer kan påvisesog differentieres ved anvendelse af Maule pletten. Toluidinblåt O er en polykromatisk farvestof og har derfor evnen til at farve forskellige elementer i cellevæggen i forskellige farver ^5,6. Den primære anvendelse af toluidinblåt O er at detektere pektin og lignin ^5,6. Fordelen ved anvendelse af toluidinblåt O er, at mange elementer af cellevæggen kan visualiseres i et enkelt trin. Både Calcofluor hvid og congorødt er let at arbejde med og kan anvendes til at visualisere cellulose. Calcofluor hvide pletter cellulose, callose, og andre ikke-substituerede eller svagt substituerede β-glucaner ^6-9, mens congorødt pletter direkte til β-(1 → 4)-glucaner og især cellulose ^10,11. Målet med denne undersøgelse er at give enkle retningslinjer for brugen af de førnævnte farvningsteknikker at opnå billeder af høj kvalitet fra A. thaliana stængler.

Protocol

1.. Stem Embedding Lav en 7% agaroseopløsning i vand (7 g elektroforese-agarose i 100 ml destilleret vand). Opløses agarosen ved autoklavering i 20 minutter eller ved mikrobølgeovn i 20 minutter ved laveste intensitet (f.eks 10% intensiteten af en 1.250 watt mikrobølgeovn). Forbered en hjemmelavet støbeform for indlejring stænglerne ved hjælp af plast hætteglas. Ved hjælp af et barberblad, afbrød den koniske bund af en 2 ml skruelåg mikrocentrifugerør (del A). Med en ka…

Representative Results

Stem Indlejring og Sektionsinddeling: Brugen af den hjemmelavede plast støber at integrere stænglerne i 7% agarose vist sig at være hurtig og let (figur 1). De to dele (A og B, figur 1) den integrerede hætteglas systemet gør det nemt at nemt slipper stilken indlejret i agarose som agarose ikke klæber til hætteglassets dele, som er inaktiv, holde systemet rent. Hætteglassene kan genbruges flere gange i årevis. Den bekvemmelighed for at lagre den integrerede stilken gør o…

Discussion

A. thaliana stamceller sektioner er almindeligt anvendt til at undersøge organiseringen af cellerne i den sekundære cellevæg og kvalitativt undersøge forskellene mellem vildtype og transgene planter. De almindeligt anvendte teknikker til skæring er prøverne direkte hånd opskæring; eller når prøver er indlejret i agarose eller fiksativ, kan sektionering gøres med en vibratome eller mikrotom. I modsætning til hånd skæring, tillader de to sidste mindske risikoen for at producere unøjagtige forskelle…

Materials

Agarose	EMD	MERC2125	CAS Number: 9012-36-6
Phloroglucinol	Sigma	P 3502	1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]
Hydrochloric Acid	EMD	HX0603-75	CAS Number: 7647-01-0
Ammonium hydroxide	EMD	AX1303-6	CAS Number: 1336-21-6
Toulidine Blue O	Sigma	T3260	Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9]
Potassium permanganate	Sigma	223468	CAS Number 7722-64-7
Ethanol 190 proof	KOPTEC	V1401	CAS Number: 64-17-5
Congo Red	Sigma	C6277	Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ]
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain	Sigma	F3543	4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7]
Vibratome	Leica	Leica Vibrating blade microtome VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
Razor	American Safety razor company	Item # 60-0139-0000	Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml)	VWR	16466-044
Microcentrifuge Tubes (0.6ml)	Axygen Scientific	MCT-060-C
Mitt	Bel-Art	380000000	SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue adhesive	Ted Pella Inc	10033	Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer  storage
Microwave	Panasonic	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive
Camera with CCD chip with no mechanical shutter	Hamamatsu	C4742-95
High speed color camera	QImaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Camera software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.0.0
Imagining anaylsis	Adobe	Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, Square, No.1	VWR	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm.
Frosted Micro Slides, 1mm	VWR	48312-003	75 x 25 mm- 1mm
TX2 Filter cube	Leica	11513851/11513885	Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.
Parafilm M	Alcan packaging	BRNDPM998