Introduction
Anlegget celleveggen består av en overflod av informasjon innenfor sine ulike komponenter: lignin, cellulose, hemicellulose (Xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, blandet kopling glukan, eller Glucomannan), og pektin. Histologiske teknikker gir viktige visuelle signaler i å studere forskjeller innenfor de sekundære celleveggene på organisatoriske og cellulære nivåer. Ulike histologiske teknikker ble utviklet og kan finnes i litteraturen, men disse teknikkene kan være utfordrende og tidkrevende for nybegynnere, fordi svært detaljerte protokoller med enkle visuelle instruksjoner er sjelden eller aldri tilgjengelig. Målet med denne studien er å gi enkle retningslinjer for histologiske flekker teknikker for å få bilder av høy kvalitet.
Seksjonering stammen vev er første skritt i visualisering av cellevegger og celleformer. Selv om hånd-kutt seksjoner er billig og tar mindre tid å forberede, bruk av en vibratome tilbyr konsistens oggir bilder av høy kvalitet. Ved hjelp av en vibratome tillater produksjons bedre datakvalitet ved å generere enda seksjoner med samme tykkelse, noe som bidrar til å produsere skarpe bilder, og reduserer risikoen for å produsere unøyaktige forskjeller mellom prøvene som ville være ganske enkelt skyldes et dårlig prøveopparbeidelse. Ved hjelp av harpiks for å fikse ferske prøver kan være en utfordring for nybegynnere og kan fortsatt være tidkrevende selv for eksperter når en analyse må gjøres raskt. I tillegg, blir det umulig å måle noen biologisk aktivitet med prøven når den er blitt innleiret i en harpiks. En enkel teknikk som syssels agarose og en hjemmelaget mold er nyttig for innebygging stamceller, og det kan også benyttes i andre applikasjoner som krever disseksjon av bløtvev. Sammenlignet med innstøping prøvene i harpiks, har denne metoden den fordel av å holde vevet i live og reduserende prøve manipulasjon. Seksjonering vev via en vibratome er svært presis og genererer homogenlige seksjoner, som, avhengig av målet for undersøkelsen, så kan brukes sammen med flere forskjellige fargingsteknikker.
De enkleste metodene for å visualisere lignin og andre aromater ansette ultrafiolett (UV) lys. Eksitasjon av aromatiske-baserte molekyler med UV-lys er en gammel teknikk, men det er fremdeles en av de raskeste metoder for visualisering av lignin. Men UV visualisering faktisk er ikke ideelt for lignin påvisning fordi UV-lys vil opphisse andre aromater. Lignin består i hovedsak av tre byggeklosser, de monolignols (hydroxycinnamyl alkoholer: coniferyl alkohol, sinapyl alkohol, og p-coumaryl alkohol) 1-3. Phloroglucinol flekken kan gi ledetråder til omfanget av cinnamaldehydes stede i margen, fiber, og tracheal vev fire. Phloroglucinol er en god indikator på generelle cinnamaldehydes og kan skille mellom cinnamaldehydes og andre aromater. De sinapyl alkohol monomerer kan oppdagesog differensiert ved anvendelse av Maule flekken. Toluidinblått O er en polykromatisk fargestoff, og derfor har evne til å farge ulike elementene i celleveggen i forskjellige farger 5,6. Den primære bruk av toluidin blå O, er å detektere pektin og lignin 5,6. Fordelen ved bruk av toluidin blå O, er at mange deler av celleveggen kan visualiseres i et enkelt trinn. Både calcofluor hvitt og Congo rødt er lett å arbeide med, og kan brukes til å visualisere cellulose. Calcofluor white flekker cellulose, callose, og andre ikke-substituerte eller substituerte svakt β-glukaner 6-9, mens kongo røde flekker direkte til β-(1 → 4)-glukaner, og spesielt til cellulose 10,11. Målet med denne studien er å gi enkle retningslinjer for bruk av de nevnte fargeteknikker for å få bilder av høy kvalitet fra A. thaliana stengler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Stem Embedding
- Gjør en 7% agarose-løsning i vann (7 g av elektroforese-grade agarose i 100 ml destillert vann). Oppløs agarose ved autoklavering i 20 min eller ved mikrobølgeovnen i 20 min ved lavest intensitet (f.eks, 10% intensiteten av en 1250 watts mikrobølgeovn).
- Forbered en hjemmelaget mold for innebygging stilkene ved hjelp av plasthetteglass.
- Ved hjelp av et barberblad, avskåret konisk bunn av en 2 ml skrulokk mikrosentrifugerør (del A). Med en sprøytenål, punktere et hull i korken er litt større enn diameteren av stammen som skal bygges inn. Deretter skjærer 0,5 cm ved bunnen av et 0,6 ml mikrosentrifuge-rør (del B).
- Tilsett cut-off 0,5 cm parti av 0,6 ml mikrosentrifugerør i den etikettpapir 2 ml mikrosentrifugerør. Forsegle de to delene med Parafilm (Figur 1). MERK: Bunnen av røret er skåret for å lette fjerningen av den innebygde prøven etter agarose har stivnet. THan hull i hetten vil hjelpe til å holde spindelen i ro når stammen er innleiret i agarose. Formen vil tjene til å holde agarose og holde stammen rett ved innebygging. Den Parafilm vil holde de to deler, A og B, inntil agarose er satt, og stammen er innleiret.
- Ved hjelp av et barberblad, kuttet en stilk-delen fra området av interesse, (f.eks midten av første stilk internode). MERK: Ideelt sett bør stammen kuttes rett før embedding å unngå ødeleggelse av dehydrering. Alternativt kan stammen være midlertidig lagret i en plate inneholdende et filterpapir fuktet med vann. Denne plate kan plasseres på is inntil de er klare til å bli forankret for å forhindre vev dehydrering og deformasjon. Lagring av stammen for perioder lengre enn 30 min uten høy fuktighet vil føre til at stammen til å tørke ut.
- Smelt agarose i mikrobølgeovnen ved lav intensitet. FORSIKTIG: Flasken inneholder agarose kan være varmt. Bruk en mitt å plukke opp flasken. La de smeltet agarose stand ved romtemperatur (mellom 20 ° C og 25 ° C) inntil den avkjøles til omtrent 50 ° C.
- Sakte pipette 5 ml agarose inn i forhåndslagde plast mold å fylle flasken. MERK: Pass på at det ikke er luftbobler i formene. Luftbobler vil forårsake hull i agarose mugg og vil ikke helt dekker stammen prøven, som til slutt vil føre til ujevn skjæring av prøven seksjoner.
- La agarose kjøle ned i 30 til 60 sekunder å bli semisolid. Test med en liten tannpirker, og pass på at det kan trenge inn og stå opp, men ikke flyte, i agarose. MERK: Hvis stammen er plassert når agarose er fortsatt varmt det vil skade prøven ved shriveling stammen, ødelegge cellemorfologi.
- Plasser stammen i denne agarose-fylte hetteglass. Sørg for at stammen holder seg rett. Plasser det perforerte lokk på en slik måte at spissen av spindelen holdes av hetten. Ikke skru skruen-on cap. En tid mer enn en stamme (av en enkelt type) kan være embedded i en enkelt hetteglass; men i det aktuelle tilfellet, må du ikke bruke hetten. MERK: Hvis skrulokk er slått, vil stammen få vridd.
- La flasken ved romtemperatur eller ved 4 ° C i 10-30 minutter, inntil det størkner.
- Fjern formen ved forsiktig å skyve den ut av røret. Åpne Parafilm. Skyv bunnen av del B av formen forsiktig med tommelen for å frigjøre den størknet agarose fra del A på et glass objektglass.
- Skjær agarose innebygd stammen i tre omtrent like store biter av 1,2 cm i lengde. Skjær ut den delen av stammen som ikke var i agarose og kast den.
- Oppbevar disse delene av agarose med den innebygde stammer i lufttett 2 ml mikrosentrifugerør i en mørk boks ved 4 ° C til den er klar til seksjonen. Alternativt kan lagre rørene ved 4 ° C i maksimalt en uke. MERK: Lagring er mulig, men eksperimentator må være klar over at den innebygde stilkene er fortsatt i live, og, avhengig av forsøket, Gjenstander kan potensielt bli introdusert.
2. Stem Seksjonering
- FORSIKTIG: Les vibratome bruksanvisningen nøye og følg alle sikkerhetsregler.
- Kontroller at prøveplaten er ren og helt tørr (fri for fast eller flytende). Rengjør prøveplaten med et barberblad for å fjerne eventuelle rester av lim fra tidligere eksperimenter og vask med vann. Tørk med et papirhåndkle. MERK: Dette vil sikre at limet fungerer godt, og binder seg til agarose prøven. Hvis dette ikke er gjort på riktig måte, er det mulig at prøven ikke kan forholde seg til platen, og vil senere føre til at prøven å falle av platen under seksjonering.
- Bruk myk papirhåndklær for å fjerne eventuell fuktighet fra agarose blokk inneholdende prøvestykkene.
- Plasser en liten dråpe av vev lim på prøveplaten. Serie ut limet til å dekke det området i midten av platen ved hjelp av tuppen av limet flasken. Raskt stedagarose blokken slik at prøvene er enten vinkelrett på eller parallelt med platen for tverrgående eller langsgående tverrsnitt, henholdsvis. La limet løse prøven i prøveplaten ved romtemperatur eller ved 4 ° C i 10-30 min. MERK: Dette er en tid-sensitive trinn.
- Fest prøveplaten på plass på bufferbrettet eller trau. Blokk-/ s av agarose med seksjonene skal være parallelt med barberblad. Fyll opp buffer brett med destillert vann ved romtemperatur inntil prøvene er helt neddykket.
- Skjær et barberblad i to og deretter trim endene med en solid saks slik at bladet holder seg helt flat. Fest den ene halvparten av precut barberblad på knivholderen.
- Sett vinkelen på knivholderen til 84 °, hastigheten til 0,90 mm / sek (posisjon 8 på vibratome) og frekvens til 50 Hz (posisjon 5 på vibratome). Snitt på 100 mikrometer tykkelse. Bruk kontinuerlig modus. NOTE: Denne tykkelse er valgt for å sikre at vevet kan motstå de forskjellige syre-og basebehandlinger brukes i noen av de farge protokoller. Sett vinduet for seksjonering og tillate 15-20 min på en kontinuerlig modus for vibratome § en agarose blokk på ca 1,2 cm.
- Samle delene ved hjelp av en engangs plast pipette under snitting i bufferbrettet. Alternativt kan seksjonene overføres fra buffermagasinet inn i et glassbeger og deretter til en klar Petri-plate. Overfør få deler til de 2,0 ml mikrosentrifugerør. Merk: Prøvene er hentet fra en Petri plate fordi det er lettere å se avsnittene om en klar bakgrunn, og fordi bufferbrettet kan primes for de neste prøven.
- Seksjonene kan være lagret i et 50 ml rør eller samlet og lagret i 1,5 til 2 ml mikrosentrifugerør ved 4 ° C i 30 til 60 min. MERK: Lagring seksjonene for lengre perioder vil føre til dårlig bildekvalitet.
Tre. Mikroskop og kamerainnstillingen for Imaging
- Juster Köhler-belysning på mikroskopet. Velg et mål. Fokuser på prøven først. Bring lysintensiteten til halvparten eller mindre. Lukk feltblenderen (FD) og blenderåpning (AP) eller ta den med til lavest mulig innstilling på det aktuelle målet.
- Jo høyere forstørrelse, jo større ringen vil bli. Bruk kondensatoren fokus knotten å fokusere felt iris så kraftig som mulig.
- Sakte bringe bildet av felt iris (sekskant-formet liten ring) til sentrum ved hjelp av kondensator-sentre knotter (PIN-formet skruer rundt kondensatoren). Øk membranen (FD) slik at felt iris når kanten. Slutt øke FD like etter at feltet iris har passert kanten.
- Sakte øke blenderåpning (AP) for å justere kontrasten. Juster lysintensiteten etter behov. MERK: Koehler belysning må justeres for hver objective, hver eksperimentell dag. Merk tallene innhentet etter justering for dagen. Disse tallene vil bli gjenbrukt hver gang at målene blir slått frem og tilbake for den aktuelle dagen.
- Justere blenderåpningen, intensitet, eksponeringstid, gevinst, og filtre som beskrevet i tabell 1. Denne informasjonen bør bare brukes som en veiledning.
- Bruk en høyoppløselig digitalt kamera med et stort format interline CCD-brikke uten mekanisk lukker for å fange fluorescens bilder; og en høy oppløsning, høyhastighetskamera for lyse-feltet bilder.
- Behandle lysbilder ved hjelp av standard programvare. Last inn programvaren. Klikk på "Hent" og "Still kamera / bord", velg deretter kameraet som skal brukes. Klikk "OK." Klikk "Hent" etterfulgt av "kategorien Farge." Under "kategorien Farge," velg "Bayer-metoden" etterfulgt av "Gjennomsnittlig fire." Legg den foreslåtte gevinst (rød, grønn, blå) from Tabell 1.. Velg "Set redde" og klikk på den katalogen hvor bildene skal lagres. Sett "Exposure time" fra forslagene i tabell 1. Sett "Binning" på "1" og "Live-binning" at "en." Fokus på regionen av interesse, og klikk deretter på "Lagre levende."
- Output bilder i kameraet programvare er i "TIF" format. Analysere bildene for histokjemi av celletyper. Bruk standard programvare for nedstrøms bruk av presentasjon og publisering.
4. Ultrafiolett og Bright-feltet Imaging
- Bruk en 1 ml-pipette med pipettespissen snitt slik at delene kan pipetteres ut lett. Forsiktig pipette seksjoner i spissen og videre til et objektglass. Dekk seksjoner med et dekkglass. Observer avsnittene under UV lys eller lyse-feltet belysning.
5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Farging 12
- Oppløs 0,3 g floroglucinol i 10 ml absolutt etanol for å forberede en 3% phloroglucinol løsning. Bland en del av konsentrert HCl (37 N) til to volumer av 3% phloroglucinol i etanol; denne løsningen er floroglucinol-HCl (Ph-HCl) eller Wiesner flekken. Merk: Denne løsningen skal gjøres fersk på dagen for farging og kan ikke lagres, fordi løsningen vil avta over tid og fargingen vil bli ineffektive. FORSIKTIG: HCl er sterkt etsende, så bruk ekstrem forsiktighet ved håndtering av Ph-HCl flekken.
- Overfør stilk seksjoner til en 2,0 ml mikro tube. Tilsett 1 ml av Ph-HCl-løsning til røret inneholdende seksjoner, og toppen av det umiddelbart fordi HCl i Ph-HCl-flekken er sterkt etsende. Forsiktig flytte røret for å sikre at alle delene er farget. Et alternativ til dette trinnet er å holde korken åpnes, slik at pH-HCl-løsning kan bli pipettert opp og ned, fortrinnsvis uten å forstyrre seksjoner. MERK: Vær forsiktig så du ikke å pipettere seksjonene i pipettespissen, da dette kan skade disse avsnittene.
- Bruk en 1 ml-pipette med pipettespissen kuttet på en slik måte at delene kan pipetteres ut lett uten skade. Forsiktig pipette seksjoner inn i tuppen og på et objektglass. Dekk seksjoner med dekkglass. Observer seksjonene etter lyse-feltet belysning. MERK: Ph-HCl løsning tørker opp i 5-10 min, forårsaker en forverring av prøvene. Derfor har tenkelig å være fullført i løpet av denne tidsperiode.
6. Maule Farging 13,14
- Oppløs 0,2 g kaliumpermanganat i 40 ml destillert vann for å lage en 0,5% kaliumpermanganat-løsning. Lagres i en mørk flaske ved værelsetemperatur i inntil 7 dager.
- Tilbered en 3,7% HCl-oppløsning ved tilsetning av 1 ml konsentrert HCl (37 N) til 9 ml destillert vann (1:10). Forbered en frisk 3,7% HCl løsning pådag av eksperimentet. Sørg for at den 37 N HCl stamløsning som brukes er ikke for gammel. Konsentrert ammonium-hydroksyd-oppløsning (14,8 M) bør lagres ved 4 ° C for å hindre at molariteten av den mettede oppløsning fra avtagende.
- Overfør stilk seksjoner til en 2,0 ml mikro tube. Tilsett 1 ml av den 0,5% kaliumpermanganat-løsning til røret inneholdende delene.
- Pipetter 0,5% kaliumpermanganat løsning opp og ned forsiktig, helst uten å forstyrre seksjonene. Inkuber i 2 min, og gjenta pipettering. La mikrosentrifuge tube stå til alle seksjonene slå seg ned. MERK: Vær forsiktig så du ikke å pipettere seksjonene i pipettespissen som seksjonene kan bli skadet. Det kan være vanskelig å se stammen seksjoner som løsningen er mørkt, så hold røret med avsnittene om reagensrør rack og tillate dem å betale for 2 min.
- Ved hjelp av en 1 ml pipette, trekke ut 700 mL av 0,5% kaliumpermanganat løsning.Til 700 mL av destillert vann for å skylle ut kaliumpermanganat-løsning. Gjenta 3-4x eller inntil vannløsningen forblir klart.
- Kast vannet. Raskt legge 1 ml 3% HCl inntil en dyp brun farge blir sluppet ut fra seksjonene. Dette kan skje i løpet av 3-5 minutter, eller kan kreve to vasker av fem minutter hver. Pipetter ut alle de 3% HCl-løsning og umiddelbart videre til neste trinn.
- Tilsett 1 ml konsentrert ammonium-hydroksyd-løsning. Bruk en 1 ml-pipette med spissen kuttet på en slik måte at delene kan pipetteres ut lett uten skade. Forsiktig pipette seksjoner inn i tuppen og på et objektglass. Dekk seksjoner med et dekkglass. Observer seksjonene etter lyse-feltet belysning. FORSIKTIG: Fordi ammonium hydroksid er svært etsende, det krever ekstra omsorg og oppmerksomhet for å unngå korrosjon på scenen av mikroskop eller objektivet. MERK: De ammonium hydroksid røyk kan tåke dekkglass, noe som gjør det vanskelig å observere prøven. Vær derfor ekstra forsiktig før du legger dekkglass. Løsningen tørker opp i 5-10 min, så bilde må være ferdig innen den tid.
7. Congo Red Farging 11,15
- Oppløs 0,5 g Congo rødt i 100 ml destillert vann for å fremstille en 0,5% congo rød løsning.
- Overfør stilk seksjoner til en 2,0 ml mikro tube. Tilsett 1 ml av den 0,5% congo røde oppløsningen til røret. Forsiktig pipette på 0,5% congo rød løsning opp og ned uten å forstyrre seksjonene. MERK: Vær forsiktig så du ikke å pipettere seksjonene i pipettespissen som dette kan skade delene.
- Inkuber ved romtemperatur i 10 min og gjenta pipettering. Følg med et annet 3 minutter med inkubering ved værelsetemperatur.
- Bruk en 1 ml pipette å trekke ut 700 mL av 0,5% congo rød løsning. Legg 700 mL destillert vann for å skylle ut congo rød løsning. Gjenta vask 3-4x inntil vaskevanneter klar.
- Bruk en 1 ml-pipette med sin spiss snitt på en slik måte at delene kan pipetteres ut lett uten skade. Forsiktig pipette seksjoner inn i tuppen og på et objektglass, og dekk dem med dekkglass. Observer prøvene på objektglass under blå-lys eksitasjon ved hjelp av et filter med en båndpass av 560/40. MERK: Ikke oppbevar de avsnittene i vann for lenge før den mikroskopisk analyse, som vannet vil vaske ut congo rød i 10-30 min.
8. Calcofluor Hvit Farging 9
- Oppløs 0,02 g av fluorescerende hvitemiddel 28 (calcofluor hvitt M2R) i 10 ml destillert vann for å lage en 0,2% stamløsning. Den 0,2% 's oppløsning kan lagres i et halvt år i en mørk flaske ved 4 ° C. Tilbered en fungerende løsning på 0,02% ved å fortynne 0,2% stamløsning 10x med destillert vann.
- Overfør stilk seksjoner til en 2,0 ml mikro tube. Legg til rør 1 ml av 0,02% calcofluor hvit løsning. Forsiktig pipette på 0,02% calcofluor hvit løsning opp og ned. MERK: Vær forsiktig så du ikke å pipettere seksjonene i pipettespissen som dette kan skade delene.
- Inkuber ved romtemperatur i 5 min og gjenta pipettering. Inkuber-delen for en annen 3 min ved romtemperatur. BEMERK: Tillat seksjonene til å slå seg ned på bunnen av røret for å gjøre det lettere å pipettere løsningen ut uten å skade delene.
- Bruk en 1 ml pipette å trekke ut 700 mL av 0,02% calcofluor hvit løsning og legge 700 mL destillert vann; vente 5 min for å skylle ut calcofluor hvit løsning. Gjenta vaske 3-4x. Bruk en 1 ml-pipette med pipettespissen kuttet på en slik måte at delene kan pipetteres ut lett uten skade.
- Forsiktig pipette seksjoner inn i tuppen og på et objektglass og dekk dem med et dekkglass. Observer avsnittene under UV lys.
9. Toluidine Blue O Farging 16,17
- Oppløs 0,02 g toluidinblått O i 100 ml destillert vann for å lage en 0,02% løsning. MERK: toluidinblått O-løsning kan lagres i to uker i en mørk flaske ved romtemperatur.
- Overfør stilk seksjoner til en 2,0 ml mikro tube. Tilsett 1 ml av 0,02% toluidinblått O-løsning til røret. Forsiktig pipette på 0,02% toluidinblått O løsningen opp og ned. Deretter inkuberes ved romtemperatur i 5 min og gjenta pipettering gang. MERK: Vær forsiktig så du ikke å pipettere seksjonene i pipettespissen som dette kan skade delene. La mikrosentrifuge tube stå i ro inntil seksjonene slå seg ned. Dette kan være vanskelig å se, slik at løsningen er mørkt, så holder røret inneholdende avsnittene om reagensrør stativ og tillate dem å sedimentere i 2 min ved romtemperatur.
- Bruk en 1 ml pipette å trekke ut 700 mL av 0,02% toluidinblått O løsning. Legg 700 mL destillert vann for å skylle ut toluidinblått O solution. Gjenta 3-4x eller inntil vaskeløsningen er klar. Bruk en 1 ml-pipette med pipettespissen kuttet på en slik måte at delene kan pipetteres ut lett uten å skade dem.
- Forsiktig pipette seksjoner inn i tuppen og på et objektglass og dekk dem med et dekkglass. Observer seksjonene etter lyse-feltet belysning.
- Juster Köhler-belysning på mikroskopet. Velg et mål. Fokuser på prøven først. Bring lysintensiteten til halvparten eller mindre. Lukk feltblenderen (FD) og blenderåpning (AP) eller ta den med til lavest mulig innstilling på det aktuelle målet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stem Inkludering og Seksjonering:
Bruken av den hjemmelagde plast mold å legge stilkene i 7% agarose viste seg å være rask og enkel (Figur 1). De to deler (A og B; figur 1) på den innebygde ampulle system gjør det enkelt for enkelt å frigi spindelen innleiret i agarose som agarose ikke holde seg til de ampulle deler som er inert, og holder systemet rent. Ampullene kan brukes om igjen flere ganger i årevis. Den bekvemmeligheten av å lagre den innebygde stammen gjør også de neste trinnene enklere. For å spare en gang, tilsvarende innebygde stammer kan grupperes (opptil 3) på en enkelt snitteplate for seksjonering.
Observasjon av Aromatiske stoffer under UV:
Endetappen seksjoner ble montert i destillert vann til de glassplater og observert under UV-lys. De aromatiske forbindelser, inkludert ligninet i cellene, kan bli visualisert ved deres autofluorescens under UV-lys. Xylem (XY) og interfascicular fibre (Fi)viste autofluorescens under UV-belysning, men ikke i marg (Pi), og cortex eller epidermis (EP) (figur 2), fordi lignin, en aromatisk polymer, er deponert under sekundær celle-vegg-biosyntese. I noen tilfeller, når plantene akkumulere betydelige mengder av aromater i sine vakuoler (f.eks Antocyanin), fluorescens kan observeres i kortikale celler (data ikke vist). Stem tverrsnitt ble analysert i henhold til 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (Fig. 2 Paneler A, B, C og D - E, henholdsvis) for bedre å visualisere celleveggen aromatisk fordeling på stammen.
Observasjon av Lignin i stammen Seksjoner farget med phloroglucinol og Maule Flekker:
Margen består av skip og fiber og interfascicular fibre var de eneste elementene av stammen som var farget av lignin flekker (phloroglucinol og Maule) Ved hjelp av en villtype-stammen seksjon prøven. Floroglucinol flekken reagerer med cinnamaldehyd endegrupper lignin for å gi en rosa farge eller fuchsia 4 (figur 3). Som observert under UV-belysning, en fuchsia farge observert i margen interfascicular fibre, men er fraværende i marg og cortex eller epidermis (figur 3). Stem tverrsnitt ble analysert i henhold til 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (Fig. 3 Paneler A, B, C og D - E, henholdsvis) for bedre å visualisere phloroglucinol flekkfordeling over stammen og differensiere de store vev; xylem og interfascicular fiber; marg og cortex; og epidermis. Vanligvis intensiteten av fargen samsvarer med nivået på lignification på en kvalitativ måte, - med unntak av når den analyseres mutant eller transgen blir unormalt anriket på cinnamaldehyd-avledede enheter (f.eks cad mutant) <sup> 14. Maule flekken er bestemt i å oppdage syringyl lignin enheter i margen interfascicular fibre. Rød farging indikerer nærvær av syringyl lignin-enheter i de lignin-elementer (figur 4) 18. Imidlertid er en lysere røde fargen observert i fibrene sammenliknet med Margen vev som antyder at fibrene inneholder et høyere nivå av S lignin mens Margen er mer anriket i G-enheter. Som observert etter phloroglucinol farging, er en rød farge observert i margen interfascicular fiber, men er fraværende i marg og cortex eller epidermis (figur 4). Det korrelerer også med lignin fordelingen observert under UV-(figur 2) og viser at syringyl enheter er tilstede i alle vev lignified av denne stammen prøven. Stem tverrsnitt ble analysert i henhold 5X, 10X, 20X, og 40X forstørrelse (Figur 2 Panels A, B, C, ogD - E, henholdsvis) for å bedre visualisere Maule flekkfordeling over stammen og skille de store vev: Xylem og interfascicular fibre, marg og cortex, og epidermis. Det er viktig å merke seg at mengden og fordelingen av syringyl enheter mellom lignified vev varierer med alder på spindelen, og kan være fraværende i et ungt stammen (data ikke vist).
Observasjon av Stem Seksjoner farget med Calcofluor Hvit og Kongo Røde Flekker:
Calcofluor hvite flekker cellulose, callose, og andre nonsubstituted eller svakt erstattet β-glukan; mens kongo røde flekker direkte til β-(1 → 4)-glukaner, og spesielt til cellulose. Stem seksjoner farget med calcofluor hvite ble observert under UV lys 6-9. Kongo rød-farget deler ble observert under blå-lys eksitasjon ved hjelp av et filter med en båndpass av 560/40. Både calcofluor hvit og congo rød farget epidermis, cortex og marg; ther det, fordi alle disse vev inneholder cellulose som store polysakkaridpolymer i deres cellevegger (figur 5 og figur 6, henholdsvis). I motsetning til calcofluor hvite, Kongo rød farget polysakkarider bedre i margen interfascicular fiber og virker mindre påvirket av tilstedeværelsen av lignin (Figur 5 og Figur 6) 10,11. Stem tverrsnitt ble analysert i henhold til 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (Paneler A, B, C og DE, henholdsvis i figurene 5 og 6) for bedre å visualisere calcofluor hvite og Congo rød flekk fordelinger på tvers av spindelen og den store vev (xylem og interfascicular fibre, marg og cortex, og epidermis).
Observasjon av Stem Seksjoner farget med toluidinblått O:
Toluidinblått O er klassifisert som et polykromatisk fargestoff, fordi det reagerer med forskjellige kjemiske komponenter av celler forskjellig og føreren flerfargede prøven (figur 7). Fargene som genereres kan gi informasjon med hensyn til arten av cellen og dens vegger. Toluidinblått O er et kationisk fargestoff som binder seg til negativt ladede grupper 5. En vandig oppløsning av dette fargestoff er blå, men forskjellige farger genereres når fargestoffet bindes med forskjellige anioniske grupper i cellen 6,9. For eksempel vil en rosa lilla farge vises når fargestoffet reagerer med karboksylerte polysakkarider slik som pektin-syre; grønn, grønnlig blå, eller lyse blå med poly-aromatiske stoffer som lignin og tanniner; og lilla eller grønnaktig blå med nukleinsyrer. Toluidinblått O stilk tverrsnitt avslørte at margen interfascicular fibre er lignified siden de viser en grønnaktig blå eller blå farge (Figur 7, Panel C), noe som er i overensstemmelse med UV og Ph-HCl flekker observasjoner (Tall 2 og 3). I kontrast, marg og cortex og epidermis vev viser grønnaktig blå eller blå farge fordi, selv om de ikke er lignifisert, inneholder de enkelte pektin polymerer i deres cellevegger. Stem tverrsnitt ble analysert i henhold til 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (Fig. 7 Paneler A, B, C og D - E, henholdsvis) for bedre å visualisere toluidin blå O flekkfordeling på tvers av spindelen, og for å differensiere de store vev .
. Figur 1 Hjemmelaget mold for innebygging stilkene På venstre side.; Toppen av 2 ml skrulokk mikrosentrifugerør (del A) og bunn fra 0,6 ml mikrosentrifuge-rør (del B). På den høyre side; den Parafilm som holder de to deler; A og B for å danne den endelige støpeformen.
Figur 2. UV fluorescens av A. thaliana stilk tverrsnitt. Tverr deler av en vill type A. thaliana stammen under UV-lys fluorescens som viser tilstedeværelse av aromatiske forbindelser, herunder lignin, bare i veggene i interfascicular fibre og Xylems celler (A - E). Posisjonene til epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (FI), marg (Pi), og xylem (XY) indikeres. Forstørrelser: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Panels D og E: 40X. Bar = 100 mikrometer.
Figur 3. Phloroglucinol-HCl farging av A. thaliana stilk tverrsnitt. Phloroglucinol-HCl flekker (rosa eller fuchsia farge) av en vill type A. thaliana stammen snitt som viser den normale lignin deponering i veggene av interfascicular fibre og Xylems celler (A - E). Posisjonene til epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (FI), marg (Pi), og xylem (XY) indikeres. Forstørrelser: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Panels D og E: 40X. Bar = 100 mikrometer.
Figur 4. Maule farging av A. thaliana stilk tverrsnitt. Maule flekker (rød farge) av en vill type A. thaliana </ Em> stem snitt som viser den normale lignin deponering i veggene av interfascicular fibre og Xylems celler (A - E). Posisjonene til epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (FI), marg (Pi), og xylem (XY) indikeres. Forstørrelser: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Panels D og E: 40X. Bar = 100 mikrometer.
Figur 5. Calcofluor hvit farging av A. thaliana stilk tverrsnitt. Calcofluor hvite flekker av en vill type A. thaliana stammen snitt som viser cellulose deponering i celleveggene av celler i overhuden, cortex, marg, interfascicular fibre, og Margen (A - E). Den posions av epidermis og cortex (Ep), er interfascicular fibre (FI), marg (Pi), og xylem (XY) indikert. Forstørrelser: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Panels D og E: 40X. Bar = 100 mikrometer.
Figur 6. Kongo røde farging av A. thaliana stammen tverrsnitt. Kongo røde flekker av en vill type A. thaliana stammen snitt som viser cellulose deponering i celleveggene av celler i overhuden, cortex, marg, interfascicular fibre, og Margen (A - E). Posisjonene til epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (FI), marg (Pi), og xylem (XY) indikeres. Forstørrelser: Panel A: 5X; Panel B Panel C: 20X; Panels D og E: 40X. Bar = 100 mikrometer.
Figur 7. Toluidinblått O farging av A. thaliana stilk tverrsnitt. Toluidine blå O farging av en vill type A. thaliana stammen snitt som viser den normale lignin deponering i veggene av interfascicular fibre og Xylems celler (A - E). Posisjonene til epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (FI), marg (Pi), og xylem (XY) indikeres. Forstørrelser: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Panels D og E: 40X. Bar = 100 mikrometer.
Tabell 1. Mikroskop og kamerainnstillinger for bildebehandling. Retningslinjer for arbeid med fluorescencefilter og lyse-feltet bildebehandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A. thaliana stilk seksjoner er mye brukt til å studere organiseringen av cellene i sekundærcelleveggen, og for å kvalitativt undersøke forskjeller mellom villtype-og transgene planter. De mest brukte teknikker for seksjonering prøvene er direkte hånd cutting; eller når prøvene er innebygd i agarose eller fiksativ, seksjonering kan gjøres med en vibratome eller mikrotomen. I motsetning til håndskjæring, de to siste gjør det mulig å redusere risikoen for å produsere unøyaktige forskjeller mellom prøver som ville bli ganske enkelt på grunn av en dårlig prøvepreparering forårsaket av tykkelsesforskjeller mellom prøvene og ujevne overflater. Alle disse metodene har sine fordeler og ulemper. Vi valgte å bygge inn i agarose, etterfulgt av seksjonering ved hjelp av en vibratome, og gjorde det av følgende grunner: Det er utrolig lett for å bygge og tid i å bruke agarose eliminerer behovet for omfattende behandling av frisk vev. Også, våre hjemmelagde muggsopp er enkelt og billig å lage, kan holde the stammen rett, kan brukes over mange år, og kan hjelpe i lett frigjøring av prøver uten å gjøre et rot. Den beste måten å oppløse høyprosentig agarose og få en homogen oppløsning (full oppløsning av 7 g agarose i 100 ml uten at det dannes tykk granuler) er å autoklavere den eller microondas det på det laveste intensitet. Det er viktig å kutte stammen vev frisk, eller alternativt for å lagre det i en plate plassert på is inneholdende et filterpapir fuktet med vann for å forhindre vev dehydrering og deformasjon. Lagring av stammen for perioder lengre enn 30 min uten høy fuktighet vil føre til at stammen til å tørke ut. Temperaturen på agarose rett før stammen er innleiret bør være rundt 50 ° C. Det er viktig å se etter tilstedeværelsen av luftbobler etter at agarose ble helt inn i beholderen, fordi luftbobler forårsake hull i støpeformen, og dermed snitte vil være ujevn. Luftbobler kan fjernes hurtig ved å plassere oppløsningen under vakuum før hellingden. Stammen skal plasseres i agarose mens den ennå er myk og ikke er varmere enn 50 ° C. Varmen vil ødelegge prøven ved shriveling stammen og vil ødelegge cellens morfologi. Dersom agarose er for kald stammen vil ikke trenge gjennom agarose, og innstøping vil ikke være mulig. Etter agarose innebygging, kan stem prøvene lagres ved 4 ° C opp til en uke.
Bruk av en vibratome stedet for hånd seksjonering rentene presist kutt prøver og bedre bildekvalitet. Alle sikkerhetsinstruksjoner bør leses nøye og følges mens du bruker en vibratome. Det er viktig å sikre at prøveplaten er ren og tørr å tillate vevet lim for å holde prøven sterkt på plass så den ikke faller av under seksjonering. Tykkelsen av prøvestykkene er angitt for å motstå det tøffe syre-og basebehandlinger under fargingsprosedyrer. Den barberblad som brukes i vibratome bør være helt flat for å sikre at delen blir kuttet evlens. Seksjonering tar ca 20 min per prøve; for å spare tid, kan lignende prøver seksjoneres i grupper på et enkelt eksemplar plate. Ved seksjonering, blir seksjonene overføres fra buffermagasinet i en liten petriskål for å gjøre delene lettere å se på en klar bakgrunn, og for å frigjøre buffermagasinet for de neste prøven. Seksjoner kan umiddelbart anvendes for nedstrøms fargingsprosedyrer eller lagres for senere bruk. Aliquoting stammen deler til 2,0 ml mikrosentrifugerør hjelper i grunning for farvningsprosedyrer. Å gjøre riktige justeringer og innstillinger på kameraet og mikroskopet er svært kritisk for å oppnå bilder av høy kvalitet. Justering av Kohler belysningen er en av de viktigste trinn i bruken av mikroskopet. Justeringene for blenderåpning og lysintensitet, som beskrevet i metode delen, er ment kun som en retningslinje. De kan trenge å bli endret avhengig av mikroskop og kameraet benyttes. Vi brukte en høyoppløseligdigitalkamera med et stort format interline CCD-brikken og ingen mekanisk lukker for UV bildebehandling, calcofluor hvit, og congo rød flekker; og en høy oppløsning og høy hastighet fargekamera for lys-feltet bilder av Maule, phloroglucinol og toluidinblått O farging. Bilder ble analysert, bearbeidet og satt sammen ved hjelp av standard bildebehandlingsprogrammer.
Phloroglucinol er den mest brukte flekken for lignin besluttsomhet; det er ikke en ekte lignin flekk som det flekker bare Cinnamaldehyde slutt grupper. Den phloroglucinol flekken, også kjent som Weisner flekken, gir en karakteristisk kirsebær rosa eller fuchsia farge i margen interfascicular fibre hvor disse aldehyd grupper er til stede fire. Intensiteten av den rosa farge varierer med graden av lignification. Selv små forskjeller er vanskeligere å observere, er det lett å få øye på forskjellene mellom villtype og mutant stilk seksjoner som har variasjoner i sin lignininnhold 19. Det er også EASy å observere forskjeller mellom yngre (mot stammen apex) og eldre (stilk base) vev, fordi lignification nivåer mellom slike vev varierer. Vanligvis i villtype stem, gjør epidermis cortex og marg ikke inneholde cinnamaldehydes (og dermed ikke blir farget) med mindre det er svangerskap utenfor livmoren lignification 20. Maule flekk, på den annen side, er spesifikk mot syringyl lignin-enheter, og kan brukes til å skille ulike ligninprodukter anrikninger i S-eller G-enheter (for eksempel fiber versus Xylems vev) 14,18. Den kaliumpermanganat og saltsyre virker på syringyl kjernen av S-enhet i ligninet for å danne en methoxycatechol og deretter å metoksy-o-kinon etterfølgende reaksjon med ammonium-hydroksyd. Maule flekken er en god indikator for å differensiere mutanter som mangler eller er i utstrakt utarmet i S-enheter av lignin (f.eks i A. thaliana f5h mutanter og generelle gymnosperm planter), gir Maule gul-brun farge instead av rødt i både Margen og sclerenchyma 21. Av samme grunn kan Maule flekker brukes til å skille angiosperms, som først og fremst inneholder S lignin fra gymnosperms som vanligvis mangler S enheten 18. Fordi sterke syre og base blir brukt under floroglucinol og Maule fargingsfremgangsmåter henholdsvis noen eksperimentelle trinn må utføres med forsiktighet. Både konsentrert HCl og ammonium hydroksid er sterke korrosjonsmidler; de kan svekke mikroskopet scenen og objektiv hvis lysbildene inneholder Ph-HCl og Maule farget prøvene ikke håndteres riktig. De kan også tørke raskt, i løpet av 5-10 min, forårsaker prøver å svekkes, slik at den avbildning som skal gjøres hurtig. Toluidinblått O er en polykromatisk flekken og flekker forskjellige komponenter av celleveggen i forskjellige farger som det reagerer med forskjellige kjemiske komponenter i celleveggene på en annen måte, som produserer en flerfargede mønster. Fargene som genereres kan innsamlingsløse informasjon om innholdet i cellen. Toluidinblått O er også et kationisk fargestoff som binder seg til negativt ladede grupper 5,6. En vandig oppløsning av dette fargestoff er blå, men forskjellige farger genereres når fargestoffet bindes med forskjellige anioniske grupper i cellen. For eksempel, fargene er en rosa lilla når fargestoffet reagerer med karboksylerte polysakkarider som pektin; grønn, grønnlig blå, eller lyse blå med aromatiske stoffer som lignin og tanniner; og lilla eller grønnaktig blå med nukleinsyrer. Fargingen er enkelt og kan vare i to dager.
Calcofluor hvite flekker cellulose, callose, og andre nonsubstituted eller svakt erstattet β-glukan 6-9, og Kongo røde flekker direkte til β-(1 → 4)-glukaner og spesielt til cellulose 8,10,11. Calcofluor hvite flekker briljant epidermis, cortex, og marg, men at glans er betydelig redusert i margen interfascicular fibre. Det er to possible forklaringer på redusert fluorescens av calcofluor hvit i tungt lignified vev; man tilskriver det til tilstedeværelsen av lignin, noe som vil i sin tur redusere muligheten for calcofluor hvitt å diffundere godt gjennom de polysakkarider. Noen andre forklaring peker mot en delvis slukke av fluorescens slippes ut av calcofluor hvit spent under UV. I motsetning til calcofluor hvitt, Congo rød farging synes å være mindre påvirket av tilstedeværelsen av lignin. Det kan være relatert til forskjellen i fluorescens egenskaper mellom calcofluor hvit og congo rød; en bedre spredning evne Kongo rød gjennom lignified vev enn calcofluor hvit; eller en liten forskjell i polysakkarid bindende egenskaper 22. Det er viktig å merke seg at de delene farget med Kongo rødt ikke bør lagres for lenge før avbildning, fordi Congo rødt har en tendens til å bli vasket bort i vann.
Selv histochemical farging er verken kvantitativheller ikke helt avgjørende, kan det avsløre gjennom visuelle signaler et vell av informasjon om viktige egenskaper som integritet vev eller unormal celleveggen deponering og lignification. De fargeteknikker som er beskrevet ovenfor er lette å utføre, og er anvendelig for kritiske elementer i en plantecellevegg, slik som lignin og cellulose. Som kontrast er immunfluorescens ved å bruke spesifikke antisera og monoklonale antistoffer som er nødvendig for påvisning av forskjellige komponenter av hemicelluloser og pektin. Denne rapporten er ment å fungere som en primer for nybegynnere innen sekundær celleveggen flekker som bruker A. thaliana som sin modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Sabin Russell for redigering assistanse. Dette arbeidet var en del av DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) støttet av US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research, gjennom kontrakt DE-AC02-05CH11231 mellom Lawrence Berkeley National Laboratory og US Department of Energy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W.
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
- Adler, E.
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S.
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
